真核细胞表达系统之欧阳术创编

1、欧阳术创编2021.02.02欧阳美创编2021.02.02自上世纪70年代基因工程技术诞生 以来，基因表达技术已渗谨到生命科 学研究的各个领域。并师着人类基因 组廿划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人 瞩目的成就。随着人类基因组廿划的rzvrzvrzv完成，越来越多的基因被发现，其中 多数基因功能不明。利用表达系统在 哺乳动物细胞内表达目的基因是研 究基因功能及其相互作用的重要手段。创作：欧阳术时间：2021.02.02在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，a 也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已 克隆人目的基因DNA片段的载体（一

2、般为质粒）转化细菌（通常选 用的是大肠杆菌），通11IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋 白。其优直在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需 的成本相对比较低廉。但与此同时原核表这系统还存在许多难以 克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表这时间及表达水平 进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作 用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涌体形式表 it,导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后抽工修饰体系 不完善,表达产物的生物活性较低。为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引人真核基因调 控领硕，其优点是： 根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的髙度特异性设计，

3、而靶 DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特 异性激活或抑制； 能诱导基因髙效表达，可it 105倍，为其他系统所不及； 能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关r述可 人为地调控基因表达量。因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前， 基因工程研究中常用的真核表达系统有醉母表达系统、昆虫细胞 表达系统和哺乳动物细胞表达系筑。1、醉母表达系统最早应用于基因工程的酔母是配酒醉母，后来人们Q相继开发了 裂殖酔骨、克鲁维酸醉骨、甲醇醉母等，其中，甲醇醉骨表达系 统是目前应用最广泛的醉母表达系统。目前甲醇醉母主要有H Polymorpha, Candida Bo

4、dini, Pichia Pastris3 种。以 Pichia Pastoris 应用最多。甲醇醉母的表达教体为整合型质粒，教体中含有与醉母染色体中 同淵的序列，因而比较容易整合人醉母染色体中。大部分甲醇醉 母的表达载体中部含有甲醇醉母醇氧化爾基因一 l(A0xl),在该 基因的启动子(PAXOI)作用下,外源基因得以表迭。PAXOI是一 个强启动子，在以葡萄糖或甘油为碳源时。甲醇醉母中AOxl基 因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时PAXOI可被诱导 激活，因而外湄基因可在其控制下表达，将目的基因多拷贝整合 入卵染色体后可以提高外源蛋白的表达水平及产量。此外甲醇 醉母的表达载体都为E.

5、coli / Pichia Pastoris的穿梭载体,其中含 有E.coli复制起点和筛选标志，可在获得克隆后采用E.coli细胞 大量扩增目前，将质粒議体转人醉母菌的方法壬要有原生质ft 转化法、电击法及氯化挪法等。甲般先在含甘油的培养 基中生长。培养至高浓度。再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。 这样可以大大提高表迖产量。利用甲BBS表达外渦性蛋白质其 产量往往可达克级。与服酒醉母相比其翻译后的加工更接近哺乳 动物细胞，不会发生超糖基化。利用PAXOI表达外源蛋白时,一般需很长时间才能达到峰值水 平，而甲醇是高毒性、高危险性化工产品。使彳导实验操作过程中 存在不小的危害性。且不宜于食品等蛋

6、白生产。因此那些不需要 甲醇诱导的启动子受到青睞包括gap、FLD1、PEX8、YPTI等 多种。利用三磷酸甘油矗肮氢i(GAP)启动子代替PAXOI,不需 要甲醇诱导。培养过程中无需更换碳源，操作更为简便，可缩短 外源蛋白到达峰值水平的时间。醉母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统，由于兼具原核 以及真核表达系统的优点，正在基因工程领域中得到日益广泛的 应用。2、昆虫细胞表达系统杆狀病毒表达系统是目前应用最广的昆虫细胞表达系统，该系统 通常采用目宿银奴夜賊杆狀病毒(AcNPV)作为表达载体。在 AcNPV感染昆虫细胞的后期，核多角体基因可编码产生多角体 蛋白，该蛋白包裹病毒颗粒可形成包洒f

7、t。核多角体基因启动子 具有极强的启动蛋白表达能力，故常被用来构建杆状病毒传递质 粒。克隆入外湄基因的传递质粒与野生型AcNPV共转染昆虫细 胞后可发生同源重组，重组后多角体基因被破坏，因而在感染细 胞中不能形成包涌体,利用这一特点可挑选出含重组杆状病毒的 昆虫细胞但效率比较低，且裁It构建时间长，一般需要46周。 此外，昆虫细胞不能表达带有完整N联聚糖的真核糖蛋白。在病毒感染晚期，由于大量外源蛋白的表达引起昆虫细胞的裂 解，胞质内的物质释放出来，与目的蛋白混在一起，从而使蛋白 的纯化工作变得很困难，另外水解酶的释赦会降解重组蛋白。为 了克服以上这些困难，科学工作者先后尝试用丝賊肌动蛋白基因

8、启动子或杆状病毒iel基因启动子表达外源蛋白，但效果都不明 显。Fare 1等介绍了一种新型的鳞趣目昆虫细胞表这系统，该系 统主要包括3个调节外源蛋白表达序列：(1 ) Bombyx mori的肌动蛋白基因启动子；(2 ) Bombyx mori的核型多角体病毒(BmNPV)的立早基因 (编码t IE-1蛋白，该蛋白是种转录激活因子，可在体外激活 肌动蛋白基因启动子);(3 ) BmNPV的同源重复序列3(HR3)可作为皿动蛋白基因启动 子的增强子。三者协同作用，可使转录活性提高1000倍以上，从而大大地提 髙外源蛋白的表达水平。另外目前还有一种新型的宿壬范围广的 杂合核多角体病毒(HyNPV

9、)被应用于昆虫细胞表达系统的构建， 该病毒由AcNPV M BnfqP发展而来。一般情况下杆狀病毒表达系统所能表达的外源蛋白只有少部分 是分泌性的，大部分为非分泌性。为了解决这个问题将Hsp70(热 休克蛋白70)与外源蛋白共表达可明显提高重组蛋白的分泌水 平，这是因为分泌性多肽被翻译后必须到达内质网进行加工才能 被分泌至胞外。如果到达内质网前，前体多跌就伸展开来，暴霧 岀疏水残基，歿基间的相互作用可引起多肽的凝聚，这对最终的 表达水平有很大鄭响。而Hsp70是一种分子伴侣，能嚴与新翻译 的多肽结合，抑制前体肽的凝聚使前ft肽顺利到达内质网进行加 I,从而提高蛋白的分泌水平。最近，人们艮构建了

10、杆状病毒S2表达系统，该系统能将重组杆 状病毒转染果蝇S2细胞，以前人们认为杆状病毒仅能在鳞翅目 昆虫细胞（如sf9、sf21）中复制,不能在其他昆虫细胞（如果蝇细 胞）中复制，然而目前研究表明在一定条件下，杆狀病毒也能感 染果蝇细胞。在果蠅细胞中，杆狀病毒的名角II基因启动子几乎 不发生作用。杆狀病毒S2表达系统的表达载体利用的是果蝇启 动子如Hsp70启动子、肌动蛋白5C启动子、金属硫蛋白基因启 动子等，其中，Hsp70启动子的作用最强。重组杆状病毒感染S2 细胞后不会引起宿壬细胞的裂解，且蛋白表达水平与鳞翅目细胞 相做,因此，杆状病毒S2系境是一个很有应用前景的昆虫细胞 表达系统。昆虫细

11、胞表达系统，特别是杆狀病毒表达系统由于其 操作安全，表达量高，目前与酔母表达系统一样被广泛应用干基 因工程的各个领域中。3、哺乳动物细胞表达系统由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方 面远胜于原核表达系统及醉母、昆虫细胞等真核表达系统，更接 近于天然蛋白辰哺乳动物细胞表达斛包含原核序列、启动子、 增强子、选择标记基因、终止子和多聚核昔酸信号等。将外源基因导入哺乳动物细胞主要通过2类方法：一是感染性病 毒颗粒感染宿主细胞，二是通过脂质It法、显微注射法、磷酸钙 共沉淀法及DEAE 葡聚糖法等非病毒裁体的方式将基因导入 到细胞中。外源基因的体外表达一般采用质粒表达载ft,如将重

12、组质粒导人CHO细胞可建立高效稳定的表达系统，而利用COS 细胞可建立瞬时表达系统。目前，病毒载体已成为动物ft内表达 外淵基因的有力工具，在临床基因治疗的探索中也发挥了重要作 用。痘苗病毒由于其基因的分子量相当大（约187kb）,利用它作 为敎体可同时捕人几种外源基因，从而构建多价疫苗。另外，逆 转录病毒感染效率高，某些难转染的细胞系也可通过其导人外瀰 基S, ffl要注意的是逆转录病毒可整合人宿主细胞染色体，具有 潜在的危险性。由于腺病毒易于培养、纯化，宿主范围广，故采用该类病毒构建 的载体被广泛应用腺病毒裁体的构建依戦于腺病毒穿梭质粒和 包装载体之间的同源重组。但是哺乳动物细胞内的这种同

13、源重组 效率很低，利用细菌内同源重组法构建重组体效率会大大提髙， 即将外源基因捕人到腺病毒穿梭质粒中，形成转移质粒,将其线 性化后与腺病毒色装质粒共转化大肠埃希菌。另一种方法是通过 CrelaxP系统构建重组腺病毒载体，在转移质粒和內装质粒中都 捕人laxP位点，然后将两个质粒共转染表iiCre重组1的哺乳动 物细胞，通11 Cre介导两个laxP位点之间的DNA发生重组,可 获得重组腺病毒，这种重组效率比一般的细胞内同源效率髙30 倍。最近，人们在杆状病毒中捕人巨细胞病毒的启动子建立了高 效的基因转移载体。由于杆狀病毒是昆虫病毒，在哺乳动物细胞 中不会引起病毒基因的表达，而且敎体的构建容易，

14、因而和用杆 状病毒进行基因转移为我们提供了很好的途径。科用哺乳动物细胞表达外源基因时，大多数情况下不需要诱导, 但当表达产物对细胞有毒性时应采取诱导，这样可避免表达产物 产生早期就对细胞产生敷咆。哺乳动物细胞中用到的诱导型教It 主要与启动子有关如热休克蛋白启动子可在高温下被诱导，还有 重金属、糖皮质激素诱导的启动子。但这些系统存在一些共同的 缺陷，如诱导表达特异性差；肖系统处于关同狀态时表达有泄漏 诱导剂本身有毒性，常对细胞造成损伤等。为此，Gosse n等构建了受四环素负调节的Teton基因表达系统, 该系统由调节质粒和反应质粒组成。调节质粒中具有编码转录激 活因子(flA)的序列，在没有

15、四环素或强力毒素存在的情况下tTA 可引起下游目的基因表达。Iffi后Gosse n等Q对(TA的氨基酸序 列进行了改造，构建了受四坏素正调节W Tet-on基因表达系统， 该系统在没有EI环素的情况下启动子不被激活，而在加人EI环素 或强力毒素后目的基因高效表达。EI环素诱导的基因表达系统是 目前应用最广泛的哺乳动物细胞诱导表达系统，该系统具有严 密、髙效可控制性强的优点。外源蛋白的表达会对哺乳动物细胞产生不利影响,13此利用哺乳 动物细胞表达外源基因时，一个主要冋題便是外源基因不能持久 稳定地表达o Mielke等构建了-种能够在哺乳动物中稳定表达异 二聚体蛋白的载体系统，在这个系统中，编

16、码抗体重链和轻链的 cDNA及瞟唱霉素抗性基因被转录成三I®反子mRNAo内部的顺 反子通过内核糖体进入位点(IREs)介导进行翻译,通过持续选择 压力，无需繁锁的筛选过程，便可获得持久、稳定表达抗体分子 的重组体。哺乳动物细胞表达系统常用的宿主细胞有CHO、COS、BHK、 SP2/0、NIH3T3等，不同的宿主细胞对蛋白表达水平和蛋白质 的糖基化有不同的畝响，因此在选择宿主细胞时应根据具体情况 石宀闻疋。利用基因工程技术表达外淵蛋白。其产量还不髙,难以满足大规 模的实师应用。通过转基因动物或转基因植物技术可从动物的乳 汁或植物的叶组级中很方便地获得大量较纯的生物活性物质，但 目前

17、这项技术还不很成熟,有待进一步研究。4、结培目前已经建立了多种诱导表达系统，但它们都有其优点和不足, 这就需要我们根据自己的要求选用适当的表达系统。一般来说， 一个理想的可诱导表达系统需要符合下述几个方面的要求。 特异性：该系统不受其他内源因素的影响，仅能被外源的非毒 性药物所活化。 非干扰性：该系统成分不能对细胞通路有干扰。 可诱导性:该系统在非活化状态下本底活性最低，而在活化状 态下能快速产生高水平的基因表达。 诱导剂的生物利用率：调节分子能快速渗透人各组级，能通过 胎盘屏障屏障。 可逆性：诱导剂能快速被各组级清除使该系统很快恢复非活化 剂量依颇性：该系统的反应与诱导剂的浓度成正比，以便进

18、行 定性定量分析。总之，各种表达系统各有其优缺点，醉母和昆虫细胞表达系统蛋 白表达水平高，生产成本低，但它们的加工修饰体系与哺乳动物 细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白 质，但其表这量低、操作繁琐。各种表达系统由于翻译后的抽工 不完全相同，因而产生的重组蛋白的生物学活性和免疫原性有时 会有差别。Van der Geld等利用不同的表迭系筑表达了蛋白激H (PR30),并对它们的抗原牲进行了比较,结果发现，在哺乳动物 细胞中表达的PR3具有与抗PR3抗体结合的所有表位，在昆虫 细胞中表达的PR3具有大部分表位，而在甲醇酔母中表达的PR3 只具有少数几f表位。因此，选择表达系

19、统时，必须充分考虑各 种因素，如所需表达的蛋白质性质、实验条件、生产成本、表达 水平、安全性等，权衡科弊后再选择相应的表达系统。师着人类基因组廿则的完成，趟来越多的基因被发现，其中多数基 因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研 究基因功能及其相互作用的重要手段，但由于通常使用的表达系 统无法对表达时间及表达水平进行调控,有些基因的持续表达可 能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，因 此，组成型表达系统的应用受到一定限制。转基因技术的发展使 我们可以在体内更有效地研究基因的功能，由于大部分基因在体 内部是在特定组级或特定发育阶段表达的，要想有效研究这些特 定基

20、因的作用，就需要在特定的时间以适当的表这水平实现目的 基因的表达。诱导表达系统可以在时空上控制目的基因的表达，这对认识基因 在生长发育、生理活动及其病理过程中的作用具有重要意义。较 早的诱导表达系统通常采用哺乳动物本身的基因表达调控元件, 虽然用诱导剂可以控制目的基因的表达，但由于诱导剂在细胞内 还控制其他的靶基因，这可能会严重干扰对目的基因的研究，产生 假阳性或假阴性实验结果。为了解决这一问题,一些生物学家利 用非哺乳动物的基因表达调控元件或不再对咆应内源诱导剂的 突变型内源表达调控元件建立了一些可诱导表达系统。目前比较 成裁的诱导表达系统主要有4种:四环素诱导表达系统，起皮激素 (ecdy

21、sone)诱导表达系统，他克莫司(tacrolimus,FK506)/雷M霉素 (rapamycin) 导系统和RU486诱导系统。1、四环素诱导系统四环素诱导系筑(tetracycline inducible system)是由 Gossen 及 Bujard首先建立的，该系统采用细菌的四坏素抗性操纵子，因为它 完全是来源于原核细胞,因此有较好的特异性。此系统的作用依 赖于四环素调控的反式作用因子(tTA/HTA)和反貳作用因子依戦 的启动子两个成分。四坏素反式激活蛋白QTA)是一个包含大肠杆 菌TN10四坏素耐药操纵子阻遏物和单纯疱疹病毒pl6蛋白 (VP16)C端部分的融合蛋白,tTA依

22、颇启动子由融合有RNA聚合 M II启动子的四环素操纵子(©O)基因序列构成，这种融合使真核 细胞中的©阻遏物成为很强的翻译激活物。在缺之四坏素及其 行生物的条件下tTA与O序列结合，使tTA依赖启动子的转录 过程被激活;而在存在四环素及其何生物的条件下,tTA无法与其 靶位点相互作用,转录也就无法进行;血系统中tTA的作用称为 tet-OFFo后来Gos-sen等只构建了反式tTA(rtTA),它是一种突变 形式的tTA,包含突变形式的蛋白R。与tTA作用相反，这种rt-TA 只有在El坏素及其衍生物的作用下才能与DNA结合并激活转 录。如果没有药物剌激，就不表达目的基因

23、,因此rt-TA的作用称 tet-ONo这两种蛋白在组级培养、果蝇及转基因小鼠中部被证明 能有效调控外源基因的表达。Parrado等成功的应用tet-OFF系统 证实PLZF(早幼粒细胞白U1病锌指)基因在淋巴细胞中表达具有 抗凋亡作用。Rhoades等应用El环素可诱导系统成功建立了转基 因小鼠模型,为研究AML1-ETO在白Ifil病发生中的作用奠定了坚 实的基础。EI坏素诱导系统在细胞水平和转基因动物中被广泛用来研究基 因的I力能，但它有一个显著的缺点，即只有筛选大量的克隆或动物 才能得到有较低表达背景而目的基因能显著激活的理想克隆或 转基因品系。解决这一问题的一个策略是把此系统的各元件

24、构建 到同一个敎体上，这样只需一次转染就可以使基因的转录得到调 控。逆转录病毒把基因转移到细胞内的能力比质粒转染有效得 多,Bohl等7就通过使用简化的逆转录病毒载体取得了理想的结 果。针对HTA有本底表达的缺陷Q产生了几种改进的系统。tTR是一 种改进的tetO 抑制物，当它与rtTAft同表这时，若无El环素及其 衍生物就与tetO结合从而抑制rtTA的本底表达,而在四坏素等的 作用下,tTR不能与DNA结合而由rtTA占据tetO位点,因此目的 基因的表达被高效激活。2、蛇皮激素诱导表达系统蛇皮激素诱导表达系统是基于昆虫蜕皮激素通过蛇皮激素受体 激活基因表达的能力而设廿的。该系统使用蛇皮

25、激素受ft与果蠅 超螺旋蛋白(ultraspiracleprotein,USP)的异1二聚体，加入就皮激 素或合成的类做物幕黎笛IB A(muristeroneA)后，起皮激素与 其受体结合，蜕皮激素受体就与USP发生相互作用，进而与DNA 上的反应元件结合,最终启动下游目的基因的转录。由于哺乳动 物细胞对蛇皮激素(或幕黎笛酮A)没有反应性，也不含蜕皮激素 受II,所以本底转录水平非常低。这种诱导系统在幕黎笛酮A作 用下可得到10015 0倍的高表达。后来Q发展为一种改进的蜕 皮激素系统，这一系统把起皮激素受体突变血含依托泊昔(VP16) 的反式激活结构城与USP的哺乳动物类做物类视黄0? X

26、(RXR)融合在一起。由于蛇皮激素受体的DNA结合位点也可以 被人类受体(类法尼醇X受体)识别,上述系统改变了 DNA结合位 点的序列,使它只能被突变的蜕皮激素受体识别，这就避免了内在 激素的敷响，极大地降低了本底表达,在培养的细胞系中甚至可需 到比本底髙10000倍的诱导水平。在小展腹膜内注射幕黎笛酮 A16h后，也检測到基因得到相当高水平的表达。幕黎笛酮A没有 毒性也没有致畸性,而且和起皮激素一样可在注射后20h以内完 全排泄，因此这一系统是进行转基因动物实验的一个理想工具，在 基因治疗方面也很有前景。若在这一系统上用一个组级特异的启 动子代替CMV启动子，就可使目的基因只能在特定的组级或

27、细 胞中诱导表这，这对在转基因动物的特定组级中研究靶基因的功 能非常有用。Xiao等就用骨骼肌的山朋动蛋白启动子代替了 CMV启动子，他们用改造的可诱导系统建立稳定细胞株,研究发 现在分化成熟的朋细胞中可诱导报导基因的表达，而在未分化的 肌细胞中呱没有表达o Stolarov等13通过蛇皮激素可诱导系统 证实PTEN可抑制PI3K通路，从而阐明了 PTEN抑制肿瘤的机制。 3、他克莫司(FK506)/雷射霉素(rapamycin)诱导系统 环砲素A受体和亲免素(FKBP12-rapamycin相关蛋白,FRAP)蛋白 家族以及他克莫司(tacrolimus,FK506)-结合蛋白(FKBPs)

28、都含有 化学结合结构更此结构能与DNA结合结构域和反式激活结构城 相融合。而免疫抑制剂FK506、雷M霉素和环砲素A(CsA)等小 分子化学诱导物可以诱导这些嵌合转录因子的二聚化，从而强烈 剌激报告基因的表达。因此在不影响正常细胞生理过程的情况下, 就可以通过诱导二聚休的小分子药物的浓度以剂量应答的方式 调控靶基因的表达水平。为了能用于基因治疗,2对迪一系统进行了一系列人淵化的改进, 如转录激活因子的非人滌部分用一般认为无免疫性的成分取 代,GAL4部分则由嵌合的DNA结合结构域ZFHD替代,VP16激 活结构域可以用NF-kBp65的激活结构域代替，最后亲环蛋白由 FKBP12-雷朋霉素结合

29、结构M(FRB)取代，而不用人源的FKBP12- 雷射霉素结合蛋白激|(FRAP)oFRB-FKBP12的异澹二聚体可以 被雷M霉素(比FKCsA更有效)高效诱导，从而形成有功能的完整 转录因子，最终启动转录。这一系统在体外和ft内实验中背景表 达部比较低,而在雷M霉素的剌激下有高水平的表达。雷朋霉素 可以与FRAP激繭结合，而FRAP可以介导免疫抑制效应,因此密 M霉素有一定的增殖和免疫抑制活性，迪成为该系统应用的一个 潜在限制。这一问题通过选用雷M霉素的类做物得到了解决，此 类做物与野生型FRAP激臨的结合能力较差，因此不会产生免疫 抑制,在体外实验中也发现此类做物也不抑制细胞的增殖。最近，利用雷射霉素诱导的人温化系统 (rapamycin-in-duciblehumanizedsystem,RIHS),通过腺相关病毒 (adeno-associatedvirus,AAV)转染小鼠和非人灵长类动物来表达 風红细胞生成素，实验表明可以通过控制雷朋霉素的剂量调控体 内转基因的表达。4、RU486诱导系统这一系统采用截短的黄体酮受休的突变体，这种突变体不能和黄 体酮或其他内源类固醇激素结合，但却能被黄体酮的拮抗剂 RU486激活。迪种突变的类固醇结合结构域融合到酔骨 GAL4DNA结合结构域和疱疹病毒VP16激活结构域上后(这种复 合物称