usp39阿齐霉素及其检验法重点讲义

1、 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页1USP 39阿奇霉素阿奇霉素Azithromycin C38H72N2O12 xH2O （无水物） 749.00 83905-01-5(2R, 3S, 4R, 5R, 8R, 10R, 11R, 12R, 13S, 14R)-13- (2, 6-二脱氧-3-C-甲基-3-O-甲基-L-核-己吡喃糖基)氧 -2-乙基-3, 4, 10-三羟基-3, 5, 6, 8, 10, 12, 14-七甲基-11- 3, 4, 6-三脱氧-3-(二甲氨基)-D-木-己吡喃糖基 氧-1-氧杂-6-氮杂环十五烷-15-酮。 9-氧代-9a-氮杂-9a-甲基-

2、9a-高红霉素 A 一水合物 767.02 121479-24-4 二水合物 785.02 117772-70-0定义定义阿奇霉素含一分子或两分子的水。按无水物计算，每 mg 阿奇霉素中C38H72N2O12的含量应为 945g1030g。USP 参比对照品参比对照品阿奇霉素 USP 参比对照品；（USP Azithromycin RS）氮杂红霉素 A USP 参比对照品；(USP Azaerythtomycin A RS)阿奇霉素 USP 鉴别对照品；(USP Azithromycin Identity RS)德糖胺阿奇霉素 USP 参比对照品（USP Desosaminylazithrom

3、ycin RS）N-去甲基阿奇霉素 USP 参比对照品（USP N-Demethylazithromycin RS） 阿奇霉素杂质 F USP 参比对照品 （USP Azithromycin Related Compound F 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页2RS）【鉴别鉴别】A：红外吸收 。（如果样品的红外谱图与标准谱图不同时，用相同体积的甲醇溶解等量的样品和对照品，在真空条件下，水浴加热至 80 ，持续 30 分钟，挥干溶剂。用残渣再做检测。 ）B：在含量测定项下记录的色谱图中，供试样品溶液中阿奇霉素峰的保留时间应与对照品溶液中阿奇霉素峰的保留时间一致。比旋度比旋度

4、：-45 -49 ，温度 20。 测试溶液：20mg/ml, 无水乙醇溶液。结晶性结晶性 ：应符合要求。（当为无定形时, 大多数微粒不存在双折射和消光位置。 ）pH 值值 ： 9.011.0。样品储备溶液：4mg/ml 的甲醇溶液；样品溶液：用水将样品储备溶液（体积比：1:1）稀释成 2mg/ml 的溶液。水分，水分，方法1 ：当标为无结晶水时不得大于 2.0%；二水合物，水分在 4.0% 5.0%之间；一水合物在 1.8% 4.0% 之间 ，当干燥失重测定符合要求时，水分可以在4.0% 6.5% 。 干燥失重干燥失重 （当标签标示为一水合物，且水分含量在 4.06.5范围内时，进行此项测定。

5、 ）热分析 ： 注：用于检测的量可依据仪器的灵敏度进行适当的调整。 精确称量 10mg 阿奇霉素，在一适宜的校准仪器中，用“热解重量分析法”测定挥发性物质的含量。在 35ml/min 恒定速率氮气氛中，将样品以 10/min 的速率从环境温度加热到 150。在“差示热分析图”中，标示出干燥失重的导数（每分钟失重的百分数） ；计算 70、130处的转折拐点：从环境温度到 70，失重不多于 4.5；70拐点到 130拐点，失重量在1.82.6。含量含量 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页3溶液 A：10M 氢氧化钾溶液溶液 B：将 6.7g/l 磷酸氢二钾溶液用溶液 A 调节 pH

6、 至 11.0。溶液 C：将 6.7g/l 磷酸氢二钾溶液用磷酸调节 pH 至 11.0。流动相：乙腈：溶液 B（60:40）稀释液：乙腈：溶液 C（60:40）系统适应性溶液：阿奇霉素 USP RS、氮杂红霉素 A USP RS 分别按下法制备 0.5mg/ml 的溶液。先将阿奇霉素 USP RS 和氮杂红霉素 A USP RS 溶解于乙腈中，取 5%的最终溶液，用稀释液定容。对照品溶液：阿奇霉素 USP RS 按下法制备 0.53mg/ml 的溶液。先将阿奇霉素 USP RS 溶解于乙腈中，取 2%的最终溶液，用稀释液定容。样品溶液：阿奇霉素样品按下法制备 0.53mg/ml 的溶液。先将

7、阿奇霉素样品溶解于乙腈中，取 2%的最终溶液，用稀释液定容。 色谱系统 (见色谱法，系统适应性)；模式：液相色谱法检测波长：UV 210nm色谱柱：4.6-mm 25-cm，用粒径为 5-m 的 L67柱温：40流速：1mL/ 分钟。进样量：10l。系统适应性系统适应性进样：对照品溶液和系统适应性溶液。备注氮杂红霉素 A 的相对保留时间为 0.7，阿奇霉素为 1.0适应性要求适应性要求分离度：氮杂红霉素 A 与阿奇霉素的分离度不得少于 3；系统适应性溶液。拖尾因子范围：阿奇霉素峰的拖尾因子应为 0.81.5；对照品溶液。相对标准偏差：不大于 1.10%；对照品溶液。分析分析 2016 年 4

8、月 1 日 第 页 共 28 页4进样：对照品溶液和样品溶液。按下式计算每 mg 阿奇霉素中含 C38H72N2O12的量，单位是 g： (rU / rS)（Cs/Cu）P式中：rU 样品溶液中的峰响应值； rS 对照品溶液中的峰响应值。 Cs对照品溶液中 USP 阿奇霉素 RS 的浓度； Cu样品溶液中阿奇霉素的浓度； PUSP 阿奇霉素参比对照品的效价（g/mg 阿奇霉素）限度：按无水物计，9451030g/mg。 杂质杂质 无机杂质无机杂质炽灼残渣炽灼残渣 ：0.3， 炭化残留物用 2ml 硝酸及 5 滴浓硫酸润湿。重金属，重金属，方法二方法二 ：25ppm。有机杂质有机杂质方法 1 备

9、注如果杂质谱中有红霉素 A 肟和红霉素 A 亚胺醚，用方法 1。 使用的水电阻系数不小于 18 Mohm-cm.流动相 乙腈：溶液 A（250:750） 。用 5M 氢氧化钾调节 pH 至10.550.05。溶液 A20mM 磷酸二氢钾的水溶液。对照品储备溶液称取并用乙腈溶解一定量的 USP 德糖胺阿奇霉素参比对照品（USP Desosaminylazithromycin RS） ，USPN-去甲基阿奇霉素参比对照品（USP N-Demethylazithromycin RS） 、USP 氮杂红霉素 A 对照品（USP Azaerythromycin A RS）和 USP 阿奇霉素参比对照品，

10、获得已知浓度分别为45g/mL, 105g/mL, 150g/mL 和 160g/mL 的溶液。 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页5对照品溶液将对照品储备溶液用流动相稀释，获得已知德糖胺阿奇霉素 USP 参比对照品（USP Desosaminylazithromycin RS） ，N-去甲基阿奇霉素USP 参比对照品（USP N-Demethylazithromycin RS）和阿奇霉素 USP 参比对照品的浓度分别为 0.9g/ mL, 2.1g/mL 和 3.2g/mL 的溶液。样品溶液 0.33mg/ml。称取一定量的阿奇霉素，放入合适的容量瓶中，加入乙腈（乙腈用量为容

11、量瓶体积的 5%） ，若有必要可超声处理使溶解。用流动相稀释至刻度，混匀。 色谱系统（见色谱法）类型：液相色谱仪。液相色谱仪配有一个安培型电化学检测器（该检测器配有一个双玻璃碳电极，在氧化性保护模式下操作，电极 1 设置在 +0.70 V，电极 2 设置在+0.85 V） ； 色谱柱：色谱柱：分析柱：4.6-mm 15-cm，粒径 3-m 的 L49 填充。检测器预热：28自动进样器：5流速：1mL/ 分钟。进样量：50l。系统适应性系统适应性进样：对照品溶液。适应性要求分离度：阿奇霉素和氮杂红霉素 A 之间的分离度应不低于 3.0。拖尾因子：阿奇霉素峰的拖尾因子2.0，N-去甲基阿奇霉素峰的

12、拖尾因子2.5。相对标准偏差：各杂质相对标准偏差10.0%。分析进样：对照品溶液和样品溶液。 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页6备注记录样品溶液的色谱图，时间不少于阿奇霉素峰保留时间的 3.3倍。按下列公式计算阿奇霉素中德糖胺阿奇霉素（Desosaminylazithromycin） 、N-去甲基阿奇霉素（N-Demethylazithromycin）和氮杂红霉素 A 的百分比：(rU / rS)（Cs/Cu）F100式中：rU 样品溶液中相应待测物质的峰面积； rS 对照品溶液中相应待测物质的峰面积。 Cs对照品溶液中 USP 参比对照品的浓度（g/ml） ； Cu样品溶液

13、的浓度（g/ml） ； F单位转换（0.001mg/g）按下列公式计算阿奇霉素中其他有关物质的百分比： (rU / rS)（Cs/Cu）F100式中：rU 样品溶液中其他单个杂质的峰面积； rS 对照品溶液中阿奇霉素的峰面积。 Cs对照品溶液中 USP 阿奇霉素参比对照品的浓度（g/ml） ； Cu样品溶液的浓度（g/ml） ； F单位转换（0.001mg/g） 限度要求：见杂质表 1.杂质表 1名称相对保留时间限度， （%）红霉素 A 亚胺醚Erythrinycin A iminoether0.190.5德糖胺阿奇霉素（Desosaminylazithromycin）0.290.3红霉素 A

14、 肟0.370.5 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页7Erythromycin A oximeN-去甲基阿奇霉素（N-Demethylazithromycin）0.490.7氮杂红霉素 AAzaerythromycin A0.801.0阿奇霉素1.03-去氧基阿奇霉素（阿奇霉素 B）3-Deoxyazithromycin2.331.0总杂质3.0方法方法 2备注如果杂质谱中有红霉素 A 肟和红霉素 A 亚胺醚，用方法 1。 溶液 A1.8mg/ml 无水磷酸氢二钠的水溶液。用 1N 氢氧化钠溶液或 10%磷酸调节 pH 至 8.9。溶液 B乙腈和甲醇的混合液（3:1）.溶液

15、C1.73mg/ml 磷酸二氢铵溶液。用氨水 TS 调节 pH 至10.00.05。溶液 D甲醇、乙腈和溶液 C（7:6:7） 。流动相见如下梯度表。时间（分钟）溶液 A（%）溶液 B（%）05050254555304060802575815050935050系统适应性溶液用溶液 D 溶解，获得已知 USP 阿奇霉素杂质 F 参比对照品浓度为 0.0165mg/ml、USP 德糖胺阿奇霉素参比对照品浓度为0.027mg/ml 的溶液。 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页8对照品溶液用溶液 D 溶解，获得已知 USP 阿奇霉素参比对照品浓度为86g/ml 的溶液。样品溶液用溶液

16、D 溶解，获得已知阿奇霉素浓度为 8.6mg/ml 的溶液。 色谱系统 (见色谱法) 模式：液相色谱仪。 检测器：UV210nm。 色谱柱：一个 4.6-mm 25-cm 色谱柱；用 5-m 粒径的 L1 填充。 柱温：60 C。 流速：1ml/分钟。 进样量：50l。 系统适应性 进样：系统适应性溶液和对照品溶液。 峰谷比值：1.4，系统适应性溶液。备注峰谷比值计算公式： R=Hp/Hv Hp：德糖胺阿奇霉素峰基线以上的高度； Hv：除德糖胺阿奇霉素峰和阿奇霉素杂质 F 峰外，基线以上的峰曲线最低点的高度。拖尾因子：0.81.5，对照品溶液。分析进样：对照品溶液和样品溶液。备注在阿奇霉素 3

17、-N-氧化物之前和在 3-脱氧阿奇霉素（阿奇霉素B）之后析出的峰忽略不计。面积小于对照品溶液中阿奇霉素峰面积 0.1 倍的峰忽略不计。按下式计算阿奇霉素中各杂质的百分比：(rU / rS)（Cs/Cu）PF1100/F2式中：rU 样品溶液中各杂质的峰响应值； rS 对照品溶液中阿奇霉素的峰响应值； Cs对照品溶液中 USP 阿奇霉素参比对照品的浓度（mg/ml） ； 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页9 Cu样品溶液中阿奇霉素的浓度（mg/ml） ； P USP 阿奇霉素 RS 的效价（g/mg 阿奇霉素） F1单位转换系数（0.001mg/g） ； F2相对响应因子 (见表

18、 2)限度要求：见杂质表 2杂质表 2杂 质相对保留时间相对响应因子（F2）限度(, %)Azithromycin N-oxide 阿奇霉素-N-氧化物 a0.290.430.53-(N,N-didemethyl)-3-N-formylazithromycin3-(N,N-二去甲基)-3-N-甲酰阿奇霉素 b0.371.70.53-（N, N-didemethyl) azithromycin3-（N, N-二去甲基）阿奇霉素 c 0.431.00.5阿奇霉素杂质 F d0.513.80.5Desosaminylazithromycin德糖胺阿奇霉素 e0.541.00.33-N-4-(Acet

19、ylamino)phenyl-3,3-didemethylazithromycin 3-N-4-(乙酰氨基)苯基-3,3-二去甲基阿奇霉素0.55120.15N-demethyl-azithromycin N -去甲基-阿奇霉素 f0.611.00.7Azithromycin C （3-O-demethylazithromycin）阿奇霉素 C（3-O-去甲基阿奇霉素） g0.731.00.53-De(dimethylamino)-3-oxoazithromycin3-去（二甲氨基）-3-氧络阿奇霉素 h0.761.50.53-N-4-(Acetylamino)phenylsulfonyl-3

20、-demethylazithromycin 3-N-4-(乙酰氨基)苯基磺酰基-3-去甲基阿奇霉素0.79100.5 Azaerythromycin A氮杂红霉素 A i0.831.00.5Azithromycin impurity P阿奇霉素杂质 P j0.921.00.2阿奇霉素1.02-Desethyl-2-propylazithromycin2-去乙基-2-丙基阿奇霉素 k1.231.00.5 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页10杂 质相对保留时间相对响应因子（F2）限度(, %)3-N-demethyl-3-N-(4-methylphenyl)sulfonylazi

21、thromycin3-N-去甲基-3-N-(4-甲苯基)磺酰阿奇霉素 l1.2650.53-Deoxyazithromycin (azithromycin B)3-去氧阿奇霉素（阿奇霉素 B） m1.311.01.0其他未知单个杂质1.00.2总杂质3.0 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页11【包装和贮藏包装和贮藏】密封保存标示标示标签应说明此为一水合物还是为二水合物。用任何方法制得的阿奇霉素，其含量均应该以无水物 C38H72N2O12来计算标示。 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页12USP 附录翻译附录翻译红外吸收红外吸收6 种方法用于配制干性的试验样品

22、和分析用的参照标准。在试验条件下，参照，指将样品与溴化钾充分混合。参照，指在试验条件下将样品在矿物油中分散。参照，指在试验条件下将样品悬浮于适当的压片板之间（如：氯化钠或溴化钾） 。参照，指用专论中特定的溶剂配制已知浓度溶液，将该溶液在 0.1mm 目筛下检测。参照，指在试验条件下将样品与用于削减全反射分析内部的反射因素密切联系。参照，指在试验条件下将样品压制成一个薄片进行红外微观分析。削减全反射和技术被认为是、和的替代方法，进行定量试验，且参照标准图谱也是按类似方法获得的。 除非专论中有特别说明的，应在 2.6m 到 15m（3800cm-1650cm-1）的变化范围内记录试验样品和美国药典

23、参比对照品的图谱。供试样品的配制应与参照对照品一致，应先将供试样品按参比对照品的特定条件干燥，有其他的特殊要求或采用的该参照对照品在未经干燥的情况下除外。在相同波长下，只有当供试样品与美国药典参照对照品的配制一致时，可比性最大。 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页13某些情况下，样品的红外图谱与标准图谱存在差异，可视为存在多晶型物，这种结果不经常被接受（见分光光度仪和光散过程） 。除非专论中有特别说明，应继续进行试验。如果红外分析样品和标准图谱出现差异，在等体积合适的溶剂中，溶解等量的待测样品和对照品，在相同条件下，在相似的容器内，蒸发溶液至干，对残余物重复进行试验。旋光度中的

24、旋光度中的药品中比旋度781S表示由样品溶液观察到的光学旋光值计算而得到的比旋光度。除非特别说明，光学旋光值的测定是在 25时用 589nm 光线测得的。测定时使用光电偏光计，每一次测试前都需要将溶剂的旋光值调零。使用偏光计时，将同一个装有空白溶剂的旋光管校正后，不少于 5 次测定的平均值是有效的。测试供试液旋光值时的温度应保持在固定值的0.5。使用同一个旋光管测定样品以及空白溶剂。每次读数据时保持旋光管的角度一致。将旋光管放置在每次光线都能够从同一方向通过的地方。除非有其他规定，比旋光度是以干燥品或者以无水基准来计算的。溶液的光学旋光值应在 30min 内测定，如果已知待测物质会发生消旋或者

25、旋光改变，那么应该小心注意将待测物溶解于溶剂与将溶液放于旋光管之间的时间标准化。结晶性结晶性在专论中要求对药品进行结晶性分析时，需作此试验。操作详细介绍按照【776】 。【776】中的结晶性特征物质的结晶性可认为是，确定与专论中所需结晶性一致的一种特征。除个别专论有特殊要求外，在干净的玻璃载玻片上，放上一些矿物质油包裹的样品颗粒。用偏振显微镜检测此混合物：当显微镜的级数旋转时，此颗粒显示双折射（干涉色）和消光现象。pH理论（略）pH 计校正用的缓冲溶液计校正用的缓冲溶液 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页14pH 计校正用的缓冲溶液可以按照附表进行制备。国家科学与技术委员会（N

26、ational Institute of Science and Technology）有缓冲盐所必需的纯度。溶液可以存放在带密封口或二氧化碳吸收管的硬质玻璃或者聚乙烯瓶中。新制的溶液使用不能超过 3 个月，并且溶液要用无二氧化碳水制备。表中给出了缓冲溶液的 pH 值随温度的变化值。这里所列的是适应于标出摩尔浓度的溶液。然而，为了方便制备，在摩尔浓度的基础上，与其标出 1000g 溶剂不如稀释成 1000ml体积。这里指示的量是考虑了其他因素计算出来的。标准缓冲液的 pH 值：温度/草酸钾0.05m苯二甲酸氢钾 0.05m磷酸盐0.05m硼砂0.01m氢氧化钙饱和（25 ）101.674.00

27、6.929.3313.00151.674.006.909.2812.81201.684.006.889.2312.63251.684.016.869.1812.45301.684.026.859.1412.29351.694.026.849.1012.13401.694.046.849.0711.98451.704.056.839.0411.8451.74.066.839.0111.71 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页1501551.724.086.838.9911.57601.724.096.848.9611.45草酸钾，0.05m精确称取 KH3(C2O4)2H2O12

28、.61g，加水使溶解并稀释至1000ml。苯二甲酸氢钾，0.05m精确称取在 100干燥 1 小时的KHC8H4O410.12g，加水使溶解并稀释至 1000ml。磷酸盐，0.05m精确称取在 120干燥 2 小时的 Na2HPO43.53g 与3.39gKH2PO4，加水使溶解并稀释至 1000ml。硼砂，0.01m精确称取 Na2B4O710H2O3.80g，加水使溶解并稀释至1000ml。避免空气中二氧化碳进入。氢氧化钙，饱和（25）于 25，用无二氧化碳的水制备氢氧化钙的饱和溶液，取上清液使用。存放时应防止空气中的二氧化碳进入。一旦混浊，应弃去重配。由于环境和所用 pH 计的不同，给出

29、一个适合于所有电势测定 pH 计的用法说明是不实际的。一般的规则见一下几段，这些规则是每个仪表厂家都实行的说明书。如果在使用前存在盐桥，检查电极。按需要补充盐桥溶液，并且注意说明书或电极厂家标出的其它事项。 为了校正 pH 计，应选择二种 pH 值相差小于 4 个 pH 单位的标准缓冲液，并使供试品的 pH 值处于二者之间。在测试温度下向电池里加入第一种标准缓冲溶液。将温度控制在溶液的温度，调节刻度使仪器与表列数值一致。用第二种标准缓冲溶液多次冲洗电极和电池，然后在测试温度将它加入到电池里。误差应不大于0.07pH 单位。若大于此偏差，则应小心调节斜率或温度使示值与第二种标准缓冲液的表列数值相

30、符。重复上述定位与斜率的调节操作，至仪器示值与标准缓冲液的规定数值相差不大于 0.02pH 单位。否则，需要检查仪器或更换电极后，再行校正至符合要求。当系统运行满意后，用少量待测液冲洗电极和电池几次，将待测液加到电池里，读取 pH 值。在测定 pH 时，用无二氧化 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页16碳水(见溶剂、指示剂与溶液的选择的水)制备溶液或稀释待测液。在所有的 pH测试中，都要使之有充足的时间稳定。指示剂和测试纸（见溶剂、指示剂与溶液中的指示剂和指示测试纸）的 pH值足够接近就符合要求了。关于缓冲液的讨论及测试与分析所需的标准缓冲液的成分，见溶剂、指示剂与溶液中的缓冲

31、溶液。水分，方法水分，方法 1方法方法1 （滴定滴定）用方法用方法1a测定水份，除非药品单个说明中有特殊规定。测定水份，除非药品单个说明中有特殊规定。方法方法1a（直接滴定）（直接滴定）试剂试剂按如下方法制备卡尔-费休氏（Karl Fischer）试剂。将125g碘加入到含有670ml甲醇以及170ml吡啶的溶液中，冷却。用250ml量筒量取100ml吡啶，并置于冰浴中，通入二氧化硫直到溶液体积达到200ml。将此溶液慢慢地滴加到冷却的碘混合物中，振荡，直至碘溶解。将此溶液移到仪器中，在标定之前放置过夜。刚配制的此溶液1ml相当于5mg水，但是它会逐渐变质，故而应在使用前一小时内对其进行标定（

32、如果经常用的话，则需要每天进行标定） 。使用时，避光。将此溶液在密封良好、具玻璃瓶塞的容器中避光冷藏保存。商业上可用的、稳定的卡尔-费休氏试剂也可以使用。除了吡啶、乙醇和甲醇以外，包括溶剂或者碱在内的商业上销售的试剂也可以使用。在一些药品的单个说明书中，稀释试剂应该按制造商提供的方法进行稀释。甲醇或者其他合适的溶剂，如乙二醇甲醚也可作为稀释液。样品溶液样品溶液除特别说明外，精密称量大约含有10250mg水的供试品。如果供试品为推进式气雾剂，在冷藏室中至少冷冻2h。在10或者更高的温度下，测试10.0ml的混合均匀的样品到滴定终点。如果供试品为胶囊，则不能少于4粒。如果供试品为片剂，则应在不影响

33、结果的大气温度、湿度的环境中将不少于4片的供试品磨成粉末后再进行测试。如果供试品吸湿，用干燥的注射器将一定体积的甲醇或其他适宜的溶剂注入到已“去皮”的容器中，称重，振荡至供试品溶解。利用同一注射器将此溶液 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页17转移到测定方法中的滴定瓶中。用另外的甲醇或其他适宜的溶剂重复此步骤，并将洗液一并加入到上述滴定瓶中，并立即滴定。按“剩余滴定中水溶液标定剩余滴定中水溶液标定”中的方法，测定溶解供试品、洗涤容器及注射器时所用相同体积的溶剂中的水分含量，单位为mg；从滴定供试品所得水含量的数值(单位mg)中减去上述数值。在100的密闭环境中干燥3h，于干燥器

34、中冷却，称重,其与容器初始重量的差值即为供试品的重量。试剂标定试剂标定将足量的甲醇或其他溶剂加入到滴定瓶中,以盖住电极为限；再加入试剂，直到滴定终点特征性颜色出现，或者直到约200mv电压下产生10050mA的直流电。要测定痕量的水分含量（1） ，则需要用酒石酸钠作为便利的水分参考物质。用差量法精确称量150350mg酒石酸钠（C4H4Na2O62H2O） ，并快速地加入到体系中，滴定到终点。水分平衡因子F，单位为mg水/ml试剂，可用以下式子计算：2（18.02/230.08）(W/V)其中，18.02、230.08分别为水、酒石酸钠的分子质量；W是二水合酒石酸钠的质量，单位mg；V为第二次

35、滴定时所消耗的试剂体积，单位ml。若要精密地测定水分含量（1） ，则须用纯水作为参考物质。用称量管，或者已称重的注射器（或微型称量管） ，依据差量法，快速地称取25250mg水，具体的称取量依据试剂浓度以及滴定管的尺寸来选择（参考容量仪器容量仪器 31），滴定到终点，用下式计算水分平衡因子F，单位mg水/ml试剂：W/V其中，W是水的重量，单位mg；V为所用试剂的体积，单位ml。测定方法测定方法除有特别说明外，量取3540ml甲醇或其他溶剂到滴定瓶中，用试剂滴定到仪器标示的或者可视的滴定终点，以消耗任何存在的水分。 （此次滴定所消耗的体积没有用途,因为它不会列入计算中） 。迅速地加入样品溶液，

36、摇匀，再次用试剂滴定到仪器标示的或者可视的滴定终点。用下式计算样品中的水分含量：SF其中，S为第二次滴定中所消耗的试剂体积，单位为ml；F为试剂的水分平衡因子。 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页18方法方法1b（剩余滴定）（剩余滴定）仪器、试剂、样品溶液仪器、试剂、样品溶液与方法1a相同。剩余滴定中水溶液的标定剩余滴定中水溶液的标定用甲醇或其他溶剂将2ml水稀释到1000ml制成水溶液水溶液。按“试剂标定试剂标定”中的方法,用25.0ml试剂标定此水溶液。用下式计算每1ml水溶液中水的含量，单位mg:VF/25其中，V为所消耗的试剂试剂体积；F为试剂的水分平衡因子。每周测定水

37、溶液中的水含量，并定期地对试剂进行标定。测定方法测定方法当药品的单个说明书中要求需要用方法1b测量含水量时，量取3540ml甲醇或其他溶剂于滴定瓶中，用试剂滴定到仪器标示的或者可视的滴定终点。迅速地加入样品溶液，摇匀；加入精确称量的试剂(过量)。经过足够的时间让反应完全，用标定过的水溶液滴定未消耗的试剂到仪器标示的或者可视的滴定终点。用下式计算样品中的水含量，单位mg：F(X-XR)其中，F为试剂的水分平衡因子；X为加入样品后所加入试剂的体积，单位ml；X为用于中和未消耗掉的试剂所需已标定的水溶液的体积，单位ml；R为V/25的比值（每ml试剂/每ml水溶液） 。方法方法1c（库仑滴定）（库仑

38、滴定）仪器装置仪器装置任何商业提供的包括一个配有合适电极和磁力搅拌器的绝对密闭的仪器都是可用的。该装置的微处理器控制着分析过程并显示最后的结果。当消耗的电流能被完全测定时，不需要对仪器进行校正。试剂试剂见方法1a。样品溶液样品溶液如果样品为可溶性固体，精确称量一定量样品，用无水甲醇或其他溶剂将其溶解。液体样品亦可以按此法制备，或者也可在其他无水溶剂中制备。如果样品是不溶性固体，用无水溶剂将水分萃取出来，精确称量后，注入到电解质溶液中，或者依照蒸发的方法，在干燥的惰性气体流中，在管中加热样品，水蒸气和惰性气体一同通入到电池中。 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页19测定方法测定方

39、法精确称量大约含0.55mg水(或者按照仪器说明所标示的量)的样品溶液，用干燥的注射器注入阳极，摇匀，用库仑滴定法滴定到测定终点。从仪器显示上直接读取测试溶液中的水分量，并计算其在物质中的百分量。做一次空白测定，以做一些必要的修正。灼烧残渣灼烧残渣 测定方法测定方法坩埚(可为硅、铂、石英、瓷等材质)在60050下灼烧30min，然后在装有硅胶或其他合适干燥剂的干燥器中冷却，称重。精确称量供试品12g（或按各专论项下所规定的重量） ，置于该坩埚中。用少许硫酸（通常为1ml）湿润样品，在尽可能低的温度下，小心加热至样品完全炭化，冷却，除有特别说明外，用少许硫酸（约1ml）湿润剩余物，小心加热直到不

40、再有白色泡沫产生；然后在60050下（除有特别说明外）灼烧，直到残留物完全灰化。在上述操作的过程中要确保不着火。在盛有硅胶或其他干燥剂的干燥器中冷却，称重，计算残渣的百分含量。除特别说明外，如果残渣重量超过了各药品项下的限定值，则须重复用硫酸湿润、加热、灼烧等步骤，直到残留物连续两次的测量数值不大于0.5mg或者其百分含量在各专论的限定值内。 灼烧时置于一个通气性良好的罩内，但要防止接触空气流，在尽可能低的温度下达到碳的完全燃烧。如果想使用烘炉也可以，但要使温度在60050下。烘炉的校正可以使用一个合适的数字温度计，按标准和技术国家委员会的要求，用标准热电偶去校准工作热电偶探头。烘炉的测量和控

41、制电路要通过检测炉子的温度控制装置进行准确验证，允许公差为25。重金属，重金属，方法二方法二 方法1 和 3 （略） 注：此方法用于汞、铋、砷、锑、锡、镉、银、铜、钼等金属的检测 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页20特殊试剂特殊试剂硝酸铅贮备溶液硝酸铅贮备溶液将159.8mg硝酸铅溶解于100ml水中，加入1ml硝酸，用水稀释到1000ml即得硝酸铅备溶液。配制与储存用的玻璃容器均不得含可溶解的铅盐。标准铅溶液标准铅溶液临用前，用水将10.0ml的硝酸铅贮备溶液稀释至100.0ml。每1ml标准铅溶液中含有相当于10g的铅。利用此标准铅溶液，配制成每100l标准铅溶液中含1g

42、供试样品的对照溶液，此溶液中相当于每1000000份待测样品中有一份为铅。方法方法此方法用于在方法I中不能产生清澈、无色的测试液的情况下，或者是由于自身聚合的性能而干扰形成金属二价硫离子沉淀的物质，或者是挥发及不挥发性油。注意注意此方法不能用于汞金属的检测。PH=3.5醋酸缓冲液醋酸缓冲液将25.0g醋酸铵溶解于25ml水中，加入38.0ml的6N盐酸溶液。若需要的话，用6N盐酸或6N氢氧化铵溶液调PH值至3.5，用水稀释至100ml，混合均匀。标准溶液标准溶液向50ml的比色管中加入2ml标准铅溶液（20g的铅） ，然后用水稀释至25ml。在PH计或精密PH试纸检测下，用1N醋酸或6N氨水调

43、PH值至3.04.0，用水稀释至40ml，混合均匀。样品溶液样品溶液按下式计算测试所需样品的质量，单位为g： 2.0/（1000L）其中，L为重金属限度（%） 。将称量的样品置于坩埚中，加入足量的硫酸以湿润样品，在低温下小心地灼烧样品直至完全炭化。 （在灼烧过程中此坩埚需盖上,但不用盖得太紧密） 。加入2ml硝酸及5滴硫酸，小心加热至不再有气泡产生。在500600炉子中灼烧,直至碳完全燃烧。冷却后加入4ml的6N盐酸，盖上盖子，在蒸气浴中煮15min，然后移去盖子，慢慢在蒸气浴上蒸发至干。用一滴盐酸溶液润湿残留物后，再加入10ml热水，煮2分钟。然后滴加6N氨水调溶液为碱性（用石蕊试纸检测），

44、用水稀释至25ml后, 在PH计或精密PH试纸检测下，用1N醋酸调PH值至3.04.0。如需要可过滤一遍，并用10ml水冲洗坩锅和 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页21过滤器，将滤液和洗涤水倒入一个50ml的比色管中，最后用水稀释至40ml，混合均匀。 测定方法测定方法向标准溶液、样品溶液标准溶液、样品溶液的试管中分别小心地加入2mlPH=3.5醋醋酸缓冲液酸缓冲液，然后加入1.2ml硫代乙酰胺丙三醇碱性试液（Thioacetamide-glycerin base TS） ，用水稀释到50ml，摇匀，放置2min，在白色背景下，自上而下透视：样品溶液的颜色要不深于标准溶液的颜

45、色。 注硫代乙酰胺丙三醇碱性试液（Thioacetamide-glycerin base TS）：将0.2ml硫代乙酰胺试液和1ml丙三醇碱性试液混合，沸水浴加热20秒钟。混合液即用即配。硫代乙酰胺试液：将4g硫代乙酰胺溶解于100ml水中。丙三醇碱性试液：向200g丙三醇中加水，使总重量达235g。再向其中加入140ml的1N氢氧化钠溶液和50ml水。色谱中的系统适用性色谱中的系统适用性621高压液相色谱法高压液相色谱法高压液相色谱法（HPLC），有时也称为高效液相色谱法，是基于固体为固定相，液体为流动相的分离技术。分离是通过分配、吸附或者离子交换过程来完成，取决于所用的固定相类型。分析有机

46、物方面 HPLC 比气相有明显优势。将待分析的混合物溶解在适宜的溶剂中，且大多数分离在室温条件下即可进行。因此，大部分样品包括难挥发或者热不稳定性化合物可以被分离，而不需要分解或衍生成易挥发性物质。大部分药物分析是基于分配色谱，并且在 30 分钟内完成色谱分析。同气相色谱一样，化合物洗脱时间可以用容量因子 k 描述（参见符号术语表），它取决于被分析物的化学性质、流动相的组成和流速以及固定相的组成和表面积。柱长也是分离度的重要的决定性因素。只有具有不同容量因子的混合物才可以被 HPLC 分开。仪器装置仪器装置液相色谱是由流动相贮液瓶、在高压下能够使流动相通过系统的泵、将样品引入流动相的进样器、色

47、谱柱、检测器和数据采集装置（例如 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页22计算机、积分仪或记录仪）组成的。短的、口径小且含有密度较高的固定相填料的色谱柱可以为化合物在流动相和固定相间快速交换提供条件。除接收和报告检测器输出结果之外，计算机被用来控制色谱仪设置和操作，如此可为长期无人操作提供必要条件。泵系统HPLC 泵系统定量地将流动相通过高压管路和装置从储液瓶运送到色谱柱。现代的系统包括一个或更多计算机控制的计量泵，可根据编订好的程序按梯度色谱的要求来变化流动相的组成，或混合无梯度的流动相（即流动相有固定的溶剂比值）。然而，在预混和的无梯度流动相中各种成分的比例，与那些用多个泵系

48、统混合的相比，更能准确地控制。常见的情况为运行压力高达 5000psi 或更高，此时泵的转送速度可达 10ml/min。用于定量分析的泵应由惰性的耐流动相腐蚀的材料组成，且在输送流动相过程中以不变的速率运送流动相，同时可以很小的波动运行很长一段时间。进样器待测化合物在流动相或其他适当的溶液中溶解后，通过人工操作注射器或定量环，或者用自动进样系统注入流动相。后者是由一个转盘或转送架和一个进样装置组成，转盘或转送架上面可以盛放带有可刺破的膜或塞子的样品瓶，进样装置可以将样品从样品瓶中转移定量环中从而进入色谱系统。有些自动进样器可以通过程序设计来控制样品体积、进样次数和定量环清洗循环、进样时间间隔和

49、其它操作变量。当柱头压力小于 70 个大气压（约 1000 psi）时可以用注射器通过隔膜手动进样。在较高压力的情况下，必须有一个进样阀。一些阀系统将定量环合并在一起，将定量环内所装的供试品溶液在流动相中转移至色谱柱。在另一些系统中，供试品溶液通过注射器注入空腔中，再转动阀开关，使其进入流动相。色谱柱对于大多数药物的分析，是通过将供试品溶液中的化合物分配于流动相和固定相之间来实现分离的。由非极性流动相和极性固定相组成的系统称为正相色谱，反之，由极性流动相和非极性固定相组成的系统称为反相色谱。分配色谱常被用于分子量小于 1000 的碳氢化合物的分析。化合物对固定相的亲合力，以及因此而得到的在柱中

50、的保留时间，可以通过调节流动相的极性高低来控制。流动相的极性可以通过加入第二种和第三种有时甚至是第四种成分而改变。 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页23现在典型的反相液相色谱的固定相是由有机相化学键合到硅胶或其他材料上而成。粒径通常为 310m，但制备柱的大小可以达到 50m 甚至更高。带有薄层有机相包裹的小颗粒可以提供低质量传递阻力，因此可以提供化合物在固定相和流动之间的快速传递。色谱柱的极性取决于键合官能团的极性，它包括从相对无极性的十八烷基硅烷到强极性的硝基。液体，未键合的固定相基本上不得溶于流动相。即使如此，常常需要用固定相来预饱和流动相以防止固定相从色谱柱中被剥离。

51、包裹在支持物上的聚合物固定相具有更好的耐用性。用于分析分离的色谱柱内径通常为 25mm；制备色谱采用大内径的色谱柱。对色谱柱升温可能会获得更有效的分离，但由于存在固定相降解或流动相挥发的可能性，故很少将其加热到 60以上。除非在个论中另有规定，色谱柱应在室温下使用。离子交换色谱用于分析分离分子量不超过 1500 的水溶性的、离子化的化合物。固定相通常是合成的有机树脂，阳离子交换树脂含有负电荷活性位点，用于分离碱性物质，例如胺；而阴离子交换树脂含有正电荷活性位点，用于分离还有负电荷基团的化合物，例如磷酸、磺酸或羧酸。水溶性离子或离子化的化合物吸附到树脂上，亲合能力的不同产生了色谱分离。流动相的

52、pH、温度、离子类型、离子浓度和有机物修饰剂可以影响平衡，可以调节这些变量来获得所需的分离度。在分子排阻色谱中，色谱柱中填充的是多孔固定相。按照化合物分子量的大小进行色谱分离。分子量大的分子不能进入孔内而不保留地排出色谱柱。分子量小的分子进入孔内随分子量降低而保留时间增加。这些色谱柱典型地应用于测量聚合物和大分子的降解（见分子排阻色谱一节）。检测器许多药典中的 HPLC 方法需要使用分光光度度检测器。这种检测器由在色谱柱的末端安装的一个流通池构成。紫外光穿过流通池进入检测器。当化合物从色谱柱上洗脱时，通过流通池产生吸收，导致测量的能量水平发生变化。固定波长、可变波长和多波长的检测器被广泛应用。

53、固定波长检测器只能在一个单波长下操作，典型的为 254nm，由低压力汞灯发射光源。可变波长检测器含有一个连续的光源，例如氘灯或高压氙灯，用一个单色器或干涉滤光片 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页24在操作者所选择的波长处产生单色光。装有单色器的可变波长检测器的波长准确性需要按照生产厂商的程序方法进行检查，如果检测的波长偏离校正值超过3nm，就要对仪器进行重新校正。现在的可变波长检测器在分析过程中可以程序地变化波长。多波长检测器可以同时在两个或更多波长下测量吸收情况。在二极管阵列多波长检测器中，连续发射的光透过样品池，然后分解成其组成的波长，用二极管阵列分别检测。这些检测器可以

54、获得在整个紫外-可见范围的吸收数据，因而可以提供给分析人员在多个、选择性波长处的图谱以及各洗脱峰的图谱。二极管阵列检测器与固定波长检测器或可变波长检测器相比，有较低的信噪比，因此不适于分析低浓度的化合物。示差折光检测器测量单独的流动相折光率与从色谱柱中流出的含有待测物质的流动相折光率之间的差异。示差折光检测器用于检测非紫外吸收的化合物，但其灵敏度比紫外检测器低。它们对溶剂组成、流速和温度的微小变化非常敏感，因此需要一个参比柱来获得满意的基线。荧光检测器对那些本身具有荧光以及可以通过化合物的转化或与荧光试剂在特定的官能团下配对转变成荧光衍生物的化合物敏感。如果需要衍生化，可以色谱分离前衍生，试剂

55、也可以在进入检测器前将其引入流动相中。电位、伏特或极谱电化学检测器用于定量测定能在工作电极处被氧化或被还原的样品。这些检测器有选择性、灵敏可信，但要求流动中不能溶解有氧气和还原性金属离子。必须使用无脉冲型泵，并且要确保流动相的 pH、离子强度和温度保持恒定。工作电极容易被伴随产生的具有可变响应值的还原产物污染。还有碳糊电极的电化学检测器可以方便地用于定量测定纳克级的易氧化化合物，特别是酚类和儿茶酚类。新的检测器陆续被开发，以克服正在使用的检测器的缺点。数据采集装置现在的数据工作站可以收集和贮存检测器输出的结果，并且可以输出峰高、峰面积、样品鉴定和方法变量的色谱图。它们(数据采集装置)也可以用于

56、液相色谱编程，控制大多数变量，提供长时间的无人值守操作。 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页25数据也可以用简单的手动测量记录仪或单独的积分仪来采集，它们可以完成从输出峰面积到输出带有峰面积和峰高结果计算的色谱图，以及贮存后来操作过程中得到的数据。操作步骤操作步骤流动相组成可以很大地影响色谱性能和被分离的混合化合物的分离度。对于准确定量的测定，必须使用高纯度的试剂和“HPLC 级”有机溶剂。所使用水的质量要求具有低电导和低紫外吸收。特定类型检测器（例如电化学、质谱）所用的试剂，可能要求制定附加的条件，以避免潜在的干扰。对于容量因子 k 来说，组成比温度的影响更大。在分配色谱中，

57、决定分离的分配系数可以通过在流动相中加入其它化合物而发生变化。在离子交换色谱中，流动相的 pH 值和离子强度以及组成都会影响容量因子。使用在色谱运行的过程中连续变化流动相溶剂的组成的技术叫做梯度洗脱或程序变溶剂洗脱。它有时用于容量因子差别很大的混合化合物的色谱分离。对于溶剂组成变化敏感的检测器，例如示差折光检测器，使用梯度洗脱技术比较困难。检测器必须具有一个很宽的线性动态范围，被检测化合物必须与其它干扰物分离。化合物的线性动态范围是指检测器信号响应值与化合物的量成正比的范围。对于定量检测的最大适应性，此范围应该有大约三个数量级。HPLC 系统可以通过使用已知浓度的对照品与峰响应值作图，按外标法

58、或内标法进行校正。如果使用自动进样器，可以用外标法获得可信的定量结果。这种方法可以通过直接比较供试品和对照品溶液峰响应值而直接获得。如果必须使用注射器进样，由于在高压下的不重现性，需用已知量的不具干扰性的化合物做内部校正来获得比较好的定量结果，将内标物加入到供试品溶液和对照品溶液中，将药物峰面积响应值与内标物峰面积响应值的比值进行比较。由于仪器设备、进样和技术的正常变化，需要进行系统适用性试验以确保给定的操作系统是可用的。系统适用性试验的主要特征在下文中阐述。对结果解释，见色谱图解释一节。系统适用性系统适用性系统适用性是构成气相和液相色谱方法所必须的部分。它们常用作证明色 2016 年 4 月 1 日 第 页 共 28 页26谱体系的分辨率和重现性适合所进行的分析。试验依据于仪器、电子设备、分析操作和待分析的样品，组成一个完整的体系。分辨率，R， （注参见符号术语表）具有代表柱子效率N的功能，用于说明待洗脱化合物能否彼此分别开来，建立系统的完全分辩能力，保证内标物能从药物中分离出来。柱效率也可以说明系统适用性，尤其色谱图中仅有一个峰时；然而，与直接测量相比，可靠性低。柱子效率是峰清晰度的一个量度，对于检验痕量化合物比较重要。在操作中，标准溶液的重复进样要满足精密度的要求。除非个别专论的特殊要求外，如果相对标准偏差要求2