细胞沉默调节蛋白1SIRT1活性比色法定量检测试剂盒中文

1、细胞沉默调节蛋白1 （ SIRT1 ）活性比色法定量检测试剂盒（中文版）主要用途细胞沉默调节蛋白1 （SIRT1）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过比色探针对硝基苯胺标记人工合成的乙酰化p53 多肽底物，经过SIRT1 脱乙酰基后，被位点特异性氨基肽酶水解，释放黄色对硝基苯胺，即采用比色法来测定细胞裂解萃取样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。 其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、核蛋白样品、 部分或完全纯化酶样品中SIRT1的活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。技术背景人体组蛋白脱乙酰基酶（ his

2、tone deacetylase；HDAC ）家属分成三类共 20多个蛋白：种类 I（class I）与酵母Rpd3蛋白同源，包括 HDAC1 、2、3、 8，存在于细胞核中；种类 II （class II ）与酵母 Hda1蛋白同源，包括HDAC4 、5、6、7、 9a、 9b、10和HDRP/MITR ，存在于细胞核和细胞浆里；上述两大种类的蛋白分子催化结构域含有锌，且曲古菌素A （ trichostatin A ； TSA ）敏感。种类 III （class III ）为 NAD +辅助因子必需，又称为 sirtuins ，与酵母 Sir2（ Silent Information Reg

3、ulator 2 ）同源，包括 SIRT1至7等，为曲古菌素 A（ trichostatin A ；TSA ）不敏感型赖氨酸脱乙酰基酶（ lysyl-deacetylase）。催化赖氨酸脱乙酰基反应，以及由 NAD +和乙酰（ acetyl）基团转化产生的烟酰胺（ nicotinamide ）和 O-乙酰 ADP 核糖（ O-acetyl-ADP-ribose ）。SIRT1位于细胞核内，与酵母 Sir2同源性最高。 其功能在于调节 p53 活性和抑制细胞凋亡。 基于人工合成的乙酰化 p53（ 379至382 氨基酸位点）多肽底物 Ac-Arg-His-Lys-Lys （Ac ）具有抗氨基肽酶

4、切离的功能，首先使用比色染料对硝基苯胺（ p- Nitroaniline ；p-NA ）来标记乙酰化 p53多肽底物，其次进行脱乙酰化，最后底物进一步在氨基肽酶的催化酶解，释放出具有强烈吸光值的黄色对硝基苯胺（波长405nm），由此来定量测定沉默调节蛋白1的活性。其反应系统为：Sirt1Ac-Arg-His-Lys-Lys （Ac ）- p-NA+NAD Ac-Arg-His-Lys-Lys- p-NA+nicotinamide+O-acetyl-ADP-ribose氨基肽酶Ac-Arg-His-Lys-Lys- p-NAAc-Arg-His-Lys-Lys+p-NA产品内容裂解液（ Reag

5、ent A）20 毫升分离液（ Reagent B）80 毫升清理液（ Reagent C）80 毫升萃取液（ Reagent D）5 毫升缓冲液（ Reagent E）3毫升底物液（ Reagent F）100微升终止液（ Reagent G）200微升酶解液（ Reagent H）200微升补充液（ Reagent I）500微升产品说明书1 份保存方式保存缓冲液（Reagent E）、 底物液（Reagent F）、 终止液（Reagent G）和酶解液（Reagent H）在 20冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保证6 月用户自备磷

6、酸盐缓冲溶液（PBS）：用于清洗细胞样品15 毫升锥形离心管：用于样品处理的容器1.5 毫升离心管：用于样品操作和保存的容器（微型）台式离心机：用于细胞预处理培养箱：用于反应物孵育96 孔板或 100 微升厘米光径比色皿：用于反应和比色的容器酶标仪或分光光度仪：用于比色分析实验步骤实验开始前，将20冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。一、样品准备1 准备好 75cm2 细胞培养瓶或 100mm 细胞培养皿的待测培养细胞（1 至 5 X 107细胞）2 小心抽去培养液3 小心加入 10 毫升用户自备的磷酸盐缓冲溶液（PBS），覆盖生长表面4 小心抽去清理液5 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞

7、（注意：避免使用胰酶消化 ）6 加入 1 毫升 裂解液（ Reagent A），混匀细胞7 移入到预冷的 15毫升锥形离心管8 强力涡旋震荡 10秒9 置于冰槽里孵育 15 分钟10加入 4 毫升预冷的分离液（ Reagent B），混匀11放进 4台式离心机离心10 分钟，速度为 1300g12小心抽去上清液13加入 4 毫升预冷的清理液（ Reagent C）14放进 4台式离心机离心10 分钟，速度为 1300g15小心抽去上清液16小心加入 100 微升预冷的萃取液（ Reagent D），混匀17转移到新的预冷的1.5 毫升离心管18超声处理 30 秒19置于冰槽里孵育 30 分钟2

8、0放进 4微型台式离心机离心10 分钟，速度为16000g（或 13000RPM ，例如 EPPENDORF 5415 ）21小心移取上清液到新的预冷的1.5 毫升离心管22移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒 HL 30030.1）23即刻放进 70保存或置于冰槽里继续后续操作二、 测定准备1 准备好待测样品（例如核蛋白或纯化酶样品等），置于冰槽里2 设定好酶标仪或分光光度仪（温度为30）： 波长 405nm，并置零3缓冲液（ Reagent E）置于室温下均衡温度三、活性测定（一）终点法活性测定1 在 96 孔板上做好相应标记：背景空对照和

9、待测样品2 分别移取 55 微升缓冲液（ Reagent E）到相应孔里3 分别加入 5 微升底物液（ Reagent F）4 分别加入 20 微升补充液（ Reagent I）或待测样品（ 50 微克核蛋白或200 微克细胞裂解萃取液总蛋白）（注意： 样品须清澈 ）5 轻轻摇动 96 孔板 30 秒6 放进 30培养箱里，孵育60 分钟，避免光照7 分别加入 10 微升终止液（ Reagent G）8 分别加入 10 微升酶解液（ Reagent H ）9 轻轻摇动 96 孔板 30 秒10在 30培养箱里，孵育30 分钟11即刻放进酶标仪或转移到100 微升 1 厘米光径比色皿，在分光光度

10、仪里检测：获得吸光读数12活性计算：（1）酶标仪检测（样品读数背景读数）X 样品稀释倍数摩尔吸光系数）X 1 （反应时间；小时）毫升单位 /毫克X 0.10（体系容量；毫升）X 0.6（光径距离；厘米） ÷0.02（样品容量；毫升）X 10.5 （毫单位 /毫升 ÷（样品蛋白浓度）毫克/单位微摩尔对硝基苯酚/小时（2）比色皿检测 （样品读数背景读数）（毫摩尔吸光系数）X 1X 样品稀释倍数X 0.10（体系容量；毫升） ÷0.020 （样品容量；毫升）X 10.5（反应时间；小时） 单位 /毫升 ÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升单位 /毫克单位微摩尔对硝基苯

11、酚/小时（二）酶动法活性测定1. 在 96 孔板上做好相应标记：背景空对照和待测样品2 分别移取 65 微升缓冲液（ Reagent E）到相应孔里3 分别加入 5 微升底物液（ Reagent F）4 分别加入 20 微升补充液（ Reagent I）或待测样品（ 50 微克核蛋白或200 微克细胞裂解萃取液总蛋白）（注意： 样品须清澈 ）5 轻轻摇动 96 孔板 30 秒6 放进 30培养箱里，孵育2 分钟，避免光照7 分别加入 10 微升酶解液（ Reagent H ）8 轻轻摇动 96 孔板 5 秒9 即刻放进酶标仪或转移到100 微升1 厘米光径比色皿，在分光光度仪里检测：间隔5 分

12、钟，读数6 次（共 30 分钟） 获得吸光读数10活性计算：（ 1）酶标仪检测（样品读数背景读数）X 样品稀释倍数X 0.10（体系容量；毫升） ÷0.02（样品容量；毫升）X 10.5 （毫摩尔吸光系数）X 30（反应时间；分钟）毫升单位 /毫克X 0.6 （光径距离；厘米）单位 /毫升 ÷（样品蛋白浓度）毫克/单位微摩尔对硝基苯酚/分钟（ 2）比色皿检测 （样品读数背景读数）（毫摩尔吸光系数）X 30X 样品稀释倍数X 0.10（体系容量；毫升） ÷0.020 （样品容量；毫升）X 10.5（反应时间；分钟） 单位 /毫升 ÷（样品蛋白浓度）毫克/ 毫升单位 / 毫克单位微摩尔对硝基苯酚/分钟注意事项1 本产品为 20 次操作，包括背景对照2 操作时，须戴手套3 系统操作过程中，背景测定只需1 次4 样品须澄清，至关重要5 样品处理时，避免使用蛋白酶抑制剂、PMSF 、烷基胺（ alkyl amine ）等6 孵育反应完成后即刻进行比色测定7 滤波器可以使用波长400nm 替代 405nm8 测定值由低到高变化；酶动法测定可以持续60 分钟9 测定值吸光读数越高，表明酶活性越高10比色测定后，比色皿须清洗彻底11待测样本为核蛋白样品，其蛋白浓度为50 微克 /20 微升；待测样本