高效凝胶色谱法测定聚烯亚胺的分子量及其分布

1、聚乙烯亚胺的分子量及其分布的水性凝胶色谱测定摘要：采用水性凝胶色谱方法分析了聚乙烯亚胺的分子量和分子量分布，确定在？条件下对样品的分离效果最佳，且结果的重复性和再现性在误差允许的范围之内？关键词：聚乙烯亚胺，水性凝胶色谱，重复性，再现性前言聚乙烯亚胺也是一种广泛使用的高分子材料，可用作造纸助剂、粘合材料及其助剂、涂料及墨水助剂、纺织助剂和分散剂等。此外，聚乙烯亚胺(PEI)是1995年发现的重要的非病毒核酸载体 周天洋等，中国药学杂志，43（10），766-770 （2008）。由于基因治疗的发展，使得医治遗传疾病或癌症成为可能。成功的基因治疗依赖于有效的基因载体。目前基因载体主要分为病毒载体

2、和非病毒载体两大类，其中多种病毒载体已进入临床试验阶段，但其潜在的免疫原性和毒性仍令人担忧。因此近年来用物理或化学方法制备的非病毒基因载体，由于具有价格低、操作简单、安全性高等特点而备受关注。其中阳离子聚合物聚乙烯亚胺 (PEI) 因具有转染效率高等优点，是目前应用最广泛的非病毒载体之一。很明显，聚乙烯亚胺 (PEI)的组成如分子量大小和分布会对其应用性能产生重要影响。例如，基因转染效率及转导过程中产生的细胞毒性与PEI的分子量及其分布关系密切。PEI的分子量分布范围很广，从低分子量的数百Da到几十万Da，其分子量测定有许多困难。常用的黏度法，操作步骤繁琐、误差高且只能测得粘均分子量Mv，而得

3、不到分子量分布的信息。采用TOF-MALDI方法可以得到低分子量PEI的分子量分布信息，但是该方法对高分子量PEI响应很低，很难得到有价值的信息。凝胶色谱法是简便快捷的测定多种分子量和分子量分布的有效方法，但是PEI不溶于用于该色谱的通用溶剂四氢呋喃，只能选用重复性相对低的水性GPC方法，即GFC。由于PEI类高分子易和许多商品色谱柱产生吸附，它的凝胶色谱分析并不容易实现。Kumoi等人 Kumoi, Sadakatsu; Tsutsumi, Yukihiro, Toyo Soda Kenkyu Hokoku (1980), 24(1), 43-9利用0.1-0.4M 乙醇胺和乙酸水溶液在pH

4、 5.1的条件下在TSK-Gel G-2000 PW + G-3000 PW色谱柱上分析了分子量为140-20,000之间的PEI的分子量和分子量分布，其中分子量的分析采用激光光散射检测器。他们发现，丙氧基化的PEI与疏水性的凝胶固定相没有吸附相互作用，所以更易于分析。Guise等人在硅胶柱上研究了阳离子聚合物聚酰胺、表氯醇树脂、聚乙烯亚胺和聚乙烯吡啶的分析 Guise, G. Bruce; Smith, Geoffrey C.; Journal of Chromatography (1982), 235(2), 365-76.，发现不但pH值、离子强度和色谱柱对分离结果影响显著，盐的种类和高

5、分子的浓度影响也很大。最近，张志群采用商品PEI为标样、利用水性GPC在Ultrahydrogel色谱柱上分析了PEI-25K供试品和自制的聚乙烯亚胺 张志群，现代医学进展，8（2），356-357 （2008），所得结果虽比文献结果更接近理论值且实现了对自制化合物的分析，但是测试结果和理论值或者厂家提供结果偏差仍较大。综上所述，上述各种方法虽然一定程度上实现了PEI高分子的分析，但是没有对结果准确性尤其是重复性等方面的评价，且一些方法使用较特殊的手段导致难以在一般的分析实验室普及应用。本文采用TSK-gel G300PWxl和 G6000PWxl色谱柱、利用通用的聚乙二醇标样实现了对PEI的

6、分析分离，考察了影响所得结果的关键因素且发现了影响重复性的主要因素，所得结果有较好的参考价值。实验部分1. 药品及试剂聚乙烯亚胺（PEI）为日本触媒产高分子化合物，分子量分别为1200、1800、10000和 70000。聚乙二醇标样为？公司产品，分子量从？到？。流动相的相关信息？2. 仪器设备水性凝胶色谱仪为Waters 515 pump；色谱柱为TSK-gel G3000PWxl和TSK-gel G6000PWxl结果与讨论1. 色谱柱种类的影响2. 流动相种类的影响根据文献报道的GPC对样品的检测结果，可以用THF作流动相用GPC进行检测。 我们分别将原料PEI和PEG-PEI的共聚物产

7、品用THF溶解配制成0.5%的溶液，GPC检测结果如图1和图2：图1（PEI10000,Mw=10000）图2（PEG-PEI共聚物）以上两图中不论是原料PEI10000还是与PEG的共聚物,在GPC的色谱图中响应值都非常低,这样就无法标定它们的分子量.在这种情况下,我们经过讨论认为: PEI及它和PEG的共聚物都是水溶性的,可以考虑用GFC进行检测.我首先选用纯水作流动相,样品用纯水溶解配制0.5%的溶液，GFC检测结果如下:（RI检测）PEI1800PEI10000BLANK图3（PEI1800,Mw=1800）图3中原料PEI1800、PEI10000与空白的色谱峰几乎完全相同，即没有响

8、应，所以该条件不适用于PEI分子量的测定。为了进一步优化样品的色谱峰，我又配制了0.05%氨水溶液作为流动相再次对样品进行检测，见图4、图5图4（PEI10000）图5（PEG-PEI共聚物）图4和图5的色谱峰杂乱且响应值又小，所以断定该条件不适用于检测PEI.我们试着将PEI样品用PH=4.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液溶解，发现溶解性很好，于是就将溶解好的PEI10000和PEG-PEI共聚物进行检测，见图6、图7图6（PEI10000）图7（D0627-1）我们发现用PH=4的缓冲溶液作流动相检测PEI，色谱峰响应值很大，但是峰型不是很对称，有拖尾现象。通过对以上三种条件的比较，我认为PH=4

9、.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液是最佳检测条件，决定用PEG标样去校正样品的分子量。将10个PEG标样用流动相配制成0.2%的溶液，充分溶解后进行检测，见图8图8（PEG标样，PH4.0）上图中PEG标样在该条件下的分离是比较好的。我将PEI1800，PEI10000,PEI70000三个分子量不同的样品分别用PH=4的缓冲溶液溶解（浓度0.5%），进行检测，见图9PEI10000PEI70000PEI1800图9（浓度0.5%）检测后发现两个问题：问题1.三个样品的保留时间非常接近(见图9)，而且校正的分子量与样品的实际分子量相差很大，见下表： Mw 名称 实际Mw检测MwPEI180018001

10、824PEI10000100002310PEI70000700002649问题2. PEI10000在0.3%和0.5%的浓度下检测到的色谱峰型有很大的差别，见图10： 0.5%0.3%图10在上述条件下PEI与色谱柱的吸附作用小，导致不同分子量的样品会在同一保留时间出峰，无法分离；可以考虑适当改变流动相的PH值，以找到更合适的检测条件。3. 流动相pH值的影响我们分别配制了五种不同PH值的缓冲溶液作流动相，对四个PEI样品进行了检测、比较。六种不同PH值的缓冲溶液检测的PEI样品色谱图如下：（绿色-PEI1200；黑色-PEI1800；红色-PEI10000；蓝色-PEI70000） PH4

11、.0（0.02mol/L乙酸钠）PH4.5（0.22mol/L乙酸钠）PH4.85（0.17mol/L乙酸钠）PH6.0（1.33mol/L乙酸钠）PH7（0.05mol/L磷酸二氢钾）PH8（0.07mol/L乙酸钠）四个PEI样品在六种不同流动相中检测到的色谱图中主峰的保留时间（min），见下表： 流动相样品名称 PH4PH4.5PH4.85PH6.0PH7PH8PEI120026.53726.89535.38328.855PEI180026.48926.15926.56626.45835.46628.773PEI1000025.67623.92124.71424.08236.16629.

12、051PEI7000025.42815.71717.42415.7535.72829.033通过对以上六种不同流动相中检测到的色谱峰的峰型以及分离情况的比较，认为PH4.5和PH6.0 的条件比较适合PEI的检测。为了确认一种最佳测试条件，我们又分别用这两种流动相将4个共聚物样品（D0627 ;D0731 ;D1123 ;EX76）溶解，检测结果如下：PH6.0 PH4.5从以上两种不同PH值的流动相对4个不同分子量共聚物的检测色谱图可以看出：1.PH6.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液作流动相无法对共聚物产品进行分离；2.PH4.5的醋酸醋酸钠缓冲溶液提高了色谱柱对样品的分离效率，通过色谱图可以比较明显的看出4个共聚物样品的分子量差异。综上所述：PH4.5的缓冲溶液是检测PEI、PEI-PEG共聚物样品分子量的最佳条件。将10个PEG标样用PH4.