western+blot+ppt

1、Western blot 实验技术 Western blot Western blot 原理原理nWestern Blot采用的是变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质混合物，经过SDS-PAGE分离的蛋白质被到转移到固相支撑物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持膜上蛋白质或多肽的抗原性质不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与其对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的二抗体起反应，经过底物显色以检测特异蛋白质表达水平。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理原理： SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当 SDS

2、与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素M丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 MSDSM配胶的Tris缓冲液MTEMEDM过硫酸铵(时间)MTris-甘氨酸电泳缓冲液凝胶成份凝胶成份分子筛效应分子筛效应凝胶浓度凝胶浓度 ，凝胶孔径，凝胶孔径，机械强度，机械强度 T

3、EMEDTEMED促使促使APAP形成氧自由基，进而催形成氧自由基，进而催化化AcrAcr单体为长链，单体为长链，BisBis再使长链彼此再使长链彼此联成具有一定孔径的聚丙烯酰胺凝胶联成具有一定孔径的聚丙烯酰胺凝胶（PAGPAG）。）。 AP-TEMED系统系统单体单体：丙烯酰胺（：丙烯酰胺（Acr）交联剂交联剂：甲叉双丙烯酰胺（：甲叉双丙烯酰胺（Bis）催化剂催化剂：过硫酸铵（：过硫酸铵（AP）诱发剂诱发剂：四甲基乙二胺（：四甲基乙二胺（TEMED）氧自由基氧自由基聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶注：注：O2为终止剂为终止剂-+上样缓冲液（上样缓冲液（Loading buffer）浓浓缩缩胶胶分

4、分离离胶胶Tris/HCl pH 6.8Tris/HCl pH 8.8Tris-HCl pH6.8; 甘油；甘油；SDS；巯基乙醇；溴酚蓝；巯基乙醇；溴酚蓝 转膜缓冲液（转膜缓冲液（transfer buffer） tris-HCl; glycine 电泳缓冲液（电泳缓冲液（running buffer） tris-HCl; glycine;SDS ( Acrylamide;bis; SDS; AP; TEMED)SDS-PAGE“两胶三缓冲两胶三缓冲”sample电泳三离子： glycine- Cl- Protien-SDS-带负电的蛋白胶束带负电的蛋白胶束“消除电荷差、构像差”-+浓浓缩缩

5、胶胶分分离离胶胶pH 6.8pH 8.8SDS-PAGECl-电泳三离子： glycine- Cl- Protien-glycine-protein- HCl全部解离成全部解离成Cl-，迁移最快，走在最前，迁移最快，走在最前-“先导离子先导离子” 甘氨酸仅有甘氨酸仅有0.11%解离成解离成Gly-，迁移最慢，走在最后，迁移最慢，走在最后- “尾随离子尾随离子”重点理解：先导快离子后方重点理解：先导快离子后方-离子强度离子强度 -低电导区低电导区 -电场强度电场强度 ，使使glycine和和protein加速移动。加速移动。蛋白样品受蛋白样品受“夹板气夹板气”，被，被“压缩压缩”，达，达“稳态稳

6、态”浓浓缩缩胶胶分分离离胶胶 甘氨酸大量解离，迁移加快，走在蛋白前，跟着甘氨酸大量解离，迁移加快，走在蛋白前，跟着Cl-跑了。跑了。 样品蛋白在均一的电场强度和样品蛋白在均一的电场强度和PH中中“尽情尽情”泳动泳动 根据样品成员的分子大小，不同的迁移率，实现分离根据样品成员的分子大小，不同的迁移率，实现分离 （分子越小，跑得越快（分子越小，跑得越快 ）Cl-glycine-protein-小分子小分子大分子大分子中分子中分子高E低E压缩压缩, ,分离效应分离效应大致流程大致流程提取与处理样品蛋白提取与处理样品蛋白电泳分离样品蛋白电泳分离样品蛋白转移蛋白至杂交膜转移蛋白至杂交膜封闭非特异性位点封

7、闭非特异性位点一抗孵育一抗孵育洗涤洗涤二抗孵育二抗孵育 洗涤洗涤底物显色或曝光检测底物显色或曝光检测E鼠兔固相载体固相载体人源目的蛋白人源目的蛋白兔源二抗兔源二抗(抗鼠抗鼠Fc段段)鼠源一抗鼠源一抗HRP明确蛋白样品的来源（组织；明确蛋白样品的来源（组织；细胞；体液）细胞；体液）选择适当的裂解方式（研磨；选择适当的裂解方式（研磨；超声；剪切；冻融等）超声；剪切；冻融等） 选择适当的裂解选择适当的裂解buffer（SDS；RIPA；NP-40；商品化试剂盒）；商品化试剂盒）加入合适的蛋白酶抑制剂加入合适的蛋白酶抑制剂（Aprotinin ；PMSF；leupeptin ; pepstantinA

8、; PIC; EDTA；EGTA）蛋白样品提取问题蛋白样品提取问题蛋白位置蛋白位置推荐推荐bufferbuffer全细胞全细胞NP-40 or RIPANP-40 or RIPA胞浆（可溶性蛋胞浆（可溶性蛋白）白）Tris-HClTris-HCl胞浆（骨架结合胞浆（骨架结合蛋白）蛋白）Tris-TritonTris-Triton膜蛋白膜蛋白NP-40 or RIPANP-40 or RIPA核蛋白核蛋白RIPA or RIPA or 核蛋白核蛋白提取试剂盒提取试剂盒线粒体蛋白线粒体蛋白RIPA or RIPA or 线粒体线粒体分离试剂盒分离试剂盒n浓缩、纯化、脱盐浓缩、纯化、脱盐:离心；离心

9、；超滤超滤; 透析透析; 冻干。冻干。n变性样品变性样品:qSDS：阴离子表面活性剂- 断开氢键； 取消疏水作用 ； 去除多肽折叠；屏蔽蛋白电荷量。q高温：高温： 95100,515min（大多数蛋白）； 70,510min（多次跨膜蛋白）n还原样品还原样品:q-巯基乙醇：巯基乙醇：强还原剂-断开二硫键,破坏二三级结构q二硫苏糖醇二硫苏糖醇(DTT) :还原剂-断开二硫键,破坏二三级结构蛋白样品处理问题蛋白样品处理问题蛋白样品处理问题蛋白样品处理问题待测蛋白状态待测蛋白状态凝胶条件凝胶条件上样上样bufferbuffer电泳电泳bufferbufferReduced-Reduced-Denat

10、uredDenatured还原，变还原，变性性含含-巯基乙醇或巯基乙醇或DTTDTT，含，含SDSSDS含含SDSSDSReduced-Reduced-NativeNative还原，不还原，不变性变性含含-巯基乙醇或巯基乙醇或DTTDTT，不含，不含SDSSDS不含不含SDSSDSOxidizedOxidized- -DenaturedDenatured不还原，不还原，变性变性不含不含-巯基乙醇或巯基乙醇或DTTDTT，含，含SDSSDS含含SDSSDSOxidized-Oxidized-NativeNative不还原，不还原，不变性不变性不含不含-巯基乙醇或巯基乙醇或DTTDTT，不含，不含

11、SDSSDS不含不含SDSSDS 根据目的蛋白的状态确定电泳条件：根据目的蛋白的状态确定电泳条件：u 抗体识别蛋白的空间型抗原表位时，不可加热及SDS变性u 抗体识别蛋白的氧化状态时，就不可加还原剂（ -巯基乙醇或DTT）n胶类型的选择胶类型的选择：PAGE、SDS-PAGE、tricine-SDS-PAGE 、IEF、2Dn胶的浓度选择胶的浓度选择：蛋白大小、数目、个人经验n配胶时间配胶时间：q忌即配即用（防凝固不均）；q忌长期冰箱放置（防SDS结晶）；q保存4天（防SDS水解聚丙烯酰胺）n配胶温度配胶温度：室温或37n配胶试剂配胶试剂：qAP：现用现配或分装冻存qTEMED ：最后加,边加

12、边晃qTris-HCl: 上下胶pH勿混(上6.8/下8.8)q丙烯酰胺: 神经毒性配胶问题配胶问题蛋白分子量蛋白分子量（ku）凝胶浓度凝胶浓度（）（）4-402010-431512-601220-801025-200857-2125蛋白上样问题蛋白上样问题u 上样的总蛋白量上样的总蛋白量根据蛋白表达丰度及研究目的调整适当的蛋白上样量 （ 20-70 ug 细胞/组织裂解液； 100 ng 纯化蛋白；）u 上样的总体积上样的总体积 130 ul(小板)； 10 ul(大板）u 各孔上样量一致各孔上样量一致 每孔上样量尽量保持一致，以防条带倾斜u 上样孔的选择上样孔的选择 忌烂孔忌烂孔（因氧气进

13、入）、 忌不洁孔忌不洁孔（多因上胶位置玻璃未洗净）、 忌不齐孔忌不齐孔（因上样孔底部有气泡、碎胶、 未冲孔、不均匀缩胶、不正确拔梳拔梳）等特点特点PVDF膜膜NC膜膜尼龙膜尼龙膜灵敏度和分辨率高高高高背景低低低较高蛋白结合能力100-200ug/cm2（适用于SDS存在时与蛋白结合）80-100ug/cm2400ug/cm2机械强度强强干的膜易脆软而结实溶剂抗性强强差差使用前是否需要浸润缓冲液润湿缓冲液润湿适用染色方法胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁、考马斯亮兰胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁不能用阴离子染料适用检测方法显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测显色法、化学发光、荧

14、光、放射性显色、化学发光、放射性适用范围 普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋白质测序、氨基酸分析普通蛋白WB、氨基酸分析。0.1um膜适用于7kDa以下蛋白低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸检测常用价格高较低低膜的选择问题膜的选择问题PVDFPVDF膜的选择问题膜的选择问题转膜缓冲液问题转膜缓冲液问题最好现用现配最好现用现配!夹心结构问题夹心结构问题n夹心结构夹心结构: 正滤、膜、胶、滤负n大小：大小： 滤纸=膜=胶n注意事项注意事项: 膜用甲醇预处理 膜随时保持湿润（传统） 尽量使用新滤纸 各层叠放次序正确 不能有气泡n平衡问题：平衡问题：膜与胶泡于转膜缓冲液中 5120minmi

15、n(蛋白分子愈小,时间愈短) 纤纤维维垫垫转膜效果问题转膜效果问题透视法透视法, 考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色丽春红（可逆）丽春红（可逆）酰胺黑酰胺黑CPTS 总蛋白染色总蛋白染色. l丽春红丽春红S染色法：带负电丽春红染色法：带负电丽春红S与带正电的氨基酸残基及蛋白的非极性区结合与带正电的氨基酸残基及蛋白的非极性区结合,从而形成从而形成红色条带红色条带. l透视法：透视法：干燥干燥PVDF膜后，膜后，20%甲醇浸湿；甲醇浸湿；蛋白区透明方便、可逆、蛋白不损、无需染料蛋白区透明方便、可逆、蛋白不损、无需染料转膜方式：转膜方式：q电泳转移(半干转半干转、湿转)q虹吸转移转膜电压：转膜电压： 10

16、25V（半干转）转转膜电流： 12mA/cm2，10% gel转膜问题转膜问题虹吸转移膜膜滤纸滤纸胶胶-+膜膜滤纸滤纸胶胶滤纸滤纸转膜问题转膜问题转膜时间转膜时间 根据蛋白分子量、胶浓度、具体情况决定。根据蛋白分子量、胶浓度、具体情况决定。检测多个蛋白时，需进行切胶，分别转膜。检测多个蛋白时，需进行切胶，分别转膜。d使用使用0.2m的的PVDF转印膜（转印膜（PSQ，呈淡蓝色），呈淡蓝色）d转移缓冲液中适当增加甲醇（防止平衡时小分子流失）转移缓冲液中适当增加甲醇（防止平衡时小分子流失）d转移缓冲液中适当减少转移缓冲液中适当减少SDS（防止（防止SDS抑制膜与蛋白的结合）抑制膜与蛋白的结合）d降

17、低凝胶的平衡时间（降低凝胶的平衡时间（10min10min）d降低电泳转膜时间（降低电泳转膜时间（25min）dtricine-SDS-PAGE小分子蛋白的小分子蛋白的 “流穿流穿”问题问题封闭问题封闭问题, 定义定义: 使用含有惰性蛋白质或非离子去污剂的缓冲液（PBST/TBST）封闭杂交膜上的非特异性位点, 举例举例:non-fat milk(脱脂奶粉 BSA（胎牛血清） casein（酪蛋白）Tween-20（吐温-20） gelatin(明胶) 商业化的封闭试剂 封封 闭闭牛牛E牛兔固相载体固相载体人源目的蛋白人源目的蛋白兔源二抗兔源二抗(抗牛抗牛Fc段段)牛源一抗牛源一抗HRP兔E兔

18、源二抗兔源二抗胎牛血清胎牛血清封闭问题封闭问题注意事项注意事项:l 抗磷酸化抗体不能用酪蛋白或含磷抗磷酸化抗体不能用酪蛋白或含磷酸酶的封闭液酸酶的封闭液.l 生物素、刀豆蛋白交联二抗不用脱脂生物素、刀豆蛋白交联二抗不用脱脂牛奶牛奶l 同种封闭液的批间差异同种封闭液的批间差异l 完全溶解、过滤去除难溶颗粒完全溶解、过滤去除难溶颗粒l 牛、羊、马源的一抗尽量不用牛、羊、马源的一抗尽量不用BSA或或脱脂奶粉脱脂奶粉 一抗一抗：根据目的蛋白的性质、种属选择合适一抗。根据目的蛋白的性质、种属选择合适一抗。注意一抗的种属，单注意一抗的种属，单/多克隆及适用方法等。多克隆及适用方法等。根据说明书推荐或预实验

19、优化最佳稀释比例。根据说明书推荐或预实验优化最佳稀释比例。加叠氮钠，加叠氮钠，分装保存，忌反复冻融。分装保存，忌反复冻融。 二抗二抗：根据一抗的来源种属以及根据一抗的来源种属以及Ig亚型（亚型（G、A、M等）选择合适二抗。等）选择合适二抗。选择合适的标记物（选择合适的标记物（HRP 、AP、 GOD、生物素、生物素、荧光素、胶体金）荧光素、胶体金）加或不加硫柳汞，加或不加硫柳汞， 分装保存，忌反复冻融。分装保存，忌反复冻融。根据说明书推荐或预实验（根据说明书推荐或预实验（Dot blotting）优化最佳稀释比例。）优化最佳稀释比例。n 抗体问题抗体问题Dot blot设置合适的对照组设置合适

20、的对照组阳性对照阳性对照：明确表达目的蛋白，用于检测抗体的工作效率阴性对照阴性对照：明确不表达目的蛋白，用于检测抗体的特异性二抗对照二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性及stripping效果内参对照内参对照：检测实验体系是否正常工作、进行半定量分析空白对照空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的封闭及 stripping效果对照问题对照问题内参问题内参问题内参名称内参名称分子量大小分子量大小适用范围适用范围beta-actin43kDa胞浆和全细胞胞浆和全细胞GAPDH30-40kDa胞浆和全细胞胞浆和全细胞Tubulin55kDa胞浆和全细胞胞浆和全细胞VCDA1/Porin31kDa线

21、粒体线粒体COXIV16kDa线粒体线粒体Lamin B166kDa细胞核细胞核TBP38kDa细胞核细胞核h根据内参蛋白与目的蛋白的分子大小选择h根据内参蛋白的存在部位h确定内参不受实验处理因素影响z适用于检测两种分子量接近的蛋白适用于检测两种分子量接近的蛋白z适用于检测目的蛋白的特定修饰状态适用于检测目的蛋白的特定修饰状态z50,150200rpm,30min(需加需加-巯基乙醇巯基乙醇)z商品化温和的洗脱液商品化温和的洗脱液(37 ,60rpm,10,60rpm,1030min) z若不换抗体若不换抗体,可不可不Stripping而直接封闭加抗体而直接封闭加抗体检测；检测；z通过二抗对照

22、及空白对照检测通过二抗对照及空白对照检测Stripping效果；效果；StrippingStripping问题问题L 无信号无信号(白板白板)或或 弱信号弱信号(不是白板胜似白板不是白板胜似白板)L 高背景高背景(黑板、几尽黑板黑板、几尽黑板)L 非特异性条带（杂带）非特异性条带（杂带）L 脏带（操作）、补丁染色脏带（操作）、补丁染色L 表情条带（微笑、皱眉）表情条带（微笑、皱眉）L 闹鬼（鬼带、鬼影）闹鬼（鬼带、鬼影） L 拖尾、纹理、偏斜、过长、过粗条带拖尾、纹理、偏斜、过长、过粗条带L 其它其它WBWB常见问题常见问题样品样品l样品中无目的蛋白或目的蛋白降解样品中无目的蛋白或目的蛋白降解

23、- 设立阳性对照设立阳性对照检查封闭液检查封闭液是否有蛋白酶是否有蛋白酶使用蛋白酶抑制剂使用蛋白酶抑制剂l上样量不够或蛋白表达丰度较低上样量不够或蛋白表达丰度较低-增加上样量增加上样量浓缩纯化样品浓缩纯化样品2. 2. 转膜转膜l转膜不完全转膜不完全- - 转膜后使用丽春红染色转膜后使用丽春红染色使用蛋白质使用蛋白质MarkerMarker.l洗涤过度洗涤过度-减少洗涤时间和次数减少洗涤时间和次数. .3. 3. 封闭封闭l封闭过度封闭过度- - 减少封闭液浓度及封闭时间减少封闭液浓度及封闭时间更换封闭试剂更换封闭试剂4. 4. 抗体孵育和检测头抗体孵育和检测头l抗体浓度和孵育时间不够抗体浓度

24、和孵育时间不够- 增加抗体浓度增加抗体浓度延长孵育时间延长孵育时间l一抗不工作一抗不工作-设置阳性对照设置阳性对照l二抗不工作二抗不工作-和其他一抗配合检测二抗是否工作和其他一抗配合检测二抗是否工作l一抗一抗/ /二抗不匹配二抗不匹配-检查抗体的来源和亚型。正确选择二抗检查抗体的来源和亚型。正确选择二抗l底物失活或灵敏度低底物失活或灵敏度低- - 重新配制有效的底物重新配制有效的底物更换高灵敏度底物更换高灵敏度底物无信号无信号/弱信号问题弱信号问题(白板白板)1.1.封闭封闭l封闭时间不够：封闭时间不够：延长封闭时间延长封闭时间l优化封闭试剂的类型和浓度优化封闭试剂的类型和浓度l封闭液和抗体有

25、交叉反应：封闭液和抗体有交叉反应：更换封闭液更换封闭液；加加Tween-20Tween-20减少交叉反应减少交叉反应l磷酸化抗体不能使用含有酪蛋白的封闭液：磷酸化抗体不能使用含有酪蛋白的封闭液：推荐推荐BSABSA封闭封闭2.2.抗体孵育和检测抗体孵育和检测l一抗一抗/ /二抗二抗浓度太高：浓度太高：降低抗体浓度降低抗体浓度( (主要是二抗主要是二抗) )l孵育温度太高：孵育温度太高：建议建议4 4度孵育过夜度孵育过夜3.3.其他其他l洗膜不充分：洗膜不充分：5 5* *3mins3mins，多次短时间的洗膜，多次短时间的洗膜l曝光时间过长：曝光时间过长：缩短曝光时间缩短曝光时间l出现干膜现象

26、：出现干膜现象：保证膜充分浸透，避免出现干膜保证膜充分浸透，避免出现干膜l二抗非特异性：二抗非特异性：设置只加二抗对照设置只加二抗对照背景高问题背景高问题(黑板黑板)背景高背景高底片曝光1.1.样品制备样品制备l二聚体或多聚体：二聚体或多聚体：还原变性电泳还原变性电泳l蛋白不同剪切体或蛋白不同剪切体或isoforms isoforms : :实验论证实验论证l蛋白降解：蛋白降解：使用新鲜样品加蛋白酶抑制剂使用新鲜样品加蛋白酶抑制剂l上样量过大：上样量过大：减少上样量减少上样量2.2.封闭封闭l封闭不充分：封闭不充分：优化封闭时间和浓度优化封闭时间和浓度3.3.抗体孵育和检测抗体孵育和检测l一抗

27、一抗/ /二抗浓度过高：二抗浓度过高：降低抗体浓度降低抗体浓度 ( (主要是一抗主要是一抗) )l抗体没有经过纯化抗体没有经过纯化: :纯化或更换抗体纯化或更换抗体l二抗非特异性结合：二抗非特异性结合：使用二抗对照使用二抗对照4.4.其他其他l洗膜保证充分洗膜保证充分杂带问题杂带问题 适当稀释一抗适当稀释一抗-提高特异性提高特异性 适当稀释二抗适当稀释二抗-降低背景降低背景二聚体或亚型二聚体或亚型杂杂带带目的条带目的条带操作问题操作问题l一抗浓度不够一抗浓度不够: :增加一抗浓度增加一抗浓度l抗体孵育不均匀抗体孵育不均匀: :摇床摇床l干膜干膜: : 保持湿润保持湿润l 细菌污染细菌污染: :

28、加防腐剂或更换抗加防腐剂或更换抗体体配制新鲜缓冲液配制新鲜缓冲液补丁染色问题补丁染色问题补丁染色补丁染色n微笑条带微笑条带：主要由于凝胶中部聚合不完全，多见于较厚凝胶，也可由于上样量过大- 室温静置充分凝固；调节上样量n皱眉条带皱眉条带：凝胶和玻璃挡板底部有气泡或凝胶两边聚合不完全或上样量过大-在两板间加入适量缓冲液完全凝胶重新配胶调整上样量表情条带表情条带单孔皱单孔皱眉眉两边皱眉两边皱眉微笑条带微笑条带单孔微笑单孔微笑n拖尾现象：拖尾现象：主要是A.样品融解效果不佳; B.电泳缓冲液时间过长; C.分离胶浓度过大引起-加样前离心 加适量样品促溶剂重配电泳缓冲液降低凝胶浓度。n弥散现象：弥散现

29、象：样品不溶性颗粒或凝固不充分或制胶问题- 加样前离心； 加适量样品促溶剂 充分凝固 重新配胶更换电泳液。 拖尾及弥散条带拖尾及弥散条带拖尾拖尾弥散弥散n “鬼带鬼带” ：A大分子构象复杂蛋白质分子未完全变性或轻微复性；B高含量高纯度蛋白存在-充分变性还原；C 抗体的重轻链(加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化；分离或过滤样品；抗体来源)n“鬼影鬼影” (条带的中心透亮)：上样量过大、目的蛋白过多-适当减少上样量鬼问题鬼问题鬼鬼影影目的条带目的条带鬼带鬼带n条带偏斜条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜或蛋白上样不均-正确安装、加样、上样均匀n条带两边扩条带两边扩散散：加样量过多-减少上样量偏斜与扩散偏斜与扩散条带偏斜条带