鞣质类化合物研究的进展情况

1、摘要】 鞣质又称丹宁或鞣酸，是一类广泛存在于植物中的能与蛋白质或生物碱结合成沉淀的多元酚类化合物。因其能与生兽皮中的蛋白质结合而形成致密、柔韧、不易腐败、有良好透气性和透水性的皮革，因此称其为鞣质。目前世界上形成了以日本冈山大学奥田拓男等为代表的鞣质专门研究室，使得鞣质成为十分活耀的研究领域。至今已分离鉴定鞣质化合物400多种，新发现的化合物数量之多，类型之广，都超过了以往的总和。鞣质的研究之所以受到重视，这是由其重要性所决定的，本文主要介绍当前鞣质研究的进展情况，对鞣质的各种结构类型、提取分离方法、鉴定、含量测定方法及生物活性和临床应用等做一综述，重点对鞣质的生物活性和临床应用进行了探讨。【

2、关键词】 鞣质类化合物;生物活性;含量测定1鞣质类化合物的概述及发展史1.1鞣质的概述鞣质又称单宁，是存在于植物体内的一类结构比较复杂的多元酚类化合物。具有涩味和收敛性。鞣质能与蛋白质结合形成不溶于水的沉淀，故可用来鞣皮，即与兽皮中的蛋白质相结合，使皮成为致密、柔韧、难于透水且不易腐败的革，因此称为鞣质。因其属于多元酚类大分子化合物，分子表面具有多个酚羟基，因此它的生物活性应与这些酚羟基有较大的联系。鞣质及相关的多元酚除具有结合活性外，还能使与之共存的金属离子减少。这是由于鞣质的多元酚结构氧化成醌式结构所致，如鞣酸盐可氧化成邻苯醌类。鞣质的一些重要活性基于其根本的脱氧作用，脱氧作用是由于鞣质向

3、共存物形成的离子供氢而形成稳定的自由基。据报道，鞣质的结构不同导致其不同的生物活性1。1.2鞣质的结构类型鞣质又称鞣酸，是一类复杂的高分子多酚类化合物能与蛋白质结合，具有涩味和收敛性。目前将鞣质分为水解鞣质、缩合鞣质以及缩合鞣质与水解鞣质中的葡萄糖以碳碳键连接而成的鞣质。水解鞣质由酚酸及其衍生物与葡萄糖或多元醇通过甙键或酯键而形成的化合物。因此，可被酸、碱、酶(如鞣酶、苦杏仁酶等)催化水解，依水解后所得酚酸类的不同，又可分为没食子酸鞣质和逆没食子酸鞣质两类。含这类鞣质的生药有五味子、没食子、柯子、石榴皮、大黄、桉叶、丁香等。缩合鞣质这是一类由儿茶素或其衍生物棓儿茶素等黄烷-3-醇化合物以碳-碳

4、键聚合而形成的化合物。通常三聚体以上才具有鞣质的性质。由于结构中无甙键与酯键，故不能被酸、碱水解。缩合鞣质的水溶液在空气中久置能进一步缩合，形成不溶于水的红棕色沉淀，称为鞣红。当与酸、碱共热时，鞣红的形成更为迅速。如切开的生梨、苹果等久置会变红棕色，茶水久置形成红棕色沉淀等。含缩合鞣质的生药更广泛，如儿茶、茶叶、虎杖、桂皮、四季青、桉叶、钩藤、金鸡纳皮、绵马、槟榔等。因为鞣质的分子量较大，给中药制剂的提纯，液体药剂的澄明度都带来了很多麻烦。2鞣质类化合物的研究现状随着实验手段的不断提高，越来越多的鞣质单体被分离提取，逐一确定其结构，并修正过去的错误结论。与此同时，鞣质作为一种具有收敛止血、止泻

5、、抗菌、保护粘膜等作用，有时也用作生物碱及重金属中毒的解毒剂。其药用有效成分也逐渐为人们所认识。迄今为止，已发现了400多种新的鞣质类化合物2。2.1国外鞣质的发展现状目前鞣质的抗艾滋病(AIDS)研究令人关注，低分子量的水解鞣质，尤其二聚鞣花鞣质可作为口服剂来抑制AIDS，仙鹤草素在浓度0.01g/L0.1g/ L 时就可起到最强的抑制AIDS 病毒HIV生长的效果3。鞣质能清除生物体内过剩的自由基，维护细胞膜的流动和蛋白质的构象，防止辐射诱发的DNA 断裂，从而在抑制脂质过氧化、心血管病、抗癌、抗突变、抗衰老、抗白内障等方面有独到功效。一些水解鞣质，如：鞣酸、云实素、贾木鞣花素、诃子酸本身

6、就有降低血压的作用，提纯物活性高于原草药煎剂4。近几年国外对鞣质药理活性的研究方兴未艾，鞣质的药理价值被不断开发，其应用前途非常广泛。目前世界上形成了以日本冈山大学奥田拓男等为代表的鞣质专门研究室，使得鞣质成为十分活耀的研究领域。2.2我国鞣质类化合物的发展及其现状目前，国内对鞣质类化合物研究较少，尚处于起步阶段，在研究方面还局限于鞣质的提取、分离和鉴定，基本掌握其理化性质在应用方面局限于皮革、食品和某些金属工业领域。鞣质的药理活性研究以及鞣质在医药方面应用的研究还落后于其他国家。我国是一个中草药大国，各种植物资源非常丰富，如何更好地利用鞣质、更充分地开发具有广阔应用前景的可再生绿色资源、提高

7、社会的经济效益将是摆在我们面前的一项急迫的任务。3鞣质的提取分离3.1鞣质的提取可利用Me：CO-H：O(5：5 7：3)作溶剂来提取可水解鞣质。将植物药研碎，过筛，用上述溶剂于室温冷浸或渗漉，将冷浸液减压浓缩至一定程度，分别用乙醚或氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，乙醚或氯仿可去除亲脂性杂质及色素等，乙酸乙酯和正丁醇即为含鞣质粗品的提取液。3.2鞣质的分离3.2.1凝胶柱层析用于可水解鞣质分离的凝胶多为葡聚凝胶，其中最常用的为Sephadex LH-20。主要用于不同聚合度鞣质的分离。分离时受每一鞣质的吸附力的影响而不受凝胶过滤的影响。缺点是不稳定，对某些鞣质有很强的吸附力，特别对大分子缩合鞣质，

8、不易用有机溶媒从柱上洗脱，凝胶使用寿命缩短。聚乙烯凝胶Toyopearl HW-40可用碱水再生，可长期使用。这些凝胶柱进行液相层析或与液滴逆流层析(DCCC)配合使用，可将混合鞣质很好的分离。3.2.2大孔吸附树脂层析Piaion HP-20和MCI-gel CHP-20P 经常被用于一些鞣质异构体的分离，它们均用不同比例的MeOH-H：O 和Et0H-CH3COCH3作为洗脱剂。3.2.3液滴逆流色谱法和离心分离色谱法(CPC)(CPC)：DCCC法目前已成为可水解鞣质类化合物分离中的一种常规必需手段，常以不同比例的n-BuOH：n-PmH：H2o做漉动相。优点是不是需要固体支持剂，避免因

9、各物质的吸附而造成的鞣质损失，缺点是展开时间长。CPC法是在DCCC法的基础上发展起来的，在离心机内进行的逆流色谱法。展开时间可缩短到DC.CC的l/4或1/5，溶媒用量少，对分离低聚的水解鞣质效果特别好。3.2.4高效液相色谱法奥用拓男等利用Shimadzu-Dupont-LC-1型高效液相色谱仪，以烃聚合物为填充剂进行反相高效液相层析，对从日本天然药Geranium thunbergii中分离出来的镌牛儿索(Oeraniin)和从野梧桐(Mallottusjaponicus)中分离出来的mallotusinic acid，mallotinic acid及诃子(termina.1ia che

10、bula)鞣质myrobalans进行研究，结果表明，当用100cmx7.9cm.I.D柱、烯聚合物(Zipax Hcp)为填充剂和移动相0.5M KH2PO4(1L)-EtOH(10m1)-EtOAc(1m1)时，尽管鞣质酸和没食子酸被溶剂峰掩盖，所研究的各种逆没食子酸和六羟基联苯二甲酸均得到互相分离。3.2.5鞣质去除方法在中药的提取过程中，鞣质常被作为杂质而除去，除鞣方法归纳起来有7种：碱性醇沉、透析、酸沉、石灰硫酸沉淀、铅盐沉淀、聚酰胺吸附、明胶沉淀及氧化镁吸附法。胡冠时在明胶沉淀法的基础上改进的在明胶中加入甲醛，使明胶分子的游离氨基和甲醛分子交联，空间结构也相应改变，直链产生旋转、折

11、叠，生成变性明胶，不溶于水，可选择性的与鞣质结合。为使变性明胶有足够多的表面积，并采了微球化工艺，制定固相多孔微球，提高了除鞣效率。另外，李俊等采用先明胶、后硅藻土的处理方法也获得良好的除杂效果。4鞣质的鉴定鞣质分为可水解鞣质、缩合鞣质和新型鞣质，在对鞣质组分进行详尽的鉴定之前，一般可通过一些特殊的反应对鞣质进行类型分析。常用的反应有三氯化铁反应、明胶氯化钠反应、溴水反应、乙酸铅-硫酸铁铵反应、香草醛浓硫酸反应、对二甲氨基苯甲醛反应、甲醛浓盐酸- 硫酸铁铵反应等。其中，三氯化铁反应显灰绿色，说明含有邻二酚羟基化合物，该鞣质为缩合型鞣质，溴水与缩合鞣质产生沉淀，与水解鞣质不沉淀。香草醛浓硫酸反应

12、与对二甲氨基苯甲醛反应呈红色，说明存在儿茶素类缩合鞣质。甲醛浓盐酸- 硫酸铁铵反应是鉴别可水解鞣质和缩合鞣质的著名反应，此法可将缩合鞣质和水解鞣质分离，甲醛盐酸煮沸将缩合鞣质沉淀滤去，水解鞣质不被沉淀留在溶液中用铁盐检查，灵敏度高可达十万分之五6。进一步的鞣质鉴定一般采取纸层析法、紫外法、红血球凝聚法和薄层层析法，在这其中目前最常用的是薄层层析法。纸层析法的分离效果较差，斑点重叠不集中，拖尾现象较严重。与纸层析法相比，薄层层析法的分离效果好，斑点集中，检测鞣质的分解产物没食子酸的重现性好，灵敏度高。近年来新技术、新方法的应用有力地推动了药用植物中鞣质的研究，尤其是高效液相色谱的成功应用，不仅可

13、以检测鞣质组分中的、异构体，还可以预试鞣质分子的大小、判断结构测定中水解反应进行的程度。在鞣质的结构鉴定中，近年来大量使用光谱分析。1H - NMR、X- 射线、CD FAB - MS、13C - NMR 技术被大量使用。应用 CD 谱可以确定鞣质中HHDP、DHHDP 的绝对构型;应用1H - NMR 并结合化学降解产物的比旋度可分析得到整个分子的绝对构型;应用13C - NMR 可以确定整个分子的碳骨架，确定各个官能团之间的结合位置。这些较先进的技术和先进的色谱分离方法结合在一起，已经阐明了数百种新鞣质化合物的结构。5鞣质的含量测定5.1鞣质的经典含量测定方法鞣质的经典含量测定方法有很多种

14、，重量法、容量法、比色法、分光光度法等经典方法均可作为鞣质的含量测定方法，它们的特点是简单、容易操作，不需要贵重的仪器，因此特别在工业中被广泛应用，如：用于饮料和工业废水中鞣质的测定等。其中，最常用的有皮粉法、高锰酸钾法、干酪素法、络合滴定法、比色法和分光光度法。5.2皮粉法皮粉法是国际公认的鞣质含量测定方法。皮粉中的主成份是蛋白质，鞣质可通过分子中的酚羟基与蛋白质中的酰胺基形成氢键而结合成不溶于水的沉淀，因此通过重量分析可测定鞣质含量。皮粉法适用的范围非常广，我国药典1995年版中鞣质含量的测定采用的就是皮粉法。它的缺点是耗用样品多，测定时间长，而且没有选择性，其测定结果往往偏高，故一般只适

15、用于测定鞣质含量高的生药，样品较少或含量低的则不适于测定。重量法一般使用皮粉，也可用其它沉淀剂，Reed就用三价镱离子取代皮粉与鞣质结合进行重量分析，测定了双子叶植物中的鞣质含量。干酪素法的特点在于干酪素能选择性地结合有生理活性的鞣质，因此测出的是有生理活性的鞣质，而无生理活性的鞣质如鞣酐则不被测定，选择性比皮粉法要高，一般适于测定鞣质含量较低的鞣质。罗文毓等对干酪素法和皮粉法进行了比较，实验表明干酪素法的结果明显低于皮粉法，且重复性好。程立方7用干酪素法测定了侧柏叶中有生物活性的低含量鞣质。高锰酸钾法利用鞣质有较多酚羟基易被氧化的性质，用高锰酸钾滴定样品液中鞣质。同皮粉法一样高锰酸钾法选择性

16、较小，易受样品中还原性物质干扰，误差较大，最大的优点是操作简单。除了高锰酸钾外，常用的氧化滴定剂还有硫酸铈等。已报道的有在18 种烧伤收敛中草药、中药地榆、醋炒槐米等质量评价中的应用。鞣质分子内的多个邻位酚羟基可作为多基配体与一个中心离子，如：铜、锡、铋、锌、汞、铁等络合，形成环状的螯合物，在不同的pH 值下发生沉淀。络合滴定法就是利用鞣质这一性质，通过用EDTA返滴定过量金属离子来确定鞣质的含量。杨伟8络合滴定法和高锰酸钾法测定啤酒花中鞣质含量进行了对比，结果表明络合滴定法的准确度和精密度要高，终点更清晰明显。比色法利用某些试剂与鞣质类化合物发生颜色反应，用比色计测定吸光度以确定鞣质含量。常

17、用的试剂有香草醛- 盐酸、普鲁士蓝、Folin-Denis和硫酸等。酒石酸铁法是根据酒石酸铁能与多酚类化合物生成紫色络合物的特征，而络合物的量与颜色深浅性关系。采用酒石酸铁法来测定小儿止泻冲剂中鞣质含量。该法简单易行，测定结果较准确，比较接近原药材中多酚化合物的含量，具有一定实用性。5.3分光光度法分光光度法是利用鞣质与某些试剂反应生成有色化合物，通过吸光度测定确定样品中的鞣质含量。该方法在目前的应用最为广泛。常用的显色剂有氯化铁、氯化铁-1,10二氮杂菲、Folin-Ciocalteu试剂、5 %盐酸-丁醇、甲胺基粉-重铬酸钾溶液、FolinDAB8试剂、Folin-Denis试剂、偏钒酸铵

18、等，这些显示剂的检测范围一般在500700nm 之间。已被用于检测果汁、果渣、啤酒、茶叶、高粱、制革污水和中药如五倍子中鞣质含量的检测。鞣质在紫外区275nm 左右处有较强特征吸收，可以用紫外法对鞣质进行定量分析。胡耀星9利用高岭土特异吸收鞣质，使鞣质的紫外吸收消失，用紫外法测得了柿子和柿酱中的单宁含量，最低检测限可0.010.1g/L。在提供试液中加入Folin试剂以及5%NaCO3溶液后用紫外分光光度法测定不同当归炮制品中鞣质含量，获得较好的线性关系，有人利用紫外分光光度法测定了五倍子、诃子、儿茶和大黄4种有代表性的中药。结果表明，4种药材所含鞣质的得到结果与皮粉法和络合量法的结果相近，可

19、见紫外分光光度法直接用于中药鞣质含量的测定是完全适用的。6鞣质的生物活性及临床应用6.1鞣质的生物活性6.1.1与蛋白质或其它物质的结合鞣质的基本作用之一是与蛋白质、大分子物质和简单成分等结合，鞣质的各种生物活性都与此有关。它参与鞣质及含鞣质植物的止泻、止血、保护消化道免受损伤等。此外，柿鞣质的解蛇毒素作用很可能基于柿鞣质强大的结合作用。应注意，鞣质与一些生物碱(小檗碱，士的宁，罂栗碱等)或金属离子(Fe3+，cu2+ 等)形成的沉淀物在混合溶液中加入额外的鞣质，这些沉淀就都溶解了。6.1.2对酶的作用鞣质通常高浓度抑制酶的活力，低浓度激发酶的活力。抑制或提高酶活性取决于酶、鞣质的结构和浓度。

20、在10 -5 M时，没食子酰葡萄糖抑制取自链球菌属的酶活性，而六没食子酰葡萄糖和八没食子酰葡萄糖在此浓度则刺激该酶活性。某些鞣花鞣质在低于10-3 M 时激发该酶。五没食子酰葡萄糖显示出较洗必泰更强的抑制该酶作用。可水解鞣质低聚体有比其它鞣质更强的抑制RNA肿瘤病毒逆转录酶作用，此作用可与光花椒碱相比拟。原花青素抑制组氨酸脱羧酶及原花青素经口服吸附进入肠粘膜。D.kaki叶中抑制血管紧张肽转化酶的主要酚类成分是栗木鞣花素、异槲皮甙和它们的2“-没食子酸酯，这些成分具有与鞣质类似的较强的与蛋白质结合作用。6.1.3抗病毒虽然鞣质抗细菌和真菌作用不强，但某些鞣质及多元酚观察到具有明显的抗病毒作用。

21、鞣质能够抑制HIV 生长，该病毒导致AIDS。鞣质也抑制HSV的生长。低聚鞣花鞣质(Agrimoniin，Coriariin 和Oenothein B)强烈抑制HIV 在MT-4和CCRF CEM 从细胞中的复制。这些鞣质在病毒对细胞的吸附阶段有效，它们也抑制逆转录酶和鸟类成髓细胞性白血病毒，但是抑制逆转录酶所需浓度较HIV 明显地高。鼠口服oenotheJn B也抑制HIV的生长。甘草中的多元酚具有抑制HIV引起的巨大细胞形成作用Melissa of-ficinalis的水提物在鸡卵胚和雏鸡细胞中表现出抗newcastle disease virus，herpes sireplexvirus

22、和vacclnia virus活性，滑眭成分仅仅推测可能是鞣质或多元酚。6.1.4抑制致癌物和肿瘤6.1.4.1抑制致癌物的诱变性虽然近来发现鞣花酸具有抑制7,8a-二羟基-9a,10a-环氧-7,8,9,10-四氢苯芘(BEa)P diol epoxide和其它致癌物的致癌作用，应强调的是：它是鞣花鞣质(ellagitannins)在储存、干燥、提取或含鞣花鞣质植物被消化时产生的水解物。因此，尽管生长的植物体内不存在鞣花酸但它可随同服用含鞣花鞣质的食物或药物进入体内。现已发现某些鞣质及其相关的多元酚对Trp-P-l，Trp-P-2 和N-methyl-N-nitroso-N'-nit

23、roguanidine(MNNG)等致癌物的诱变性具有抑制作用，在不同程度上与鞣质和致癌物的化学结构有关，虽然鞣花酸抑制诱变性不很强。本实验所用的鞣质本身不显示任何诱变作用。抑制Bap diol epoxide诱变作用变性的机理归纳为，鞣质中的酚羟基易于同Bap diol epoxide中活性环氧化物结合，该活性环氧化物若与DNA结合，将产生诱变作用。鞣质抑制其他致癌物的诱变作用归因于鞣质与这些物质的结合 然而，弱结合作用的小分子多元酚抗MNNG诱变性大于强结合力的大分子鞣质。这种关系在抑制Trp-p-I和Trp-P-2的诱变作用时颠倒过来。这说明抑制诱变性的机理依赖于诱变剂的类型。采用N-O

24、H-Trp-P-2进一步研究表明，Trp-P-2诱变作用的抑制是由于鞣质直接与诱变剂作用，而不是在Ames test中与使用的酶结合。G.thunbel gii叶不同浸提时间的提取物抑制Trp-P-1和Bap diol epoxide的诱变性实验表明，植物提取物中鞣质的含量与结构令抑制诱变性作用发生变化。提取过程和持续部分水解产生弱活性的Corilagin，这会使提取物中老鹳草素(Geraniin)量的改变。试验中，在不同提取时间取出部分提取物进行Ames test，发现水中持续加热30rain时抗Trp-P-l诱变作用最强，然后随着水解造成提取物中Geraniin减少而降低。然而，在提取物中

25、Geraniin减少后，提取物抑制BI-alP diol epoxide作用仍然继续增强，这很可能是由于提取物中产生的鞣花酸所致。6.1.4.2抑制肿瘤生长在一项2步骤致癌实验中，几个鞣质显示出强的抑制肿瘤生长作用实验中，以不具有促进肿瘤生长活性的7,12-dimethyl-benzoaanthracene(OMBA)作为诱变剂，以杀鱼菌素作为肿瘤生长剂。在使用杀鱼菌素之前应用(绿茶中主要涩味成分)。此成分对于结合活性来说是一个例外，尽管分子量小，却有强的结合活性。鼠于第9周出现肿瘤，第25周患肿瘤率达到47，在杀鱼菌素之前应用EGCG的鼠肿瘤发生率降为l3%。五没食子酰葡萄糖(PGG)是鞣质

26、酸的基本结构，也具有类似的抑制肿瘤生长作用。几个具有阻止l2-0-Tetrade-canoylphorbol-13-O-acetate(TPA)，从cro.ton tiglium中分到的最熟悉的肿瘤生长剂，与取自鼠皮肤上的受体结合的鞣质被发现。各个鞣质抑制TPA与受体结合的活性与该鞣质与蛋白质的结合活性呈正相关系。因此认为鞣质的结合作用强烈参与Phorhol受体的调节，相应地具有抑制肿瘤生长作用。此外，这些鞣质抑制蛋白激酶C(ED50=3M)，这表明抑制此酶有助于抑制肿瘤生长。口服EGCG发现能阻止N-Ethyl-N-ni-tro-N-nitrosoguanidin(ENNG)引起的十二指肠癌

27、。本实验中，先给鼠口服ENNG4周，然后经口服给予EGCG 的稀溶液(0.005%)，第l6周只给水的对照组相比，给予EGCG组鼠患肿瘤数是对照组的1/3，肿瘤平均大小是对照组的1/2。此结果表明口服EGCG可能对治疗十二指肠癌有效。6.2鞣质的临床应用6.2.1抗感染止血及收敛作用鞣质外用治疗烧烫伤在国内外早有报道。特别是民间应用含鞣质较多的中药如地榆、黑地榆及大黄、儿茶等，在止血收敛，治疗灼伤、油脂烫伤、烧伤等方面均收到良好的效果。实验证明，这些作用均来自鞣质。近年来，发现烧伤创面没有血液循环，不能使有效浓度的抗菌药达到烧伤创面，因而除了应用具有一定穿透且无毒的广谱抗菌药来控制烧伤感染外，

28、用黄柏、榆树皮、虎杖所含鞣质(主要成份为缩合鞣质)，除用其具有抗菌作用外，还能降低受伤部位毛细血管的通透性和减轻烫烧组织的水肿和渗出，使创面迅速结痂，较好的防止外来细菌侵入，避免创面感染区扩大与深入，在临床应用中获得较满意的效果。6.2.2对胃肠道系统的作用鞣质对胃肠道系统主要是抑制作用，抑制肠道蠕动，阻碍胃内容物向肠道移行，也以抑制大肠内细菌胺生成酶，阻断了吲哚类的产生，从而引起便秘。大黄大剂量可致泻，小剂量止泻，止泻作用就是鞣质的收剑作用大于泻下作用所致。由诃子肉、土木香等制成的药物，经临床验证具有止泻止吐等作用，起效较新霉素、痢特灵快。文献报道，鞣质不仅抑制胃蛋白酶的分泌活性，抑制胃酸分泌，且可推迟溃疡病的形成。此外鞣质与胃粘膜有很强的结合力，具有保护胃粘膜的作用。但鞣质口服可抑制食欲，长期服用对肝脏有毒性。因此在临床应用中要选用最佳剂型和给药途径，尽力减少不良反应的发生。6.2.3抗菌和抗病毒作用鞣质对多种细菌、病毒都有不同程度的抑制作用，很多中成药的组方如地榆丸、玉关丸中其主要有效成分是地榆、诃子肉、石榴皮、五倍子，临床用于治疗久泻久痢及便血疗效显著。