植物次生代谢物的提取分离

1、植物次生代谢物的提取分离实验一银杏叶黄酮类化合物提取及含量的测定一、实验目的1. 通过本实验学习植物黄酮类化合物提取的一般方法2. 学习植物叶片黄酮类化合物含量测定的方法3. 学习利用薄层色谱法鉴别黄酮类化合物二、基本原理(1) 黄酮类化合物的提取银杏叶(Ginkgo biloba L.)中黄酮类化合物有特殊的药效，黄酮类化合物(flavo no ids)主要是指两个苯环(A-与B-环)通过中央三碳链相互连接而成的一 系列化合物，其基本骨架为 C6-C3-C6,母体结构式如下：是植物次生代谢产物之一，普遍存在于维管植物中，大部分以苷的形式存在，一 部分以游离形式存在，种类较多，分布广泛，已发现

2、的天然黄酮类化合物有十多 个大类3000多种。黄酮类化合物具有明显的生物活性，如对心血管系统有明显的 药理作用以及抗肝脏毒性作用等。黄酮类化合物的提取主要是根据被提取物的性质及伴存的杂质来选择适合 的提取溶剂，苷类和极性较大的苷元，一般用乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水 或某些极性较大的混合溶剂(如甲醇-水：1 : 1)进行提取。大多数苷元宜用极性 较小的溶剂如乙醚、氯仿、乙酸乙酯等来提取。但乙醇和甲醇是最常用的黄酮类 化合物的提取溶剂。(2) 黄酮类化合物含量的测定大部分黄酮类化合物分子结构中含有- 0H和C = 0，所以可以和铝离子络 合形成有色物质，这些有色物质在 400500nm有吸收现

3、象，据此可以采用硝酸 铝比色法来测定黄酮类化合物的含量。(3) 黄酮类化合物的薄层层析薄层层析是检验黄酮类化合物是否存在的强有力的方法，通常用的薄层层析 技术有纸层析、聚酰胺薄层层析、硅胶薄层层析、氧化铝薄层层析技术等，其中 纸层析、聚酰胺薄层层析技术对黄酮类化合物的分离方法较好。 黄酮类化合物在 层析材料上展开后，经过 1%的 AlCl 3溶液显色后在 365nm 紫外灯下即可观察到 颜色斑点。 通常在纸层析上观察到的是棕色斑点， 在聚酰胺薄层层析上观察到的 是黄色或黄绿色斑点。三、实验所需试剂、仪器及材料(1) 试剂70%(v/v)的乙醇、正丁醇、冰醋酸、石油醚、氯仿、甲醇、 1%(w/v

4、)的AICI3 溶液、10% (m/m)的 AI(NO 3)3 溶液、5% (m/m)的 NaNO2 溶液、4%的 NaOH 溶液、 芦丁。(2) 仪器365nm紫外分析仪、分光光度计、旋转蒸发器、真空泵、水浴锅、层析缸、容 量瓶、10ml具塞刻度试管、烧瓶、冷凝管、喷壶、毛细管、布氏漏斗及其他必 备玻璃仪器。(3) 材料滤纸或聚酰胺薄膜。四、实验步骤1. 银杏叶黄酮类化合物的提取及薄层定性检测(1) 准确称取10g银杏叶干粉，用石油醚反复浸提 2次以除去叶绿素及其它干扰 含量测定的脂溶性杂质，每次 30mi n,然后过滤；将石油醚浸提后的银杏叶全部转入 150ml的烧瓶中，按物料比为1 :

5、10再加入100ml 80%(v/v)的乙醇水域加热回流提取 40min;(3) 将提取液抽滤后浓缩定容至 10ml。(4) 以芦丁为对照，用玻璃毛细管点银杏提取液浓缩样于聚酰胺薄膜上，以氯 仿：甲醇二8: 2上行展开，以1 %的三氯化铝乙醇溶液显色并置于紫外分析 仪(365nm)下观察；(5) 如果实验室没有聚酰胺薄膜材料，也可以用纸层析代替，具体做法与用聚酰 胺薄膜材料相似，唯一的区别是展开剂不同，纸层析采用正丁醇：冰醋酸： 水 =4： 1 ： 2 展开系统。2. 银杏叶黄酮类化合物含量的测定(1) 工作曲线的绘制a. 精密称取芦丁样品(在120C烘干至恒重)5mg，用50%乙醇溶解定容至

6、 50mL 得以芦丁为标准的标准溶液；b. 分别取 2、4、6、8、10ml 芦丁溶液置于 25ml 容量瓶中，再分别吸取 1ml 置于 10ml 刻度试管中，采用硝酸铝比色法进行显色测定；c. 精密加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL,摇匀放置5min，再精密加入10%硝酸 铝溶液0.3mL摇匀放置5min，最后加入1 moL/L氢氧化钠溶液4.0mL，用蒸馏 水稀释至刻度，摇匀放置15min，于510nm(在400520nm间经扫描，确定510nm 处为最大吸收波长)波长处比色测定，同时做空白对照，重复三次，绘制标准曲 线并计算回归方程。(2) 银杏叶提取液黄酮类化合物含量的测定a. 吸取 1m

7、L 提取液的浓缩液于 10ml 刻度试管中，按工作曲线的制作方法来 测定溶液的吸光度值；b. 用所得工作曲线的方程来计算总黄酮的含量。思考题：1. 用硝酸铝比色法测定植物黄酮类化合物含量的原理是什么？为何测定植物叶片黄酮类化合物的含量时最好先用石油醚浸提？实验二 银杏叶黄酮类化合物的初步分离一、实验目的1. 通过本实验学习黄酮类化合物的初步分离即黄酮类化合物与非黄酮类化合 物的分离方法2. 学习利用柱色谱技术来分离植物叶总黄酮的方法二、基本原理 黄酮类化合物的分离包括黄酮类化合物与非黄酮类化合物的分离， 以及黄酮 类化合物单体的分离。 银杏叶片非黄酮类化合物主要包括脂类、 水溶性物质如蛋 白质

8、、多糖等以及其他种类的次生代谢物， 根据这些特点， 常采用的初步分离方 法有：溶剂萃取法，常用的萃取溶剂有乙酸乙酯、乙醚、正丁醇等，通常这些溶 剂萃取法初步将黄酮类化合物分成几个极性部分； 聚酰胺柱吸附法， 这是利用大 多数黄酮类化合物具有酚羟基， 可被聚酰胺吸附， 因此即可将其与不含酚羟基的 化合物分离；此外，目前常用的还有 D101 大孔树脂吸附法，主要是利用大孔 树脂的多孔性特点进行分离的， 采用不同极性的溶剂进行洗脱， 即可得到粗黄酮 类化合物产品。三、实验所需试剂、仪器及材料(4) 试剂70%(v/v)的乙醇、正丁醇、冰醋酸、氯仿、甲醇、 5%的a萘酚乙醇溶液、0.1%的印三酮乙醇溶

9、液、1%(w/v)的AICI3溶液、芦丁。(5) 仪器 低速离心机、 365nm 紫外分析仪、旋转蒸发器、真空泵、水浴锅、层析缸、 容量瓶、喷壶、毛细管、层析柱、三角瓶等其它必备玻璃仪器。(6) 材料D 1 0 1大孔吸附树脂、滤纸或聚酰胺薄膜。四、实验步骤1. 银杏叶黄酮类化合物的提取液浸膏的制作(1)准确称取10g银杏叶干粉，用石油醚反复浸提 2次以除去叶绿素及其它干扰 含量测定的脂溶性杂质，每次30min，然后用80%的乙醇热水回流提取40min后过滤浓缩得流浸膏；(2) 将银杏叶浸膏转溶于水后再低速(100g)离心10min以除去易堵塞树脂的脂溶 性成分，然后将上清液浓缩至 2ml 左右；(3) 用滴管将浓缩液加样于 D-101 大孔吸附树脂柱；(4) 先用去离子水