血红蛋白的提取和分离91414PPT学习教案

1、会计学1一、基础知识一、基础知识- 凝胶色谱法（分配色谱法）凝胶色谱法（分配色谱法）1 1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）2 2、概念：、概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法有效方法3 3、原理：、原理：第1页/共40页4 4、具体过程、具体过程一、基础知识一、基础知识-第2页/共40页第3页/共40页分子量分子量大大小小直径大小直径大小大于大于凝胶颗粒空凝胶颗粒空隙直径，被阻挡隙直径，被阻挡在颗粒的外面在颗粒的外面小于小于凝

2、胶颗粒空凝胶颗粒空隙直径，可以进隙直径，可以进入颗粒内部入颗粒内部运动方式运动方式垂直向下移动垂直向下移动垂直向下移动，垂直向下移动，无规则扩散进入无规则扩散进入颗粒内部颗粒内部运动速度运动速度较快较快较慢较慢运动路径运动路径较短较短较长较长洗脱次序洗脱次序先从先从凝胶柱洗脱凝胶柱洗脱出来出来后从后从凝胶柱洗脱凝胶柱洗脱出来出来一、基础知识一、基础知识-第4页/共40页D第5页/共40页B第6页/共40页1 1、概念：、概念：在一定的范围内，能对抗外来在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PHPH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有发生明

3、显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 缓冲溶液：缓冲溶液：2 2、作用：、作用：能够抵制（能够抵制（ ）对溶）对溶液（液（ ）的影响，维持）的影响，维持PHPH基本不基本不变。变。外界的酸或碱外界的酸或碱pHpH值值第7页/共40页3 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制通常由（通常由（ ）种缓冲剂溶解于水中）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得（）就可以制得（ ）使用的缓冲液。）使用的缓冲液。1 12 2使用比例使用比例在不同在不同PHPH范围内范围内思考：说出人体血液中缓冲液。思考：说出人体血液中缓

4、冲液。 NaH2PO4 / Na2HPO4 H2CO3 / NaHCO3磷酸缓冲液，磷酸缓冲液，保证血红蛋白的正常结构和保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察功能，便于观察()和科学研究其和科学研究其()4、在本课题中使用的缓冲液？、在本课题中使用的缓冲液？第8页/共40页（三）（三） 电泳：电泳：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 许多重要的生物大分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的核酸等都具有可解离的基团，在一定的PHPH下，下，这些基团会带上正电或负电。这些基团会带上正电或负电。在电场的作用在电场的作用下，这

5、些带电分子会向着与其所带电荷相反的下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。而实现样品中各种分子的分离。琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳凝胶电泳。第9页/共40页在电场的作用下，这些带电分子会向着与在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动其所带电荷相反的电极移动第10页/共40页 4 4、

6、聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳（1 1）聚丙稀酰胺凝胶：）聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰是由单体丙烯酰胺和交联剂胺和交联剂N,NN,N，亚甲基双丙烯酰胺在引发亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。网状结构的凝胶。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率迁移率取取决于它所带决于它所带净电荷净电荷的多少以及的多少以及分子的大分子的大小小等因素。等因素。为了消除为了消除净电荷对迁移率的影响，净电荷对迁移率的影响，可以可以在凝胶中加入在凝胶中加入SDSSDS。（2 2）原理：）原理：第11页/共40页S

7、DSSDS能使蛋白质发生完全变性。能使蛋白质发生完全变性。由几条肽由几条肽链组成的链组成的蛋白质复合体蛋白质复合体在在SDSSDS的作用下会的作用下会，因此测定的结果只是，因此测定的结果只是。SDSSDS能与各种蛋白质能与各种蛋白质形成形成，SDSSDS所带负电所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子荷的量大大超过了蛋白质分子。因而掩盖了因而掩盖了，使电泳迁移率完全取决于分子的，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。大小。（3 3）SDS-SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理作用机理: : 4 4、聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳第12页/共40页使用使用SDS-SDS-聚丙烯酰胺电

8、泳过程中，不同蛋聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于白质的电泳迁移率完全取决于A A 电荷的多少电荷的多少 B B 分子的大小分子的大小C C 肽链的多少肽链的多少 D D 分子形状的差异分子形状的差异第13页/共40页蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。蛋白溶液。（2）粗分离：透析除去分子较小的杂）粗分离：透析除去分子较小的杂质。质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质

9、蛋白质除去。较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。电泳鉴定。二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定第14页/共40页二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定知识回顾知识回顾第15页/共40页（一）样品处理（一）样品处理1 1、红细胞的洗涤：、红细胞的洗涤：2 2、血红蛋白的释放：、血红蛋白的释放：3 3、分离血红蛋白溶液：、分离血红蛋白溶液：4 4、透析、透析：（：（如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？）如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？） 血液柠檬酸钠

10、血液柠檬酸钠低速短时离心低速短时离心吸出上层血浆吸出上层血浆红细胞红细胞5倍体积生理盐水倍体积生理盐水 缓慢搅拌缓慢搅拌10min低速短时离心低速短时离心吸出上清吸出上清液液反复洗涤直至上清液无黄色反复洗涤直至上清液无黄色在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放红细胞破碎混合液红细胞破碎混合液中速长时离心（中速长时离心（2000c/min10min）滤纸过滤除去脂质滤纸过滤除去脂质分液漏斗分离出血红蛋白，分液漏斗分离出血红蛋白，得到红色透得到红色透明液体。明液体。装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为为7.0）透析）透析。

11、二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定第16页/共40页有机溶剂有机溶剂 无色透明的甲苯层无色透明的甲苯层脂类物质脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层白色脂溶性物质沉淀层血红蛋白溶液血红蛋白溶液 红色透明液体红色透明液体红细胞破碎物沉淀红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物暗红色沉淀物第17页/共40页第18页/共40页1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是做的一步是A 弄清各种蛋白质的空间结构弄清各种蛋白质的空间结构B 弄清各种蛋白质的功能弄清各种蛋白质的功能

12、C 弄清各种蛋白质的合成过程弄清各种蛋白质的合成过程D 获得高纯度的蛋白质获得高纯度的蛋白质第19页/共40页2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是，关于蛋白质的叙述，正确的是A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较

13、二者根本无法比较第20页/共40页3、使用、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少电荷的多少 B 分子的大小分子的大小C 肽链的多少肽链的多少 D 分子形状的差分子形状的差异异4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A 调节调节pH B 维持红细胞的能量供应维持红细胞的能量供应C 防止微生物生长防止微生物生长 D 防止血液凝固防止血液凝固第21页/共40页5、一分子血红蛋白最多可携带的、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子分子数和数和CO2分子数分别是分子数分别是A 4

14、、2 B 4、4 C 2、1 D、1、16、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序分层顺序自上而下自上而下是：是：有有机溶剂机溶剂-脂脂类物质类物质-血血红蛋白溶液红蛋白溶液-红红细胞破碎物沉淀细胞破碎物沉淀第22页/共40页1 1、凝胶色谱柱的制作：、凝胶色谱柱的制作：二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定色谱柱的制作过程：准备材料色谱柱的制作过程：准备材料加工橡皮塞加工橡皮塞安装色谱柱安装色谱柱第23页/共40页步骤步骤操作要求操作要求操作要求操作要求色谱柱垂直固定在支架上色谱柱垂直固定在支架上计算称量凝计算

15、称量凝胶胶根据色谱柱体积计算凝胶用量根据色谱柱体积计算凝胶用量配制悬浮液配制悬浮液凝胶颗粒蒸馏水凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀充分溶胀凝胶颗粒洗脱液凝胶颗粒洗脱液沸水浴沸水浴装填悬浮液装填悬浮液一次性缓慢倒入；轻轻敲打一次性缓慢倒入；轻轻敲打缓冲液洗涤缓冲液洗涤平衡平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h12h第24页/共40页第25页/共40页打开下端出口，使柱内缓冲液缓打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的顶样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注端，滴加样

16、品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝意不要破坏凝胶面。胶面。加样后打开下端出口，使样加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液到的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每收集流出液，每5ml5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中收集一试管

17、，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功），如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）正确的加样操作：正确的加样操作：1 1、不要触及并破坏凝胶面、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。第26页/共40页正确的加样操作是正确的加样操作是（1 1）不要触及并破坏凝胶面不要触及并破坏凝胶面。（2 2）贴壁加样。）贴壁加样。（3 3）使吸管管口沿管壁环绕移动）使吸管管口沿管壁环绕移动。第27页/共40页让血红蛋白处在稳定的让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内，维持结构和功能。范围内，维持

18、结构和功能。 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。程非常直观，大大简化了实验操作。 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：。首先通过洗涤红细胞、血红蛋。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液血红蛋白溶液，即，即: :样品的处理样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后

19、；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后将相对分子质量较大的将相对分子质量较大的杂质蛋白除去杂质蛋白除去，即，即: :样样品的纯化；最后经品的纯化；最后经进行纯度鉴定。进行纯度鉴定。第28页/共40页第29页/共40页A第30页/共40页A第31页/共40页 A第32页/共40页鉴定血红蛋白纯度。鉴定血红蛋白纯度。血红蛋白的取和分离凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定血红蛋白的提取和离蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用缓冲溶液组成作用蛋白质的提取

20、分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定第33页/共40页观察你处理的血液样品离心后观察你处理的血液样品离心后是否分层是否分层（见教科书图（见教科书图5-185-18），），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。提取纯度。1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处、你是否完

21、成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？理后的样品发生了哪些变化吗？2 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？柱装填得成功吗？你是如何判断的？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡聚糖或红色葡聚糖，观察色带移动的情况

22、。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 第34页/共40页 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。1.1.凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的? ?2.2.什么是缓冲溶液什么是缓冲溶液? ?它的作用是什么它的作用是什么? ?3.3.电泳的作用及其原理是什么电泳的作用及其原理是什么? ?4.4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗你能描述血