膀胱尿路上皮癌Fas相关死亡结构域蛋白表达及意义

1、膀胱尿路上皮癌Fas相关死亡结构域蛋白表达及意义【摘要】 目的 研究Fas相关死亡结构域 (FADD) 蛋白在膀胱尿路上皮癌（BUC）组织的表达，并探讨其与肿瘤生物学行为之间的关系。方法 采用免疫组化SP法检测68例BUC及13例正常膀胱黏膜组织FADD蛋白表达。原位杂交法检测其中34例BUC组织FADD mRNA 表达水平。结果 正常膀胱黏膜FADD蛋白呈阳性表达。FADD的阳性率在不同组织学分级、不同临床分期的BUC组织中差异均有极显著性(2=15.38、11.34，P<0.01)；复发组与未复发组FADD的阳性率分别为36.84%和53.33%,差异无显著意义(2=1.85

2、，P>0.05)。BUC组织中FADD mRNA阳性率为44.12%, FADD蛋白阳性率为47.06%,两者差异无统计学意义(2=0.06，P>0.05)。结论 FADD表达异常在BUC的发展中可能起着重要作用, FADD阳性表达与BUC病理分级、浸润关系密切，但与BUC复发无关。 【关键词】 Fas相关死亡结构域蛋白；膀胱肿瘤；免疫组织化学；原位杂交 ABSTRACT Objective To investigate the Fas-associated death domain (FADD) protein and its biological behavio

3、r in bladder urothelial carcinoma (BUC). Methods The expressions of FADD in 68 BUC and 13 normal bladder tissue were detected by streptavidin-peroxidase immunohistochemical technique. Of which, 34 BUC were studied by in-situ hybridization for FADD mRNA. Results The various exprssions of FADD were as

4、 follows: it positively expressed in normal bladder mucosa; the differences of positive expression were significant among different histological grading and clinical staging (2 / 132=15.38,11.34;P<0.01); its expression in recurrent group and non-recurrent group was 36.84% and 53.33%, respecti

5、vely, the difference was insignificant (2=1.85,P>0.05). In BUC, the positive FADD mRNA was 44.12% and FADD protein was 47.06%, with no statistical difference was noted between them (2=0.06,P>0.05)。 Conclusion The abnormal expression of FADD may play an important role in the development

6、 of BUC. The positive expression of FADD in the cancer is closely related to the pathological grading and invasion, but not related to its recurrence. KEY WORDS Fas-associated death domain protein; Bladder neoplasmas; Immunohistochemistry; In situ hybridization Fas相关死亡结构域(FADD)蛋白能与Fas相互作用而诱导细胞凋亡,在细胞

7、凋亡信号传导通路中起重要作用,但其在膀胱尿路上皮癌（BUC）发病过程中的作用尚不清楚。我们分别采用免疫组化SP法、原位杂交法检测BUC组织中FADD蛋白及mRNA表达, 并探讨FADD与BUC生物学行为之间的关系。现报告如下。 1 材料与方法 1.1 标本 随机选取我院19992002年经手术切除的初发性BUC石蜡标本68例，男49例，女19例；年龄3085岁，平均60.2岁。临床病理分期按国际抗癌协会（UICC-TNM）标准确定，其中浅表性(TisT1)肿瘤32例，浸润性(T2T4)肿瘤36例。病理分级按世界卫生组织（WHO）1998年标准确定，其中级（G1）13例，级（G2）29例，级（G

8、3）26例。68例病人均获随访，复发38例。其中34例为新鲜组织标本，用于原位杂交。13例正常膀胱黏膜组织标本取自非肿瘤病人。标本均5 m厚连续组织切片，分别进行苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色及原位杂交。所有病例术前均未经放疗、化疗及免疫治疗。 1.2 FADD蛋白检测 采用免疫组化SP法。山羊抗人FADD单克隆抗体为Santa Cruz Biotech公司产品,其工作浓度为130；兔抗山羊血清及SP试剂盒为北京中山生物有限公司产品；DAB为Sigma公司产品。用已知肺癌阳性切片作阳性对照，用PBS代替山羊抗人FADD单克隆抗体作阴性对照，DAB显色，苏木精复染，中性树脂封片。具体操作步骤

9、按试剂盒说明书进行。结果判定标准：FADD蛋白阳性细胞为胞浆内有棕黄色细颗粒；每张切片随机选择5个高倍视野, 每视野计数200个细胞(癌组织计数癌细胞,正常膀胱黏膜组织计数上皮细胞)，无阳性反应为阴性(-),阳性细胞数<25%为弱阳性(+),25%75%为中度阳性(),>75%为强阳性()。 1.3 FADD核酸原位杂交 探针序列：5-GACCCGTTCCTGGTGCTGCT-GCACTCGGTG-3;5-AGCTGGAGCGCGTGCAG-AGCGGCCTAGACC-3;5-GAGCAGAACGACCTGGAGCCCGGGCACACC-3。实验严格按说明书进行,原

10、位杂交阳性对照片由试剂盒提供,省去探针步骤为阴性对照。最后用DAB显色,镜下观察,FADD mRNA阳性细胞为胞质内有蓝色颗粒。结果判定标准: 采用半定量分析方法（AB值法），连续观察5个高倍视野，每视野计数200个癌细胞。以染色强度评分：0分为细胞无着色，1分为浅蓝色，2分为深蓝色；以显色细胞比例评分：<25%为0分, 25%75%为1分, >75%为2分。两项相加,得分<2分为阴性,24分为阳性。 1.4 统计学处理 应用SPSS 11.0统计学软件，采用2检验及Spearman相关分析进行统计学处理。 2 结 果 2.1 FADD蛋白的表达 13

11、例正常膀胱黏膜组织FADD蛋白均呈阳性表达，68例BUC组织中30例FADD蛋白阳性表达（44.12%），二者相比差异有极显著性(2=13.69，P<0.01)。BUC组织中FADD蛋白表达大多呈中度或强阳性(24/30),而正常膀胱黏膜组织大多呈弱阳性(11/13),BUC组织中FADD蛋白表达强度高于正常膀胱黏膜组织(2=15.84,P<0.01)。 2.2 FADD mRNA的表达 本文BUC组织中FADD mRNA的阳性表达率为44.12%(15/34),而FADD蛋白阳性表达率为47.06%(16/34)。其中2例免疫组化结果阳性,而原位杂交结果阴性;1例

12、免疫组化结果阴性,而原位杂交结果阳性,两者符合率为81.67%。免疫组化与原位杂交检测阳性率差异无统计学意义(2=0.06，P>0.05)。 2.3 FADD蛋白表达与BUC病理分级、临床分期的关系 本文BUC组织G1、G2、G3阳性表达率分别为84.62%、48.28%、19.23%，差异有极显著性（2=15.38，P<0.01）；两两比较,G1与G2、G2与G3差异有显著意义(2=4.92、5.12，P<0.05)，G1与G3间差异有极显著性(2=15.31，P<0.01)。FADD蛋白的阳性表达率随肿瘤细胞分化程度的降低而降低,两者

13、呈显著正相关(rs=0.47,P<0.01)。浅表性BUC的阳性表达率为65.63%，浸润性BUC为25.00%，两者差异有极显著性（2=11.34，P<0.01）；FADD蛋白的阳性表达率随肿瘤临床分期的升高而降低,两者呈显著负相关(rs=-0.41,P<0.01)。 2.4 FADD蛋白表达与BUC复发的关系 本文38例复发者FADD蛋白阳性表达14例（36.84%），30例无复发者FADD蛋白阳性表达16例（53.33%），两者差别无显著性（2=1.85，P>0.05）。FADD蛋白的阳性表达率与肿瘤复发与否无关(rs=0.16,P

14、>0.05)。 3 讨 论 FADD蛋白是由CHINNAIYAN 等1和BOLDIN等2于1995年几乎同时筛选出来的一种能与Fas分子胞内段死亡域相互作用的新蛋白。FADD蛋白是一种相对分子质量为2.3 万的胞浆蛋白，其基因定位于人染色体11q13.3上, 由2个外显子和1个内含子组成,编码208个氨基酸。FADD蛋白由羧基末端的死亡结构域(DD)和氨基末端的死亡效应域(DED)两部分组成。 肿瘤的发生、发展是多因素参与的复杂过程，其中细胞凋亡调控失调是肿瘤组织过度生长的重要原因3。参与调控细胞凋亡的蛋白很多,其中FADD是Fas、TNFR1和DR3凋亡信号途径中的必需蛋白4,

15、尤其在Fas凋亡信号转导过程中起着承上启下的关键作用。FADD以其羧基末端死亡结构域(FADD-DD)直接与Fas的死亡结构域结合,相互作用之后显露出其氨基末端的死亡效应域(FADD-DED),并随即与无活性的caspase-8酶原发生同嗜性交联,使之活化, 构成所谓死亡诱导信号复合体,进而引起随后的caspase级联反应,最终导致细胞凋亡4,5。因此，FADD蛋白表达异常或功能丧失,将使Fas/ Fasl 结合后的促细胞凋亡信号不能有效地转导,从而阻止细胞凋亡。研究表明，FADD异常导致凋亡通路异常与多种肿瘤发病之间有密切关系6,7。体外实验表明，一些肿瘤的治疗是通过调节FADD的凋亡信号通

16、路而发挥作用的8,这为今后BUC的药物或基因治疗提供了线索和思路。 我们在检测FADD蛋白表达的同时,对FADD mRNA的表达也进行了检测,统计学分析显示,免疫组化与原位杂交检测阳性率差异无统计学意义,并证实了两者的一致性。 本实验用免疫组化方法从蛋白合成水平检测人BUC组织中FADD的表达，并将FADD表达与反映BUC恶性生物学行为的各项病理参数结合起来分析。结果显示，BUC组织中FADD阳性表达显著低于正常膀胱黏膜组织,而且BUC组织中FADD阳性表达与肿瘤分化程度及临床分期密切相关,表明其表达水平与肿瘤的恶性程度、浸润深度有一定关系。但FADD蛋白的阳性表达与肿瘤复发与否无关，提示FA

17、DD对BUC预后判断价值不大。同时还显示，BUC组织中FADD表达程度多为中等或强阳性,显著强于正常膀胱黏膜组织, 这种BUC组织中FADD高表达,可能是机体主动抗肿瘤的一种自卫机制。FADD表达减少会导致BUC细胞凋亡减少，从而促使癌细胞累积增多,表明FADD表达异常在BUC发病机制中起重要作用。 综上所述，FADD表达异常在BUC的发展中可能起着重要作用, FADD阳性表达与BUC病理分级、浸润关系密切，但与肿瘤复发无关。 【参考文献】 1CHINNAIYAN A M, OROURKE K, TEWARI M, et al. FADD, a novel death domain-conta

18、ining protein, interacts with the death domain of Fas and initiates apoptosisJ. Cell, 1995,81(4):505-512. 2BOLDIN M P, METT I L, VARFOLOMEEV E E, et al. Self-association of the “death domains” of the p55 tumor necrosis factor (TNF) receptor and Fas/APO1 prompts signaling for TNF and Fas/APO1 effects

19、J. J Biol Chem, 1995,270(1):387-391. 3罗波.VEGF和上皮钙黏蛋白在膀胱移行细胞癌组织表达J. 青岛大学医学院学报, 2005,41(4):317-319. 4CHINNAIYAN A M, OROURKE K, YU G L, et al. Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95J. Science, 1996,274(5289):990-992. 5CHINNAIYAN A M, TEPPER C G, SELDIN M F, et al. FADD/MORT1 is a common mediator of CD95 (Fas/APO1) and tumor necrosis factor-induced apoptosisJ. J Biol