圆二色谱CD原理教学资料

1、圆二色谱CD原理光学活性分子对光学活性分子对左、右圆偏光左、右圆偏光的吸收率的差值的吸收率的差值 （1）高亮度的点光源；）高亮度的点光源； （2）日光色日光色。色温接近。色温接近6000K；（3）在可见光区连续光谱在可见光区连续光谱；（4）高显色性，显色指数）高显色性，显色指数95；（5）在整个寿命期内维持光色特性；）在整个寿命期内维持光色特性；（6）高电弧稳定性；）高电弧稳定性；（7）热重启能力热重启能力；（8）启动后即能达到接近最大光输出启动后即能达到接近最大光输出；（9）电弧光斑小、易聚光。）电弧光斑小、易聚光。超高压短弧超高压短弧氙灯氙灯: 在高压纯净氙气中放电发光。在高压纯净氙气中放

2、电发光。自然光自然光双折射现象双折射现象： 一束光射入一束光射入各向异性晶体各向异性晶体后有两束折射光。后有两束折射光。 尼科耳棱镜。尼科耳棱镜。 2、光的偏振、光的偏振 在生物样品中，肌肉纤维、骨骼和牙齿等具有各在生物样品中，肌肉纤维、骨骼和牙齿等具有各向异性，淀粉粒、染色体和纺锤体等具有双折射性，向异性，淀粉粒、染色体和纺锤体等具有双折射性，因此被用于组织细胞的化学研究。因此被用于组织细胞的化学研究。名称名称折射定律折射定律折射率折射率传播方向传播方向寻常光寻常光（o光光）遵守遵守对于晶体一切方向都对于晶体一切方向都具有相同的折射率具有相同的折射率在入射面内在入射面内非常光非常光（e光光）

3、不遵守不遵守折射率随方向而变化折射率随方向而变化不一定在入射面不一定在入射面内内o o光和光和e e光：频率相同、振动方向相互垂直、光：频率相同、振动方向相互垂直、平面偏振光平面偏振光自然光入射到某些晶体（电气石、硫酸金鸡钠碱晶体等）时，自然光入射到某些晶体（电气石、硫酸金鸡钠碱晶体等）时，晶片吸晶片吸收振动面与晶轴垂直的光收振动面与晶轴垂直的光，而只允许振动面平行于晶轴的光通过。，而只允许振动面平行于晶轴的光通过。自然光自然光平面偏振光平面偏振光起偏器起偏器检偏器检偏器晶轴晶轴相互平行相互平行时，时，透射光强度透射光强度最大最大；晶轴晶轴相互垂直相互垂直时，时，透射光强度透射光强度为零为零；

4、晶轴晶轴夹角为夹角为时，时，透射光强度透射光强度与与coscos2 2成正比成正比。. . . . .也称线（完全）偏振光，简称偏振光。也称线（完全）偏振光，简称偏振光。它的振动面称为其偏振面。它的振动面称为其偏振面。振动方向保持不变振动方向保持不变振幅发生周期性变化振幅发生周期性变化E E之端点在空间的轨迹为一平面正弦曲线之端点在空间的轨迹为一平面正弦曲线投影到垂直于光传播方向的平面上为一直线段投影到垂直于光传播方向的平面上为一直线段3 3、平面偏振光（、平面偏振光（Plane polarized light）4、布儒斯特角、布儒斯特角当入射光射到两种介质界面上时，反射光和折射光的偏振情况与

5、入当入射光射到两种介质界面上时，反射光和折射光的偏振情况与入射光不同。射光不同。5 5、四分之一波片、四分之一波片l使使o o光和光和e e光的光程相差光的光程相差1/41/4波长的晶片。此时，相位差为波长的晶片。此时，相位差为/2/2，透射的合成光是长轴与晶轴重叠的透射的合成光是长轴与晶轴重叠的正椭圆偏振光正椭圆偏振光。朝光源看，朝光源看， 电场矢量方向按电场矢量方向按顺时针顺时针方向旋转的，称为方向旋转的，称为右圆偏振光右圆偏振光； 电场矢量方向按电场矢量方向按逆时针逆时针方向旋转的，称为方向旋转的，称为左圆偏振光左圆偏振光。l若入射平面偏振光的电矢量与晶体晶轴的夹角若入射平面偏振光的电矢

6、量与晶体晶轴的夹角4545，则则Eo Eo = = EeEe，合成光是合成光是圆偏振光圆偏振光（Circular polarized light）。6、光的叠加、光的叠加一束一束自然光自然光可以看作是两束相互垂直而没可以看作是两束相互垂直而没有相位关系的有相位关系的平面偏振光平面偏振光的加和。的加和。旋转方向相反的旋转方向相反的左、右圆偏光左、右圆偏光透过一光学透过一光学活性物质后活性物质后透过的左、右圆偏光透过的左、右圆偏光振幅振幅相位相位矢量和矢量和相等相等相同相同平面偏振光平面偏振光相等相等不同不同平面偏振光，方向改变平面偏振光，方向改变不等不等相同相同椭圆偏振光椭圆偏振光不等不等不同不

7、同椭圆偏振光，方向改变椭圆偏振光，方向改变振幅相等、振动方向相互垂直、相位相差振幅相等、振动方向相互垂直、相位相差1/4波长波长的的两平面偏振光合成圆偏振光两平面偏振光合成圆偏振光右旋右旋7、旋光色散（、旋光色散（Optical rotatory dispersion，ORD）l旋光性旋光性：光学活性分子对左、右圆偏光的光学活性分子对左、右圆偏光的折射率折射率不同，透射光虽然仍不同，透射光虽然仍然为平面偏振光，但其偏振面旋转了一定的角度。然为平面偏振光，但其偏振面旋转了一定的角度。 l旋光物质又称为光学活性物质旋光物质又称为光学活性物质。l旋光度旋光度：偏振面旋转的角度：偏振面旋转的角度l 旋

8、光色散旋光色散：不同波长的偏振光的旋转角度不同。：不同波长的偏振光的旋转角度不同。l 旋光仪是测量旋光性与波长的函数关系，从而得到一个旋光色散谱。旋光仪是测量旋光性与波长的函数关系，从而得到一个旋光色散谱。圆双折射圆双折射：某个物质对于左、右圆偏光的折射率分别为：某个物质对于左、右圆偏光的折射率分别为nL和和nR， 若若 nL = nR，则为光学各向同性物质；则为光学各向同性物质； 若若 nL nR，则为光学各向异性物质；左、右圆偏光的相位改变，则为光学各向异性物质；左、右圆偏光的相位改变， 若若nLnR，透射光的偏振面右旋。透射光的偏振面右旋。 若若nLnR，透射光的偏振面左旋。透射光的偏振

9、面左旋。l旋光现象是圆双折射的一种特殊形式。旋光现象是圆双折射的一种特殊形式。l旋光物质使左、右圆偏振光的速度不同，即其色散大小的折射率不同，旋光物质使左、右圆偏振光的速度不同，即其色散大小的折射率不同，l旋光现象的产生是由于光学各向异性物质的折射率旋光现象的产生是由于光学各向异性物质的折射率nLnR的结果。的结果。化合物在正常情况下，处于低能的基态，化合物在正常情况下，处于低能的基态，电子占据所有的成键轨道（电子占据所有的成键轨道（、n n轨轨道）。如果电子吸收了外界的能量，它就道）。如果电子吸收了外界的能量，它就从基态跃迁到激发态能级。从基态跃迁到激发态能级。如果所有的跃迁仅在基态的最低振

10、动能级如果所有的跃迁仅在基态的最低振动能级和第一激发态之间，吸收光谱将是很狭窄和第一激发态之间，吸收光谱将是很狭窄而不连续的谱线。而不连续的谱线。由于分子的由于分子的价电子跃迁总伴随着振动和转价电子跃迁总伴随着振动和转动能级的跃迁动能级的跃迁，所以，紫外分光光度计测，所以，紫外分光光度计测定物质的吸收光谱，虽然有一最大吸收峰定物质的吸收光谱，虽然有一最大吸收峰值，但都是具有一定波长宽度并相对平滑值，但都是具有一定波长宽度并相对平滑的曲线。的曲线。8、光的吸收和圆二色性光的吸收和圆二色性（circular dichroism, CD）若溶液中的溶质对某一波长的入射光有吸收，则透射光的若溶液中的溶

11、质对某一波长的入射光有吸收，则透射光的光强度小于入射光。光强度小于入射光。 圆二色性的存在将通过该物质传播的圆二色性的存在将通过该物质传播的左、右圆偏光左、右圆偏光变成变成椭椭圆偏振光圆偏振光。并且只在发生吸收的波长处才能观察到。并且只在发生吸收的波长处才能观察到。理论计算的圆二色性与该椭圆偏振光的摩尔椭圆率的关系：理论计算的圆二色性与该椭圆偏振光的摩尔椭圆率的关系： = 100/（c l） = 3300（ L-R）：介质对圆偏振光的摩尔消光系数，介质对圆偏振光的摩尔消光系数， c ：样品摩尔浓度，：样品摩尔浓度， l ：样品厚度（：样品厚度（cm ），）， 单位：单位：/（mol cm） 或

12、或 cm2/dmol。圆二色性的表示圆二色性的表示吸收（率）差吸收（率）差 = L - R A = AL AR 椭圆度椭圆度 ，摩尔，摩尔椭圆度椭圆度 = 2.303（AL AR）/4 = 3298（ L - R） 3300 （ L - R） 在蛋白质研究中，常用在蛋白质研究中，常用平均残基摩尔平均残基摩尔椭圆度椭圆度9、ORD与与CD光谱光谱同时产生，同时产生，包括同样的分子结构信息：光学活性物质分包括同样的分子结构信息：光学活性物质分子中的不对称生色团。子中的不对称生色团。CD反映光与分子间能量的交换，反映光与分子间能量的交换，旋光性旋光性则则是与分子中电子的运动有关。是与分子中电子的运动

13、有关。可以由可以由Kronig-Krammers转换方程相互转转换方程相互转换。换。CD谱的极值处与吸收峰一致（科谱的极值处与吸收峰一致（科顿效应，顿效应，cotton effect），），因而因而分子中不同生色团对于谱的贡献分子中不同生色团对于谱的贡献比在比在ORD中更容易分辨。中更容易分辨。ORD是渐近线，两端不回归是渐近线，两端不回归ORDCD吸收带附近，旋光度由负到正吸收带附近，旋光度由负到正正正Cotton效应效应正正CD带带吸收带附近，旋光度由正到负吸收带附近，旋光度由正到负负负Cotton效应效应负负CD带带CDCD比比ORDORD容易辨别重叠峰容易辨别重叠峰CDCD比比ORDO

14、RD弱带易检测弱带易检测CDCD比比ORDORD更容易拟合更容易拟合CDCD比比ORDORD提供较多意义明确的信息提供较多意义明确的信息表明有三个生色团，其中两个有光学活性表明有三个生色团，其中两个有光学活性primary structure, secondary structuretertiary structureAlpha-helix,beta-sheet肽链骨架的构象变化肽链骨架的构象变化蛋白质的紫外吸收光谱主要有两个峰：蛋白质的紫外吸收光谱主要有两个峰：190-250nm：肽键肽键280-290nm：酪氨酸酪氨酸tyr，色氨酸色氨酸trp10、 J-810圆二色光谱仪圆二色光谱仪C

15、CD DM ME E- -r ra ay yS SH HS1M0LSM1M2M3P1M4M5P2S3 L FS2PMO O- -r ra ay yS1-S2:S1-S2:第一级单色器；第一级单色器；S2-S3:S2-S3:第二级单色器第二级单色器; ;M M：球面反光镜；球面反光镜；P P：晶体石英棱镜；晶体石英棱镜；L:L:透镜；透镜；F:F:滤光器；滤光器；由由CDMCDM交互形成的左、右旋圆偏光通过光学活性物质，交互形成的左、右旋圆偏光通过光学活性物质，透射光强度随时间的变化透射光强度随时间的变化当调制电压过其峰值（正和负）时，当调制电压过其峰值（正和负）时，RL时，透过的时，透过的右旋

16、右旋圆偏光的光强对应于圆偏光的光强对应于最大值最大值，而左旋最小（实线）；，而左旋最小（实线）；RL时，透过的时，透过的左旋左旋圆偏光的光强对应于圆偏光的光强对应于最大值最大值，而右旋最小（虚线）。，而右旋最小（虚线）。PMT的输出信号由正比于的输出信号由正比于IA的直流分量和正比于的直流分量和正比于S的交流分量所组成。的交流分量所组成。直流成分直流成分IA=（IL+IR）/2交流成分交流成分S相相当于圆二色性当于圆二色性透射光强的变化频率与外加调制电压的频率相同。透射光强的变化频率与外加调制电压的频率相同。圆二色光谱仪工作原理圆二色光谱仪工作原理 用相同强度，相同频率的左、右旋圆偏光交替照射

17、用相同强度，相同频率的左、右旋圆偏光交替照射样品测得样品测得透过样品后的强度透过样品后的强度IR和和IL 由于由于IR和和IL十分接近，令十分接近，令IA=（IL+IR）/2，S= IR IL 只放大相应于只放大相应于S的的PMT输出电压输出电压Es（交流信号）交流信号），而不放而不放大相应大相应IA的输出电压的输出电压EA。（。（适当选取放大倍数适当选取放大倍数G值，使值，使ESG与与EA可比）。可比）。Peltier Cell HolderCD/Total FluorescenceFMOStopped Flow-20200 The peptide bond is inherently as

18、ymmetric and is always optically active蛋白质的光学活性蛋白质的光学活性1、氨基酸的圆二色性、氨基酸的圆二色性 可见光区可见光区：各种氨基酸都没有光吸收。：各种氨基酸都没有光吸收。 紫外光区紫外光区：只有芳香族：只有芳香族色氨酸、酪氨酸和苯丙氨色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸酸有吸收。有吸收。 氨基酸分子内的氨基酸分子内的紫外生色基团紫外生色基团：吲哚基、酚羟基、吲哚基、酚羟基、苯基、二硫键、咪唑基和羧基等。苯基、二硫键、咪唑基和羧基等。2、肽的圆二色谱、肽的圆二色谱 活性肽构象与其生理功能的关系活性肽构象与其生理功能的关系 肽的构象也是蛋白质构象的一种模型。肽的

19、构象也是蛋白质构象的一种模型。 肽的圆二色性为研究肽在溶液中的构象提供了重要信息。肽的圆二色性为研究肽在溶液中的构象提供了重要信息。Far-UV (250-170nm) Secondary Structure: -helix, -sheet, -turn, random Tertiary Structure Class: all-, +, /, all-I, all-IINear-UV (320-250nm)： aromatic side chainNear-UV Near-infrared (300-1000nm)： colored proteins苯丙氨酸（苯丙氨酸（ phenylalan

20、ine， Phe）：255、261和和268nm附近；附近；酪氨酸（酪氨酸（ tyrosine， Tyr） ：277nm左右；左右；色氨酸（色氨酸（ tryptophan， Trp） ： 279、284和和291nm附近；附近；二硫键的变化反映在整个近紫外区。二硫键的变化反映在整个近紫外区。 芳香氨基酸残基芳香氨基酸残基及及二硫键二硫键处于不对称微环境时，处于不对称微环境时，在在近紫外区近紫外区表现出表现出CD信号信号Far UV CD spectra of poly-L-Lys1、100% -螺旋螺旋2、100% -折叠折叠3、100%无规卷曲无规卷曲- band (nm)+ band (n

21、m)-helix 222208192-sheet216195-turn220-230 (weak)180-190 (strong)205polypro II helix190210-230 weakRandom coil200212Main CD features of protein 2ndary structures 3 3、估算蛋白质、估算蛋白质二级结构二级结构含量含量仅适合仅适合 含量较高的蛋白质！含量较高的蛋白质！将测得的将测得的CDCD曲线与标准曲线拟合。曲线与标准曲线拟合。x + xb b + xc = 1.0 t = x + xb b b b + xc c改变改变x、xb和和x

22、c，使使t与样本曲线最佳拟合（最小二乘法，与样本曲线最佳拟合（最小二乘法，least squares minimization ）未知结构的蛋白的未知结构的蛋白的CDCD信号信号myoglobin t = x + xb b b b + xc cfits best with x = 80% xb = 0%xc = 20% agrees well with structure 78% helix, 22% coilFor further details: /cd/cdtutorial.htmGCN4-p1 0oC：100% helix75oC：0% he

23、lixwhat about 50oC? t = xoo + x7575fits best with xo = 50% x75= 50%Shows that at 50oC1/2 of peptide -helix dimer1/2 of peptide random coil monomerCD signals for GCN4-p1OShea et al. Science (1989) 243:538figure 3: 34M GCN4-p1 in 0.15M NaCl, 10mM phosphate pH 7.0wavelength in nm19020021022023024025026

24、0 in 1000 deg cm2dmol-1-40-30-20-10010203040506070800 OC50 OC75 OCfit to GCN4-p1 50OC datawavelength in nm200210220230240250MRE in 1000 degs cm2mol-1-25-20-15-10-50510original databest fit with mix of 0OC and 75OC spectra Lau, Taneja and Hodges (1984) J.Biol.Chem. 259:13253-13261螺旋二聚体分解为单螺旋螺旋二聚体分解为单

25、螺旋三氟乙醇三氟乙醇 （trifluoroethanol，TFE）诱导肽链形成螺旋诱导肽链形成螺旋Effect of 50% TFE on a monomeric peptidewavelength in nm200210220230240MRE-35-30-25-20-15-10-50peptide in waterpeptide in 50% TFETFEEffect of 50% TFE on a coiled-coilwavelength in nm200210220230240MRE-35-30-25-20-15-10-50TM-36 aqueousTM-36 + TFETFETFE

26、对卷曲螺旋对卷曲螺旋（coiled-coil）的影响的影响 chymotrypsin (all b) lysozyme ( + b) triosephosphate isomerase(/b) myoglobin (all )CD signal of a protein depends on its 2ndary structurepHpH变化引起的变化引起的肌球素变性前后肌球素变性前后CDCD谱的动力学变化谱的动力学变化稀释前后的荧光和稀释前后的荧光和CDCD谱谱从伸展到折叠从伸展到折叠螺旋含量的变化的动螺旋含量的变化的动力学检测力学检测Kinetic Trace at 222nm(seco

27、ndary structure region)Unfolding state (random)Refolding state (-Helix)Kinetic traces at 289nm (Aromatic side chain region)细胞色素细胞色素c c伸展和折叠状态的伸展和折叠状态的CDCD和荧光光谱和荧光光谱反映了芳环侧链（色氨酸残基）的变化反映了芳环侧链（色氨酸残基）的变化盐酸胍盐酸胍中的细胞色素中的细胞色素c c(伸展状态伸展状态) 与与PBSPBS混合后的混合后的CDCD和荧光光谱和荧光光谱6、磁圆二色谱、磁圆二色谱（ Magnetic Circular Dichroi

28、sm ，MCD） 磁性材料对左、右圆偏光的吸收不同而产生的二色磁性材料对左、右圆偏光的吸收不同而产生的二色性现象。性现象。 利用法拉第效应，在外加磁场的作用下，许多原来利用法拉第效应，在外加磁场的作用下，许多原来没有光学活性的物质也具有了光学活性，原来可测没有光学活性的物质也具有了光学活性，原来可测得得CD谱的，在磁场中谱的，在磁场中CD信号可增大几个数量级。信号可增大几个数量级。 7000 Gauss 实验要点实验要点Sample concentration A good suggestion is to run in advance an absorption UV-VIS spectra

29、. CD spectroscopy calls for same requirements as UV-VIS: best S/N is obtained with absorbance level in the range 0.6 to 1.2. Its usually difficult to get proper data when absorbance (of sample + solvent) is over 2 O.D. 样品杯：高度均匀的熔融石英，不会带来附加的圆二色性。样品杯：高度均匀的熔融石英，不会带来附加的圆二色性。 光程：光程：0.01cm-1cm，为了降低溶剂影响，一般

30、提高样品浓为了降低溶剂影响，一般提高样品浓度，用短光程。度，用短光程。cell pathlengthNitrogen flushingFlushing the optics with dry nitrogen is a must: Xe lamp has a quartz envelope, so if operated in air itll develop a lot of ozone, harmful for the mirrors below 195nm oxygen will absorb radiationHT plot The HT plot is very important,

31、 since readings above 600-650V mean that not enough light is reaching the detector so a sample dilution or the use of shorter path cell are required. the HT plot is in realty a single beam spectra of our sample, since there is a direct relation between HT and sample absorbance. By data manipulation

32、HT conversion into absorbance and buffer baseline subtraction is possible. Alternatively single beam absorbance scale can be used already in CH2 during data collection, loosing however a bit the alerting functions of this channel.Bandwidth (SBW) selectionSetting of slits should be as large as possib

33、le (to decrease noise level), but compatible to the natural bandwidth (NBW) of the bands to be scanned.As a rule SBW should be kept at least 1/10 of the NBW, otherwise the band will be distorted.If NBW is not known a series of fast survey spectra at different SBW will help proper selection. Trade in

34、 of accuracy versus sensitivity (i.e. the use of larger than theoretical SBW) is occasionally required.2 nm in the far UV region1 nm in the aromatic region (where fine structures may be present), optimal band-pass (as large as possible, but not loosing information) can be determined after a trial 标准

35、操作时谱带宽度选为标准操作时谱带宽度选为1nm； 高分辨率测量用较窄的狭缝宽度，此时高分辨率测量用较窄的狭缝宽度，此时PMT电压较高，电压较高，信噪比差；信噪比差； 当样品的光密度很高、当样品的光密度很高、CD很小时，就要保持测试很小时，就要保持测试CD峰多需要的足够浓度，并用较宽的狭缝宽度。此时，峰多需要的足够浓度，并用较宽的狭缝宽度。此时，由于样品由于样品OD值过高，可能存在有荧光或杂散光引起的值过高，可能存在有荧光或杂散光引起的某些假象。某些假象。Number of data point data pitch, i.e. number of data points per nm, wil

36、l not directly influence the noise level. However if post run further data processing will be applied to reduce the noise, its advisable to collect as many data points as possible to increase the efficiency of the post run filtering algorithmAccumulation another way to improve S/N is to average more

37、 spectra. Here too the S/N will improve with the square root of the number of accumulations. Averaging is very effective since it compensates short term random noise, but itll not compensate long term drifts (mainly of thermal origin). So if long accumulations are used we recommend a suitable long warm-up of the system and/or the use of a sample alternator (to collect sequentially sample and blank and average their subtracted values). For long overnight accumulations its