细胞产物分析技术-吸光光度法-2012

1、基本原理基本原理吸光光度法吸光光度法 是基于被测物质的是基于被测物质的分子分子 对对光光 具有选择吸收具有选择吸收的特性而建立的分析方法。的特性而建立的分析方法。光的电磁波性质光的电磁波性质 射射线线x射射线线紫紫外外光光红红外外光光微微波波无无线线电电波波10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm可可 见见 光光完全吸收完全吸收完全透过完全透过吸收黄色光吸收黄色光光谱示意光谱示意表观现象示意表观现象示意复合光复合光基本原理基本原理光作用于物质时，物质吸收了可见光，而显示出特征的颜光作用于物质时，物质吸收了可见光，而显示出特征的颜

2、色，这一过程与物质的色，这一过程与物质的 性质及光的性质有关。性质及光的性质有关。hchEEE02h S2S1S0S3E2E0E1E302EEhh h h 基本原理基本原理吸收光谱吸收光谱 Absorption SpectrumS2S1S0S3h E2E0E1E3S2S1S0h A h h h 分子内电子跃迁分子内电子跃迁带状光谱带状光谱 A基本原理基本原理物质对光的选择吸收物质对光的选择吸收物质的电子结构不同，所能吸收光的物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础。波长也不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础。例：例： A 物质物质B 物质物质evEE5 .

3、 201EhcA191034106 . 1)(5 . 21031062. 6ev)(10774. 45cmnm4 .477evEE0 . 201EhcBnm6 .620同理，得：同理，得：1 ev = 1.6 10-19 J.基本原理基本原理透光率透光率 （透射比）（透射比）Transmittance透光率定义：透光率定义：0IITtT 取值为取值为0.0 % 100.0 %全部吸收全部吸收T = 0.0 %全部透射全部透射T = 100.0 %入射光入射光 I0透射光透射光 It基本原理基本原理AKcbTlgT ： 透光率透光率A： 吸光度吸光度KbcAT1010Lambert Beer L

4、aw基本原理基本原理b ：吸光液层的厚度，光程，：吸光液层的厚度，光程， cmc：吸光物质的浓度，：吸光物质的浓度， g / L, mol / LK：比例常数：比例常数K K acbAacbA c：mol / Lc：g / LAC吸光定律吸光定律A或或 吸收光谱吸收光谱A C max基本原理基本原理吸光的加合性吸光的加合性多组分体系中，如果各组分之间无相互作用，其吸光度具多组分体系中，如果各组分之间无相互作用，其吸光度具有加合性，即有加合性，即iiiiiiiicbbcAA对吸收定律偏离对吸收定律偏离AC主要原因主要原因非单色光非单色光吸光质点的相互作用吸光质点的相互作用基本原理基本原理吸光分析

5、法吸光分析法目视比色法目视比色法标准系列标准系列未知样品未知样品特点特点利用自然光利用自然光比较吸收光的互补色光比较吸收光的互补色光准确度低（半定量）准确度低（半定量）不可分辨多组分不可分辨多组分方法简便，灵敏度高方法简便，灵敏度高光电比色法光电比色法Ultraviolet Visual Spectroscopy0.575光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示显示I0It参比参比样品样品bCTIIAtlglg0入射光入射光 I0透射光透射光 It仪器简介仪器简介紫外紫外-可见分光光度计组件可见分光光度计组件光源光源单色器单色器样品池样品池检测器检测器信号输出信号输出氢灯，氘灯，氢灯，

6、氘灯，185 350 nm； 卤钨灯，卤钨灯，250 2000 nm.基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定作用：将复合光色散成单色光作用：将复合光色散成单色光棱镜棱镜光栅光栅玻璃，玻璃， 350 2500 nm, 石英，石英，185 4500 nm平面透射光栅，平面透射光栅， 反射光栅反射光栅玻璃，光学玻璃，石英玻璃，光学玻璃，石英作用：将光信号转换为电信号，并放大作用：将光信号转换为电信号，并放大光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄像管（多道分析器）像管（多道分析器）表头、记录仪、屏幕、数字显示表头、记录仪、屏幕、数

7、字显示仪器简介仪器简介单波长单光束分光光度计单波长单光束分光光度计0.575光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示显示仪器简介仪器简介单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计比值比值光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示显示光束分裂器光束分裂器仪器简介仪器简介灵敏度灵敏度吸光光度法是一种适合于微量组分测定的仪器分析法，吸光光度法是一种适合于微量组分测定的仪器分析法，检测限大多可达检测限大多可达10-3 10-4 g / L 或或 g / mL 数量级。数量级。准确度准确度能满足微量组分测定的要求。一般相对误差能满足微量组分测定的要求。一般相对误差 25 %。例如，。例如

8、，石灰石中微量铁，含量为石灰石中微量铁，含量为 0.067 %，相对误差以，相对误差以 5 %计算，计算，结果为结果为 0.064 0.070 %，绝对误差为，绝对误差为 0.003 %灵敏度与准确度灵敏度与准确度对同一种待测物质，不同的方法具有不同的对同一种待测物质，不同的方法具有不同的 ，表明具表明具有不同的灵敏度。有不同的灵敏度。例，分光光度法测铜例，分光光度法测铜铜试剂法测铜试剂法测 Cu 426 = 1.28 104 Lmol-1cm-1双硫腙法测双硫腙法测 Cu 495 = 1.58 105 Lmol-1cm-1一般情况一般情况 105低灵敏度低灵敏度中等灵敏度中等灵敏度高灵敏度高

9、灵敏度灵敏度不同的本质灵敏度不同的本质原因是什么原因是什么？灵敏度与准确度灵敏度与准确度根据误差传递公式，推导根据误差传递公式，推导出浓度测量的相对偏差为出浓度测量的相对偏差为TAlgTln434. 0TTdcdcETrlnT = 0.368 = 36.8 %A = 0.434 为了减少测量误差，控制为了减少测量误差，控制溶液的吸光度溶液的吸光度 A = 0.15 1T = 70 10 %误差公式推导误差公式推导0.368灵敏度与准确度灵敏度与准确度测定波长的选择测定波长的选择无干扰，选择无干扰，选择 max有干扰有干扰A A 待测溶液吸光度的选择待测溶液吸光度的选择控制控制A = 0.15

10、1 T = 70 % 10% 方法方法选择选择 C选择选择 b1、非单色光、非单色光影响小影响小2、灵敏度高、灵敏度高灵敏度与准确度灵敏度与准确度参比液的选择参比液的选择原则：原则：扣除非待测组分的吸收扣除非待测组分的吸收以显色反应为例进行讨论以显色反应为例进行讨论M + R = M-R max试液试液 显色剂显色剂 溶剂溶剂 吸光物质吸光物质 参比液组成参比液组成无吸收无吸收无吸收无吸收光学透明光学透明溶剂溶剂基质吸收基质吸收无吸收无吸收吸收吸收不加显色剂的试液不加显色剂的试液无吸收无吸收吸收吸收吸收吸收显色剂显色剂基质吸收基质吸收吸收吸收吸收吸收吸收吸收显色剂显色剂 + 试液试液 + 待待

11、测组分的掩蔽剂测组分的掩蔽剂若欲测若欲测 M-R 的吸收的吸收 maxA （样）（样） = A （待测吸光物质）（待测吸光物质） + A （干扰）（干扰）+ A （池）（池）A （参比）（参比） = A （干扰）（干扰）+ A （池）（池）灵敏度与准确度灵敏度与准确度显色反应显色反应有机物质有机物质官能团强吸收官能团强吸收直接测定直接测定UV-VIS官能团弱吸收官能团弱吸收衍生化反应衍生化反应UV-VIS显色反应显色反应无机物质无机物质通常通过显色反应生成吸光系数大的有色通常通过显色反应生成吸光系数大的有色物质进行测定，以提高灵敏度物质进行测定，以提高灵敏度3Fe2+3NN+NNFe2+桔红色

12、桔红色 max邻二氮菲邻二氮菲酸度的影响酸度的影响副反应副反应M + nR = MRnOH-H+存在型体的变化存在型体的变化RH = R- + H+ 1 2生成不同配比的络合物生成不同配比的络合物例，磺基水杨酸例，磺基水杨酸 Fe 3+pH = 2 3FeR紫红色紫红色pH = 4 7FeR2橙色橙色pH = 8 10FeR3黄色黄色酸度的选择酸度的选择pHR(H)M(OH)，可得适宜可得适宜pH范围范围实际工作中，作实际工作中，作 A pH 曲曲线，寻找适宜线，寻找适宜 pH 范围。范围。ApHM + nR = MRnOH-H+显色剂的用量显色剂的用量M + nR = MRn实际工作中，作实

13、际工作中，作 A CR 曲曲线，寻找适宜线，寻找适宜 CR 范围。范围。ACR微量组分的测定微量组分的测定单组分的测定单组分的测定多组分的测定多组分的测定介绍一种介绍一种 解联立方程法解联立方程法A XY 1 2根据加合性原则根据加合性原则yxAAA111yyxxbcbc11yxAAA222yyxxbcbc22解联立方程，可求得解联立方程，可求得Cx, Cy 为物质的特征参数，可通过配制标为物质的特征参数，可通过配制标准溶液测得。准溶液测得。请设计一个测定两组请设计一个测定两组分的浓度的实验方案分的浓度的实验方案ACs(x)x1x2纯物质或共存物质不干扰纯物质或共存物质不干扰单组分的测定单组分的测定微量铁的测定微量铁的测定氨基酸的测定氨基酸的测定邻二氮菲法邻二氮菲法茚三酮法茚三酮法蛋白质的测定蛋白质的测定考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法总磷的测定总磷的测定磷钼蓝法磷钼蓝法海水中营养盐的测定海水中营养盐的测定返回返回示差光度法示差光度法常规法常规法