高效液相色谱仪的应用ppt课件

1、l 高效液相色谱仪l主讲：李春萍l西北农林科技大学生命科学学院 llcccp2006126l15996045内容内容l色谱法根本知识色谱法根本知识l高效液相色谱相关内容高效液相色谱相关内容l影响分别的要素影响分别的要素l实验前预备任务实验前预备任务l主要分析步骤主要分析步骤 一、色谱分析法一、色谱分析法来源根本概念分类来源来源:1906年俄国植物学家米哈伊年俄国植物学家米哈伊尔尔茨维特茨维特 色谱分别法色谱分别法 又称层析法，又称层析法，层离法等，是一种现代的层离法等，是一种现代的物理化学分别、分析方法，物理化学分别、分析方法，广泛运用于化学、医药、广泛运用于化学、

2、医药、生化、环保等领域，它既生化、环保等领域，它既可用于混合物的分别和样可用于混合物的分别和样品纯度的检查，又可用于品纯度的检查，又可用于对化合物的定性和定量分对化合物的定性和定量分析。析。分别分别植物植物色素色素根本概念根本概念l基线：色谱柱中只需流动相经过时，检测器呼应信号的记录值。它反映基线：色谱柱中只需流动相经过时，检测器呼应信号的记录值。它反映检测器本底的高低。检测器本底的高低。l噪声：由未知的偶尔要素引起的基线起伏景象。噪声：由未知的偶尔要素引起的基线起伏景象。l峰宽：经过色谱峰两侧的拐点切线，在基线上所截的间隔。峰宽：经过色谱峰两侧的拐点切线，在基线上所截的间隔。l保管时间：从进

3、样点到色谱峰的顶峰的时间。保管时间：从进样点到色谱峰的顶峰的时间。l死时间：流动相经过色谱系统的时间。在死时间：流动相经过色谱系统的时间。在HPLCHPLC中为溶剂峰前沿出现的时中为溶剂峰前沿出现的时间。间。l死体积：进样器到检测器出口未被固定相所占有的空间。死体积：进样器到检测器出口未被固定相所占有的空间。l色谱峰：流出曲线上的突起部分。色谱峰：流出曲线上的突起部分。l分配系数分配系数K K：分配平衡后，组分在固定相与流动相中的浓度之比。：分配平衡后，组分在固定相与流动相中的浓度之比。K K与组分、固定相、流动相及温度有关。与组分、固定相、流动相及温度有关。l容量因子容量因子k k：也叫分配

4、容量、容量比及质量分配系数等，是到达分：也叫分配容量、容量比及质量分配系数等，是到达分配平衡后，组分在固定相的量与流动相中的量之比。配平衡后，组分在固定相的量与流动相中的量之比。根本概念根本概念l基线漂移：基线漂移： 是基线的一种向上或向下的缓慢挪动，可在较长时间是基线的一种向上或向下的缓慢挪动，可在较长时间0.5-1.0h0.5-1.0h内观测到。可掩蔽噪声和小峰，它与整个液相色谱系内观测到。可掩蔽噪声和小峰，它与整个液相色谱系统有关。统有关。l线性范围：当注入最小至最大进样量时，检测器呼应处于与进样量线性范围：当注入最小至最大进样量时，检测器呼应处于与进样量成正比的范围。成正比的范围。l检

5、测器的池体积：它应小于最早流出的死时间色谱峰的洗脱体积的检测器的池体积：它应小于最早流出的死时间色谱峰的洗脱体积的1/101/10，否那么会产生严重的柱外谱带扩展。，否那么会产生严重的柱外谱带扩展。l灵敏度：也叫呼应值，指一定量的物质经过检测器时所给出的信号灵敏度：也叫呼应值，指一定量的物质经过检测器时所给出的信号大小。灵敏度越高，检测限越小。它是没有思索噪声，其高低变化大小。灵敏度越高，检测限越小。它是没有思索噪声，其高低变化并不能严厉表示检测器的检测才干。并不能严厉表示检测器的检测才干。l检测限：又称为敏感度，指在噪声背景上恰能产生可区分的信号时检测限：又称为敏感度，指在噪声背景上恰能产生

6、可区分的信号时普通讯噪比普通讯噪比22， 在单位体积或单位时间内需向检测器送入的在单位体积或单位时间内需向检测器送入的样品量。它思索了噪声，是全面衡量检测器性能的重要目的。检测样品量。它思索了噪声，是全面衡量检测器性能的重要目的。检测限越小，仪器性能越好。限越小，仪器性能越好。色谱法分类色谱法分类按分别的机理可分为：按分别的机理可分为：吸附色谱：是利用吸附剂外表对不同组分吸附色谱：是利用吸附剂外表对不同组分吸附性能的差别而使混合物得以分别。吸附性能的差别而使混合物得以分别。分配色谱：是利用不同组分在固定相与流分配色谱：是利用不同组分在固定相与流动相间的分配系数或溶解度不同而动相间的分配系数或溶

7、解度不同而使混合物得以分别。使混合物得以分别。 离子交换色谱：是利用不同组分对离子交离子交换色谱：是利用不同组分对离子交换剂亲和力不同而使混合物得以分别。换剂亲和力不同而使混合物得以分别。 凝胶色谱凝胶色谱( (排阻色谱排阻色谱) )：是利用凝胶对不同：是利用凝胶对不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同使组分因分子大小不同而阻滞作用不同使混合物得以分别。混合物得以分别。 亲和色谱、毛细管电泳和毛细管电色谱。亲和色谱、毛细管电泳和毛细管电色谱。色谱法分类色谱法分类按操作方式可分为：按操作方式可分为：薄层色谱：吸附、分配、离子交换、凝胶薄层。薄层色谱：吸附、分配、离子交换、凝胶薄层。纸色谱：分配色谱

8、。纸色谱：分配色谱。柱色谱：吸附、分配、离子交换、凝胶柱色谱。柱色谱：吸附、分配、离子交换、凝胶柱色谱。按流动相形状的不同，可分为：按流动相形状的不同，可分为：气相色谱法气相色谱法 (GC)(GC)液相色谱法液相色谱法 (LC)(LC)超临界流体色谱超临界流体色谱 (SFC)(SFC)二、高效液相色谱相关内容二、高效液相色谱相关内容l特点特点l研讨对象研讨对象l高效液相色谱仪展现高效液相色谱仪展现l高效液相色谱仪任务流程高效液相色谱仪任务流程l高效液相色谱仪构造高效液相色谱仪构造l高效液相色谱法分类高效液相色谱法分类1 HPLC1 HPLC特点特点高效液相色谱法是高效液相色谱法是2020世纪世

9、纪6060年代后期开展起来的一种年代后期开展起来的一种新颖、快速的分别分析技术。新颖、快速的分别分析技术。高高 压：压力可达压：压力可达1.52-3.04) 1.52-3.04) 104 kPa104 kPa。高高 速：所需的分析时间普通少于速：所需的分析时间普通少于1h1h。高高 效：一根柱子可以分别效：一根柱子可以分别100 100 种以上的组分。种以上的组分。高灵敏度：用微升数量级的试样可进展分析。高灵敏度：用微升数量级的试样可进展分析。流动相选择范围广：大部分的有机溶剂以及水流动相选择范围广：大部分的有机溶剂以及水 和有机溶剂的混合物均可用。和有机溶剂的混合物均可用。经典色谱法2 2

10、研讨对象研讨对象高沸点化合物；高沸点化合物；难挥发及热不稳定的化合物；难挥发及热不稳定的化合物；离子型化合物及高聚物等。离子型化合物及高聚物等。色谱仪分类色谱仪分类液相色谱仪液相色谱仪气相色谱仪气相色谱仪分析用色谱仪分析用色谱仪制备用色谱仪制备用色谱仪流程色谱仪流程色谱仪液液色谱仪液液色谱仪液固色谱仪液固色谱仪气液色谱仪气液色谱仪气固色谱仪气固色谱仪排阻色谱排阻色谱吸附色谱吸附色谱离子色谱离子色谱超临界液体色谱超临界液体色谱分配色谱分配色谱3 3 高效液相色谱仪展现高效液相色谱仪展现3 3 高效液相色谱仪展现高效液相色谱仪展现3 3 高效液相色谱仪展现高效液相色谱仪展现3 3 高效液相色谱仪展

11、现高效液相色谱仪展现3 3 高效液相色谱仪展现高效液相色谱仪展现l贮液器中的流动相被高压泵打入贮液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱固动相，被流动相载入色谱柱固定相内，由于样品溶液中的各定相内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系组分在两相中具有不同的分配系数。在两相中作相对运动时，经数。在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附过反复多次的吸附-解吸的分配解吸的分配过程，各组分在挪动速度上产生过程，各组分在挪动速度上产生较大的差别，被分别成单个组分较大的差别，被分别成单个组分依次从柱内流出。经过检测器时，依次从柱内

12、流出。经过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱方式打印出记录仪，数据以图谱方式打印出来。来。 4 4 高效液相色谱仪任务流程高效液相色谱仪任务流程5 5 高效液相色谱仪的构造高效液相色谱仪的构造l高压输液系统高压输液系统l进样系统进样系统l分别系统分别系统l检测系统检测系统l色谱数据处置系统色谱数据处置系统高压输液系统高压输液系统包括：包括：流动相储存器流动相储存器高压输液泵中心部件高压输液泵中心部件: : 能提供能提供150-450kg/cm2150-450kg/cm2的压强；流速稳的压强；流速稳定，流量可以调理；应符合：密封性好、输出流量恒定

13、、压力平定，流量可以调理；应符合：密封性好、输出流量恒定、压力平稳、可调范围宽、便于迅速改换溶剂及耐腐蚀等要求。稳、可调范围宽、便于迅速改换溶剂及耐腐蚀等要求。过滤器过滤器梯度洗脱安装梯度洗脱安装 : : 可将两种或两种以上的不同极性溶剂，按一定程可将两种或两种以上的不同极性溶剂，按一定程序延续改动组成，以提高分别效果，缩短分别时间。序延续改动组成，以提高分别效果，缩短分别时间。 高压输液系统高压输液系统泵的保养泵的保养l 运用流动相尽量要清洁；运用流动相尽量要清洁；l 进液处的砂芯过滤头要经常清洗；进液处的砂芯过滤头要经常清洗；l 流动相交换时要防止沉淀；流动相交换时要防止沉淀； l 防止泵

14、内堵塞或有气泡。防止泵内堵塞或有气泡。进样系统进样系统l注射器进样注射器进样l高压定量进样阀高压定量进样阀泵泵排放排放进样进样柱柱泵泵柱柱进样进样排放排放5 5 高效液相色谱仪部件高效液相色谱仪部件 进样方式与用量进样方式与用量l六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。运用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的运用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的7575，并且要求每次进样体积准确、一样；并且要求每次进样体积准确、一样；l运用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的运用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3 3

15、至至5 5倍，这样才干完全置换样品定量环内残留的溶液，到达所倍，这样才干完全置换样品定量环内残留的溶液，到达所要求的精细度及重现性。要求的精细度及重现性。六通阀运用和维护本卷须知：六通阀运用和维护本卷须知：l样品溶液进样前必需用样品溶液进样前必需用0.45m0.45m滤膜过滤，以滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。减少微粒对进样阀的磨损。l转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否那么流动相受阻，使泵内压力剧增，置，否那么流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超越泵的最大压力；再转到进样位时，甚至超越泵的最大压力；再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。过高的

16、压力将使柱头损坏。l为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析终了后应冲洗进样阀。分析终了后应冲洗进样阀。 分别系统分别系统l色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。l柱管资料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合资料的其他金属。金属管用得较多。l普通备有一个前置柱预柱。l柱子装填得好坏对柱效影响很大。l开展趋势是: 减小填料粒度和柱径以提高柱效。柱子外形柱子外形l色谱柱普通长色谱柱普通长5 530cm30cm，内径，内径4 45mm5mm，凝胶色谱柱内，凝胶色谱柱内径径3 312mm12mm，制备柱内径较大，可达，制备柱内径较大，可达25m

17、m25mm以上。以上。5cm10cm15cm40cm色谱柱的保养色谱柱的保养 对硅胶基键合相填料，水溶液流动相的对硅胶基键合相填料，水溶液流动相的pH值不得超出值不得超出2-8.5范围范围(eg：C18柱柱pH范围是范围是2-8)，温度不宜过高。，温度不宜过高。 不能剧烈震动，否那么柱内填料床层产生裂痕和空隙。不能剧烈震动，否那么柱内填料床层产生裂痕和空隙。 阀件或管路一定要清洗干净；流动相要脱气；防止逆向流动，使阀件或管路一定要清洗干净；流动相要脱气；防止逆向流动，使固定相层位移，柱效下降。固定相层位移，柱效下降。 进样样品要提纯并严厉控制进样量；进样样品要提纯并严厉控制进样量； 在酸或碱性

18、条件下运用后，应依次用水和甲醇清洗。在酸或碱性条件下运用后，应依次用水和甲醇清洗。 每天分析任务终了后，要清洗进样阀中残留的样品和适当的每天分析任务终了后，要清洗进样阀中残留的样品和适当的 溶剂溶剂来清洗色谱柱；来清洗色谱柱； 假设长期不运用，运用适当有机溶剂保管并封锁。假设长期不运用，运用适当有机溶剂保管并封锁。检测系统检测系统 特点：运用最广，对大部分的有机化合物特点：运用最广，对大部分的有机化合物有呼应；灵敏度高；线性范围广；波长可有呼应；灵敏度高；线性范围广；波长可选；对流动相的流速和温度变化不敏感，选；对流动相的流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。分析前，色谱柱平衡

19、差分析前，色谱柱平衡差不多时，翻开检测器；不多时，翻开检测器；分析完成后，马上封锁分析完成后，马上封锁检测器。检测器。吸光度吸光度l是通用型检测器由于每种物质具有不同的折光指是通用型检测器由于每种物质具有不同的折光指数；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱。数；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱。类型类型 ：偏转式偏转式反射式反射式干涉型干涉型l高灵敏度、高选择性：对多环芳烃，维生素高灵敏度、高选择性：对多环芳烃，维生素B B、 黄曲黄曲霉素、卟啉类、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等霉素、卟啉类、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有呼应。有呼应。l又称蒸发型质量检测器，属于通用又称蒸发型质

20、量检测器，属于通用型质量检测器。其任务原理：样品型质量检测器。其任务原理：样品组分从色谱柱后流出，进入检测器组分从色谱柱后流出，进入检测器后，阅历雾化、流动相蒸发和光后，阅历雾化、流动相蒸发和光源光路检测三个步骤。源光路检测三个步骤。流动相流动相雾化气体雾化气体雾化雾化蒸发蒸发检测检测蒸发器蒸发器雾化器雾化器 光源光路Step 1: Nebulization Column effluent passes through nebulizer needle Mixes with nitrogen gas Forms dispersion of dropletsStep 2: Mobile Phas

21、e Evaporation Droplets pass through a heated zone Mobile phase evaporates from the sample particle Dried sample particles remainStep 3: Detection Sample particles pass through an optical cell Sample particles interrupt laser beam and scatter light Photodiode detects the scattered light ELSDELSD优缺陷优缺

22、陷l与示差折光检测器相比：与示差折光检测器相比：l 灵敏度高；灵敏度高；l 对流动相系统温度变化不敏感；对流动相系统温度变化不敏感；l 可进展梯度洗脱。可进展梯度洗脱。l与紫外与紫外- -可见光检测器相比：可见光检测器相比：l 能处理最困难的能处理最困难的HPLCHPLC检测问题。可对磷脂、皂苷、检测问题。可对磷脂、皂苷、糖类、聚合物、树脂等无紫外吸收或紫外吸收系数糖类、聚合物、树脂等无紫外吸收或紫外吸收系数很小的化合物进展检测；很小的化合物进展检测；l 无需测定定量校正因子。无需测定定量校正因子。优优 点：可以梯度洗脱；流动池死体积不影响点：可以梯度洗脱；流动池死体积不影响检测灵敏度、喷雾气

23、体耗费量少；雾化器和漂检测灵敏度、喷雾气体耗费量少；雾化器和漂移管易于清洗。移管易于清洗。缺缺 点：受样品组分和流动相挥发性的影响。点：受样品组分和流动相挥发性的影响。用用 途：监测碳水化合物、脂肪酸、油脂、聚途：监测碳水化合物、脂肪酸、油脂、聚合物、药物等多种样品。合物、药物等多种样品。6 HPLC6 HPLC分类及分别原理分类及分别原理l吸附色谱吸附色谱l分配色谱分配色谱l离子交换色谱离子交换色谱l凝胶色谱凝胶色谱l亲和色谱亲和色谱吸附色谱吸附色谱l固固 定定 相：固体吸附剂，如相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常运用的硅胶、氧化铝等，较常运用的是是5-10m5-10m的硅胶吸附剂。的硅

24、胶吸附剂。l流流 动动 相：不同极性的一元相：不同极性的一元或多元溶剂。或多元溶剂。l原原 理：根据填充剂吸附理：根据填充剂吸附活性点对样品的吸收系数不同活性点对样品的吸收系数不同而分别。而分别。l适用范围：分别相对分子质量适用范围：分别相对分子质量中等的脂溶性试样，对具有官中等的脂溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高能团的化合物和异构体有较高选择性。选择性。Flow流动相流动相活性吸附点活性吸附点固定相固定相液固吸附色谱液固吸附色谱分配色谱分配色谱l固定相与流动相均为液体；固定相与流动相均为液体；l根本原理：组分在固定相和流动相上的分配；根本原理：组分在固定相和流动相上的分配；l流流

25、 动动 相：对于亲水性固定液，采用疏水性流相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性正相动相，即流动相的极性小于固定液的极性正相 normal phasenormal phase，反之，流动相的极性大于固定，反之，流动相的极性大于固定液的极性反相液的极性反相 reverse phasereverse phase. .正向色谱法与反相色谱法比较正向色谱法与反相色谱法比较从下表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色从下表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界限如氨基键合固定相。谱法没有明显的界限如氨基键合固定相。正向色谱法正向色谱法反相色谱法反相色谱

26、法固定相极性固定相极性高中高中中低中低流动相极性流动相极性低中低中中高中高组分洗脱顺序组分洗脱顺序极性小的先洗出极性小的先洗出 极性大的先洗出极性大的先洗出分配色谱分配色谱l固固 定定 相：早期涂渍固定液，固定液流失，相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；较少采用；l化学键合固定相：将各种不同基团经过化学反化学键合固定相：将各种不同基团经过化学反响键合到硅胶外表的游离羟基上响键合到硅胶外表的游离羟基上; ; lC-18C-18柱反相柱。柱反相柱。l l 化学键合固定相化学键合固定相: 目前运用最广、性能最正确的固定相。目前运用最广、性能最正确的固定相。l a. 硅氧碳键型：硅氧碳键型： S

27、i O Cl b. 硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：Si O Si C l 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，运用最广稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，运用最广l c. 硅碳键型：硅碳键型： Si Cl d. 硅氮键型：硅氮键型： Si N离子交换色谱离子交换色谱l 根本原理：组分在固定相上发生离子交换反响。根本原理：组分在固定相上发生离子交换反响。 l 阳离子交换：阳离子交换：R-SO3H+M+=R-SO3M+H+ l 阴离子交换：阴离子交换：R-NR4OH+X-=R-NR4X+OH-l 应应 用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。凝胶色谱凝胶色谱固定相：固

28、定相： 凝胶凝胶( (具有一定大小孔隙分具有一定大小孔隙分布布) )；原原 理：按分子大小分别，又称为排理：按分子大小分别，又称为排阻色谱反筛子。小分子可以分阻色谱反筛子。小分子可以分散到凝胶空隙，由其中经过，出峰散到凝胶空隙，由其中经过，出峰最慢；中等分子只能经过部分凝胶最慢；中等分子只能经过部分凝胶空隙，中速经过；而大分子被排斥空隙，中速经过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。按试样中分子大小的在最后出峰。按试样中分子大小的不同来进展分别。充填剂多采用：不同来进展分别。充填剂多采用：一定孔径的多孔性聚合物。一定孔径的多孔性聚合物。 亲和色

29、谱亲和色谱原理：原理： 利用生物大分子和固定相外表利用生物大分子和固定相外表存在的某种特异性亲和力，进展选存在的某种特异性亲和力，进展选择性分别。择性分别。 先在载体外表键合上一种具有先在载体外表键合上一种具有普通反响性能的所谓间隔臂普通反响性能的所谓间隔臂( (环氧、环氧、联胺等联胺等) )，再衔接上配基，再衔接上配基( (酶、抗原酶、抗原等等) )，这种固载化的配基只能和具有，这种固载化的配基只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保管。而被保管。三、影响分别的要素三、影响分别的要素l流动相黏度：降低传质阻力是提高柱效主要途流动相黏度：降低传质阻力是提高柱

30、效主要途径。径。l固定相粒度：降低固定相粒度可提高柱效。固定相粒度：降低固定相粒度可提高柱效。l柱温：降低流动相的粘度可在一定程度上提高柱温：降低流动相的粘度可在一定程度上提高分别效果。分别效果。l改动洗脱液组成和极性是改善分别的最直接的改动洗脱液组成和极性是改善分别的最直接的要素。要素。l流速、洗脱方式。流速、洗脱方式。 流动相分类流动相分类l 按流动相组成分：单组分和多组分；l 按极性分：极性、弱极性、非极性；l 按运用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗；l 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、乙腈、水；l采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵敏调理流动相的极性或添加选择性

31、，以改良分别或调整出峰时间。 流动相的选择流动相的选择在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要根据。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要根据。采用正相液采用正相液- -液分配分别时：首先选择中等极性溶剂，假设组液分配分别时：首先选择中等极性溶剂，假设组分的保管时间太短，降低溶剂极性，反之添加。分的保管时间太短，降低溶剂极性，反之添加。也可在低极性溶剂中，逐渐添加其中的极性溶剂，使保管时也可在低极性溶剂中，逐渐添加其中的极性溶剂，使保管时间缩短。间缩短。常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序： 水水( (最大最大) ) 甲酰胺甲酰胺 甲醇甲醇 乙腈乙腈 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环

32、 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷 氯仿氯仿 溴乙烷溴乙烷 苯苯 四氯化碳四氯化碳 二硫化二硫化碳碳 环己烷环己烷 己烷己烷 煤油煤油( (最小最小) )流动相选择的留意根本要求流动相选择的留意根本要求l尽量运用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声添加。l防止流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失、酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。l试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中堆积。l流动一样时还应满足检测器的要求。当运用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。四、实验前

33、预备任务四、实验前预备任务l水水l有机溶剂有机溶剂l样品预处置样品预处置l1 1 水水l理想的理想的HPLCHPLC用水应为用水应为18.2M18.2M的的超纯水，并经过超纯水，并经过0.22um0.22um的滤膜，的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及除去热源、有机物、无机离子及空气等。水质越高放置时间越短空气等。水质越高放置时间越短越好。越好。l重蒸馏水也可。重蒸馏水也可。2 2 有机溶剂的提纯有机溶剂的提纯l用蒸馏法可除掉大部分有紫外吸收的杂质。用蒸馏法可除掉大部分有紫外吸收的杂质。l氧化铝或硅胶柱可除去溶剂中的极性化合物。氧化铝或硅胶柱可除去溶剂中的极性化合物。l氯仿中少量甲醇先水洗，再

34、蒸馏。氯仿中少量甲醇先水洗，再蒸馏。l四氢呋喃抗氧剂丁基甲苯酚剧烈吸收紫四氢呋喃抗氧剂丁基甲苯酚剧烈吸收紫 外线，可蒸馏。外线，可蒸馏。l 为了防止爆炸，蒸馏终止时蒸馏瓶中剩余为了防止爆炸，蒸馏终止时蒸馏瓶中剩余一定量的液体。一定量的液体。溶剂的过滤和脱气溶剂的过滤和脱气 流动相溶剂在运用前必需先用流动相溶剂在运用前必需先用0.45m0.45m孔径的滤膜过滤，孔径的滤膜过滤，以除去微小颗粒，防止色谱柱堵塞；以除去微小颗粒，防止色谱柱堵塞； 同时要进展脱气处置，由于溶解在溶剂中的气领会同时要进展脱气处置，由于溶解在溶剂中的气领会 在管道、输液泵或检测池中以气泡方式逸出，影响在管道、输液泵或检测池

35、中以气泡方式逸出，影响 正常操作的进展。正常操作的进展。3 3 样品处置技术样品处置技术l在某些试样中，常含有多量的蛋白质、脂肪及在某些试样中，常含有多量的蛋白质、脂肪及糖类等物质。它们的存在，将影响组分的分别糖类等物质。它们的存在，将影响组分的分别测定，同时容易堵塞和污染色谱柱，使柱效降测定，同时容易堵塞和污染色谱柱，使柱效降低，所以常需对试样预处置。低，所以常需对试样预处置。l样品的预处置方法：溶剂萃取、吸附、超速离样品的预处置方法：溶剂萃取、吸附、超速离心及超越滤等。心及超越滤等。 3 3 样品处置技术样品处置技术l溶剂萃取溶剂萃取 l 溶剂萃取适用于待测组分为非极性物质。在试样中参与缓

36、冲溶溶剂萃取适用于待测组分为非极性物质。在试样中参与缓冲溶液调理液调理pHpH，然后用乙醚或氯仿萃取待测组分。但假设待测组分和，然后用乙醚或氯仿萃取待测组分。但假设待测组分和蛋白质结合，大多数情况下难以用萃取操作来进展分别。蛋白质结合，大多数情况下难以用萃取操作来进展分别。l吸附吸附 l 将吸附剂直接加到试样中，或将吸附剂填充于柱内进展吸附。将吸附剂直接加到试样中，或将吸附剂填充于柱内进展吸附。亲水性物质用硅胶吸附，而疏水性物质可用聚苯乙烯亲水性物质用硅胶吸附，而疏水性物质可用聚苯乙烯二乙烯基二乙烯基苯等树脂吸附。苯等树脂吸附。 3 3 样品处置技术样品处置技术l除蛋白质除蛋白质 l 向试样中

37、参与三氯醋酸或丙酮、乙腈、甲醇，蛋白向试样中参与三氯醋酸或丙酮、乙腈、甲醇，蛋白质被沉淀下来，然后经超速离心，汲取上层清液供分质被沉淀下来，然后经超速离心，汲取上层清液供分别测定用。别测定用。l超越滤超越滤 l 用孔径为用孔径为l0l010-10-50010-10-500l0-10ml0-10m的多孔膜过滤，可的多孔膜过滤，可除去蛋白质等高分子物质。除去蛋白质等高分子物质。五、主要分析步骤五、主要分析步骤l 检测条件确实定检测条件确实定 Investigation of measuring conditionsInvestigation of measuring conditionsl 系统顺

38、应性检验系统顺应性检验 Investigation of AdaptabilityInvestigation of Adaptabilityl 方方 法法 学学 考考 察察 Methodological detectionMethodological detectionl 规范曲线的绘制规范曲线的绘制 Calculation curveCalculation curvel 方方 法法 的的 应应 用用 ApplicationApplicationl1.1 1.1 最正确波长确实定最正确波长确实定 利用紫外全波利用紫外全波长扫描仪扫描规范品溶液，确定最正确吸收长扫描仪扫描规范品溶液，确定最正确吸

39、收波长。假设为混合样品，那么兼顾每个样品波长。假设为混合样品，那么兼顾每个样品的吸收波长。的吸收波长。0.000.050.100.150.200.250.300.350.40230280330380430480530580630680730780吸收波长 Absorption wavelength/nm吸光度 Absorbance.靛蓝 Indigo.靛玉红 Indirubin1 检测条件确实定Investigation of measuring conditionsl1.2 1.2 流动相确实定流动相确实定l流动相是分别成败的关键要素。流动相是分别成败的关键要素。l流动相普通由甲醇流动相普通

40、由甲醇- -水、甲醇水、甲醇- -水水- -酸、乙酸、乙睛睛- -水等组成，根据化合物的性质和色谱水等组成，根据化合物的性质和色谱柱的资料而定。柱的资料而定。Investigation of measuring conditions 1.3 1.3 流速确实定流速确实定 流速对于分别效果非常重要。流速对于分别效果非常重要。 流速范围：流速范围：0.5-1.2 ml/min0.5-1.2 ml/min 常用范围：常用范围：0.7-1.0 ml/min0.7-1.0 ml/minInvestigation of measuring conditions1.4 1.4 色谱图检验色谱图检验规范品的色

41、谱图：规范品的色谱图： 样品的色谱图：样品的色谱图：2 系统顺应性检验2.1 2.1 实际塔板数实际塔板数用于定量表示色谱柱的分别效率柱效，用用于定量表示色谱柱的分别效率柱效，用 N N 表示表示取决于色谱柱固定相的种类、性质粒度、粒径取决于色谱柱固定相的种类、性质粒度、粒径分布等、填充情况、柱长、流动相的种类和分布等、填充情况、柱长、流动相的种类和流速等。流速等。N = 5.54N = 5.54tR / Wh/2tR / Wh/22 2M in u te s024681 01 21 41 61 82 0Volts- 0 .0 2 50 .0 0 00 .0 2 50 .0 5 0Volts-

42、 0 .0 2 50 .0 0 00 .0 2 50 .0 5 0 C h a n n e l A2 0 0 6 0 4 2 3混 合 标 样 0 0 4R e te n tio n T im eh/2保管时间保管时间 tR半峰宽半峰宽Wh/2峰高峰高hInvestigation of Adaptability2.2 2.2 分别度分别度相邻两峰的保管时间之差与平均峰宽的比相邻两峰的保管时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰分别的值。也叫分辨率，表示相邻两峰分别的程度。程度。R1.5R1.5称为完全分别。称为完全分别。 规定规定R R应大于应大于1.51.5。21)( 212WWt

43、tRRRM in u te s024681 01 21 41 61 82 0Volts- 0 .0 2 50 .0 0 00 .0 2 50 .0 5 0Volts- 0 .0 2 50 .0 0 00 .0 2 50 .0 5 0 C h a n n e l A2 0 0 6 0 4 2 3混 合 标 样 0 0 4R e te n tio n T im eM in u te s024681 01 21 41 61 82 0Volts-0 .0 2 50 .0 0 00 .0 2 50 .0 5 0Volts-0 .0 2 50 .0 0 00 .0 2 50 .0 5 0 C h a n n e l A2 0 0 6 0 4 2 3混 合 标 样 0 0 4R e te n tio n T im eW1W2tR1tR2Investigation of Adaptability2.3 2.3 拖尾因子拖尾因子T T 为保证分别效果和丈量精度，应检查色谱为保证分别效果和丈量精度，应检查色谱峰的拖尾因子能否符合规定。规范值：峰的拖尾因子能否符合规定。规范值：0.95-1.050.95-1.05。 W0.05h 5%W0.05h 5%峰高处的峰宽峰高处的峰宽 2d1 2d1 峰顶点到峰前沿的间隔峰顶点到峰前沿的间隔 105