生物工程下游技术实验讲义

1、生物工程下游技术实验讲义目 录实验一 层析柱装填及柱效测定实验二 溶菌酶粗提取实验三 溶菌酶分离纯化实验四 酶活力及蛋白质浓度的测定实验五 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定17 实验一 层析柱装填及柱效测定一、 实验目的1. 掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定方法； 2. 熟悉凝胶层析的一般过程；二、实验原理凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。相对分子质量大的生物分子由于不能进入或不能完全进入凝胶内部的网孔，沿着凝胶颗粒间的空隙或大的网状孔通过，大分子相对于小分子迁移的路径短，保留值小，所以在层析过程中迁移速度最

2、快，先从柱中流出；反之，分子量小的生物分子保留值大，后从柱中流出。 凝胶层析常用于分离纯化蛋白质（包括酶类）、核酸、多糖、激素、病毒、氨基酸和抗生素等生物大分子, 也可用于样品的浓缩和脱盐及测定生物大分子的分子质量等方面。三、实验试剂与器材 层析柱（ 1.6×30 cm ），砝码天平，玻璃棒，烧杯，刻度试管及试管架，滴头吸管，Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0的PBS缓冲液，5丙酮（PBS缓冲液作为溶剂），水浴锅，蓝色葡聚糖四、实验内容与步骤 （一）测量层析柱的内径、高度，计算所需凝胶量 干胶用量（g）=柱床体积（ml）

3、/凝胶的溶胀体积(ml/g)由上式计算出的干胶用量再增加10%-20%（二） Sephadex G-50凝胶预处理称取相应质量的干凝胶，加入适量的0.02 mol/L PBS 在100水浴中加热溶胀1小时以上，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。 （3） 层析柱的装填 1 清洗：每组取一支层析柱，用清水冲洗干净。2 安装与检查：检查柱下部烧结滤板是否完好干净。安装层析柱，让其垂直固定于滴定台架上。对准出口处，放一只250mL烧杯。3. 关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/4柱容积的缓冲液4、边搅拌，边将

4、薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉降，并不断加入凝胶液，最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有2-3cm高的缓冲液，关闭出水口。5、柱子装好后，用缓冲液平衡柱子。用15ml洗脱剂走柱子使柱床稳定(流速0.51 mL/min) 始终保护凝胶上端有一段液体 。（注意不能干柱、分层、否则需重新装柱）（四） 凝胶柱柱效测定1 肉眼观察，柱子填装是否均匀，无纹路，无气泡2 用0.5ml 2mg/mL的蓝色葡聚糖-2000上柱，如果色带狭窄、平整、均匀下降，表明柱中的凝胶填装情况较好，可以用来进行样品分

5、离。如果色带分散，歪曲，则需重新装柱。（五）凝胶再生 鉴定完毕，打开出水口，继续用倍床体积洗脱剂洗脱，洗脱后关闭出口，以备下次使用。五、注意事项 1. 装柱要均匀，既不过松，也不过紧，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。 2. 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。 3. 所用凝胶比较昂贵，需小心操作，实验后回收，尽量避免浪费和损失六、背景资料 凝胶层析的使用（一） 层析柱 层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管,柱的

6、直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用 20-30cm 长的层析柱，分级分离时，一般需要 100cm 左右长的层析柱，其直径在 1-5cm 范围内，小于 1cm 产生管壁效应，大于 5cm 则稀释现象严重。由于层析柱的直径大小不影响分离度，所以样品量大时可用大直径的层析柱 (一般制备用凝胶柱，直径大于 2cm , 但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上 ) 。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的

7、平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过 1m。  分组分离时用短柱，一般凝胶柱长 2030cm ，柱高与直径的比较 5:110:1 ，样品溶液体积应小于 凝胶床体积为的 20% 。  分级分离时柱高与直径之线为 20:1100:1 （层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支撑滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的 1/1000&#

8、160;），样品溶液体积 应小于 凝胶床体积为的 5 % 。 脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。适用的凝胶为 SephadexG-10、15、25 或 Bio-Gel-p-2、4、6 。柱长与直径之比为 5-15 ，样品体积可达柱床体积的 20-25% ，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗

9、脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。（二）凝胶的类型  常用凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。具体的种类型号及性能列表如下： 种类及主要用途 化学组成  部分型号  颗粒大小（/目数） 分离性能（Da） 溶胀时间/h 20-25 90-100 葡聚糖凝胶（Sephadex G-） 由葡聚糖和甘油基通过醚桥交联而成 G-10 100-200 700 3 1 G-15 120-200 

10、;1500 3 1G-25 50-400 100-5,000 3 1G-50 50-400 500-30,000 3 1 G-75 120-400 1,000-8,000 24 3 G-100 120-400 1,000-15,000 72 3 G-150 120-400 1,000-30000 72 5 G-200 120-4

11、00 1,000-60,000 72 5 聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel p-） 由丙烯酰胺和双丙烯酰胺共聚而成 P-2 50-400 200-1,800 4 2 P-4 50-400 800-4,000 4 2 P-6 50-400 1,000-6,000 4 2 P-10 50-400 1,500-20,000 4 2 P-

12、30 50-200 2,500-40,000 12 3 P-60 50-200 3,000-60,000 12 3 P-100 50-200 5,000-100,000 24 5P-150 50-200 15,000-150,000 24 5 P-200 50-200 50,000-20,000 48 5 P-300 50-200 60,

13、000-400,000 48 5 琼脂糖凝胶（Sepharose gio-gel ） 由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接而成，为中性琼脂糖 A 0.5m 50-400 10,000-500,000    A 1.5m 50-400 10,000-1,500,000     A 5m 50-400 10,000-5,000,000 A

14、 15m 50-400 10,000-15,000,000     A 50m 50-400 100,000-50,000,000     A 150m 50-200 1,000,000-150,000,000（三）凝胶的选择 根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。 一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如 Sephadex G-200 的吸水量

15、为20，1克Sephadex G200 吸水后形成的凝胶体积约 40mL 。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用 100-200 号筛目的的 Sephadex G-200 效果好； 脱盐用 Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。  （四）凝胶的制备 商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样

16、可大大加速膨胀，通常1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时，自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。  （五）样品溶液的处理 样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过 Sephadex G-15短柱除去。样品的粘度不能太大，否则影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。 （六）防止微生物的污染 交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有： （1

17、）叠氨钠（NaN3） 在凝胶层析中只要用 0.02叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶于水，在20时约为40%。它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析特性，但可干扰荧光标记蛋白质。 （2）可乐酮 Cl 3C-C(OH)(CH3)2  在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02% 。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60 时易引起分解而失效。 （3）乙基汞代巯基水杨酸钠 在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为

18、0;0.05-0.01 %。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。 （4）苯基汞代盐 在凝胶层析中使用浓度为 0.001%-0.01 %。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。 （六）凝胶回收 如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用 70、90、95乙醇脱水平衡至乙醇浓度达 90以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇

19、、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。实验二 溶菌酶的粗提取一、实验目的1.掌握等电点沉淀法进行初级分离的操作方法和注意事项；2.能针对不同的目标产物选择恰当的初级分离方法，锻炼应用生物分离技术知识分析、解决实际问题的能力。二、实验原理 溶菌酶是一种有效的抗菌剂，全称为1,4-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖与N-乙酰胞壁酸间的-1，4糖苷键，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50，最适PH为67左右。溶菌酶

20、广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为2%4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质，鸡蛋的蛋清中含有丰富的上述物质，本实验以鸡蛋蛋清为原料，对溶菌酶进行提取。溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性 ，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因此在分离制备时，先采用等电点法粗分离。三、实验试剂与器材 721型分光光度计、摇床、高速离心机，200mL烧杯、玻璃棒、漏斗、定性快速滤纸、200mL量筒、50mL离心管，鸡蛋一个、0.02 mol/L PBS( pH8.0),40%甘油四、实验步骤溶菌酶的粗提取（约两个半小时）1. 拿1个鸡蛋破壳取蛋清置于250mL烧杯中

21、，轻轻搅拌5分钟，使其的稠度均匀，去除脐带和蛋壳。记录其体积V12. 加入1.5倍体积的pH8.0 PBS缓冲液，搅拌均匀3. 用冰醋酸调pH4.7左右，充分搅拌4. 3500rpm，离心20min,弃沉淀，转移上清至烧杯中5. 加入1倍体积的pH8.0 PBS缓冲液，搅拌均匀，并用5mol/L NaOH调pH8.06. 滤纸过滤，取清液，测量并记录体积V27. 取0.5ml蛋清于EP管中，装两管，-20冻存备用（样品S1）8. 剩余清液装在烧杯中-20冻存备用。注：保存样品需明确标记名称、班级、组号、日期。五、实验注意事项1. 等电点沉淀后利用离心的办法，要尽量除去沉淀；2. 调节pH时要避

22、免局部过酸；3. 提取过程中尽量避免泡沫的产生。实验三 溶菌酶分离纯化一、实验目的1. 掌握离子层析的原理以及离子交换层析的操作方法2. 掌握离子交换树脂的再生和保存二、实验原理离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法。蛋白质的带电性是由蛋白质多肽中带电氨基酸决定的。由于蛋白质中氨基酸的电性又取决于介质中的pH，所以蛋白质的带电性也就依赖于介质的pH。当pH较低时，负电基团被中和，而正电基团就很多; 在pH较高时，蛋白质的电性与低pH时相反。当蛋白质所处的pH，使蛋白质的正负电荷相等，此时的pH称为等电点。离子交换层析所用的交换剂是经酯化、氧化等化学反应引入阳性或阴性离子基

23、团制成的，可与带相反电荷的蛋白质进行交换吸附。带有阳离子基团的交换剂可置换吸附带负电荷的物质，称为阴离子交换剂，如DEAE-纤维素树脂;反之称为阳离子交换剂，如CM-纤维素树脂。不同的蛋白质有不同的等电点，在一定的条件下解离后所带的电荷种类和电荷量都不同，因而可与不同的离子交换剂以不同的亲和力相互交换吸附。当缓冲液中的离子基团与结合在离子交换剂上的蛋白质相竞争时，亲和力小的蛋白质分子首先被解吸附而洗脱，而亲和力大的蛋白质则后被解吸附和洗脱。因此，可通过增加缓冲液的离子强度和/或改变酸碱度，便可改变蛋白质的吸附状况，使不同亲和力的蛋白质得以分离。三、实验器材D152大孔弱酸性阳离子交换树脂，层析

24、柱，试管及试管架，高速离心机（可用50mL离心管），冰箱，可见光分光光度计、摇床、烧杯、玻璃棒、漏斗、滤纸；样品S1，0.5mol/L NaCl, 0.02mol/L pH8.0的PBS(离子交换洗脱溶液，含0.5mol/L NaCl)，0.02mol/L的磷酸盐缓冲剂（pH6.5），硫酸铵，NaOH，HCl,无水乙醇，聚乙二醇四、实验内容与步骤采用离子交换层析对实验二获得的初提液，进行进一步的分离纯化以得到较高纯度的溶菌酶。具体来说包括：1、D152树脂的处理：将D152树脂先将蒸馏水洗去杂物，滤除，用1mol/L NaOH搅拌浸泡并搅拌4-8h，抽滤干NaOH,用蒸馏水洗近pH7.5左右，

25、抽滤干，再用1mol/L HCl按上述方法处理树脂，知道全部转变为氢型，抽滤干HCl，用2mol/L NaOH处理树脂，是指转变为钠型，pH值不低于6.5。吸干溶液，加0.02mol/L的磷酸盐缓冲剂（pH6.5）平衡树脂。2. 装柱装柱方式与第一次课大家装填分子筛层析柱的方法一样。注意不能使树脂露出水面，因为树脂露于空气中，当加入溶液时，树脂间隙中会产生气抱，而使交换不完全。对于重复使用的填料，需要先冲3倍柱床体积蒸馏水，将保存用的乙醇洗脱出来。取层析柱，自顶部注入经处理过的上述树脂悬浮液，关闭层析柱出口，带树脂沉降后，放过量的溶液，再加上一些树脂，至树脂沉积至1520cm高度即可。与柱子顶

26、部继续加入0.02mol/L的磷酸盐缓冲剂（pH6.5）平衡树脂。最终是流出液pH为6.5为止，关闭柱子出口，保持页面高出树脂表面1cm。2. 平衡用3倍柱床体积的0.02M PBS pH8.0过柱。这一步的作用是使得柱床体系的内外达到平衡与均一，以利后续目的蛋白的结合。3. 上样用吸管将0.5ml S1样品加入层析柱，经过一段时间之后，蛋白将通过离子交换的方式，与介质相互作用而挂柱。注意观察并记录280nm下吸收值的变化。4. 洗脱用50mL含0.5mol/L NaCl的0.02mol/L pH8.0的PBS和50mL 0.02mol/L pH8.0的PBS进行梯度洗脱。收集洗脱峰，记录洗脱

27、时间和洗脱峰体积V4。取0.5mL清液于Ep管中，制备2管，-20备用（留样S4）5. 再生用2倍柱体积的2mol/L NaCl过柱，然后水洗4倍柱体积。洗脱完成后，需要进行离子交换填料的再生处理。离子交换基团为一些盐所覆盖，影响下次的重复使用。因此，先用高浓度的盐将与介质结合紧密的杂质洗脱下来，然后再恢复其离子交换功能。对于CM-sepharose 而言，只需要用水过柱即可以使其离子交换功能得到恢复。6. 保存用2倍柱体积的20%乙醇过柱。介质回收，用于蛋白质分离纯化的介质多保存于液体中。保存时需加入一些抑菌剂，如叠氮化钠等。对于本介质，只需采用20%乙醇保存即可。四、注意事项1离子交换树脂

28、再使用前需要再生，阴离子交换树脂以“碱酸碱”的顺序进行处理，阳离子交换树脂以“酸碱酸”的顺序进行处理和再生。装柱时要求粒度均匀，比较致密，柱床表面平整，柱中无裂缝，气泡和沟流的现象。2加样蛋白浓度低于20 mg/mL，上样体积小于柱体积的1/3。3. 在整个实验过程中，流速必须得到一定的控制。过大，会使填料压缩紧密，导致流速过低，层析柱有可能堵塞而实验失败，流速过小，实验时间过长，引起酶的活性变化。在我们的实验中，控制流速为2mL/min。八、背景资料（一）离子交换树脂离子交换树脂是具有网状结构的复杂的有机高分子聚合物。网状结构的骨架部分一段很稳定，不溶于酸、碱和一般溶剂。在网状结构的骨架上有

29、许多可被交换的活性基团。根据活性基团的不同、离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两大类。由于本实验采用的是阳离子交换树脂，所以将其做重点介绍。阳离子交换树脂具有酸性基团，如葡聚糖凝胶型、琼脂糖凝胶型以及强酸性磺酸型聚苯乙烯树脂等等。这种树脂的化学性质很稳定，具有耐强酸、强碱、氧化剂和还原剂的性质，因此应用非常广泛。各种阳离子交换树脂含有不同的活性基因、常见的有磺酸基(-SO3H)、羧基(-COOH)和酚基(-OH)等。根据活性基团离解出H+能力的大小不同，阳离子交换树脂分为强酸性和弱酸性两种。例如含-SO3的为强酸性阳离子交换树脂，常用R-SO3H表示(R表示树脂的骨架)，含-CO

30、OH和-OH的弱酸性阳离子交换树脂，分别用R-COOH和R-OH表示。强酸性阳离子交换树脂应用较广泛，弱酸性阳离子交换树脂的H+不易电离，所以在酸性溶液中不能应用，但它的选择性较高而且易于洗脱。本次实验采用的离子交换树脂为CM-Sepharose F.F，其中Sepharose是指琼脂糖凝胶，CM是是弱酸性活性基团羧甲基（-CH3COOH）。离子交换反应和其他化学反应一样，完全服从质量作用定律。树脂对离子亲合力的大小，与离子的水合离子半径大小和带电荷的多少有关。经实验证明，在低浓度、常温下，离子交换树脂对不同离子的亲合力顺序有下列规律。对于在弱酸性阳离子交换树脂中具有相同价态离子的亲合力顺序为

31、：Ag+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+>Li+根据这些原理我们利用在此条件下溶菌酶的亲和力大于H+，所以弱酸性阳离子交换树脂的活性基团在离子交换过程中可吸附溶菌酶，再采用亲和力更大的Na+进行洗脱就可得到相对纯化的溶菌酶。同时，为了监测分离纯化的效果，我们必须对相应的结果进行检测。对于酶而言，主要通过其催化特异的反应进行监测。溶菌酶对革兰氏阳性菌的细胞壁有明显的破坏作用，可利用这一特性进行溶菌酶活性的监测，以便我们区分在纯化过程中，含有溶菌酶的组分。类似的采用 DEAE- 纤维素对抗体进行精制，特别是经过初步纯化后的 Ig 的纯化，效果尤为显著。 IgG 的等电点为 pI 8.0 ，

32、 IgM ， IgA 的等电点为 pI 7.0 ， 7.4 ，在 pH 8.0 时 IgG 带正电荷，不能被 DEAE-纤维素吸附而被洗脱下来，被 DEAE- 纤维素吸附的其它球蛋白，可用逐渐增加洗脱液中 PO4 3-浓度的方法将其逐一洗脱，或降低 pH 使之洗脱出来。目前常用的离子交换纤维素列于下表：DEAE 纤维素形状长度 （微米）交换当量 （mg当量/g）蛋白吸附容量 （毫克/克）床体积（毫升/克）胰岛素（pH8.5）牛血清清蛋白（pH8.5）pH6.0pH7.5DE-22DE-23DE-32DE-52CM纤维素CM-22CM-23CM-32CM-52改良纤维性 *同上（除细粒

33、）微粒性（干粉）同上（溶胀）改良纤维性改良纤维性（除细粒）微粒性（干粉）微粒性（溶胀）1240018400246324631240018400246324631.0±0.11.0±0.11.0±0.11.0±0.10.6±0.060.6±0.061.0±0.11.0±0.1750750850850溶菌酶(pH5.0)6006001,2601,2604504506606607S球蛋白（pH5.0）1501504004007.78.36.06.0pH5.07.79.16.86.87.79.16.36.3pH7.57.7

34、9.16.76.（二）离子交换层析蛋白质进入离子交换柱后，与离子交换树脂无亲和力的蛋白质被洗脱下来。余下的蛋白质均结合在树脂上，利用其蛋白质表面电荷性质的不同，与树脂的亲和力也各不相同，利用不同强度的离子溶液，将其分别洗脱下来达到分离、纯化蛋白质的目的。以下对操作过程的要点进行说明。1. 离子交换剂预处理和装柱对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带 H + 或 OH - 的交换剂型。阴离子交换剂常用 “碱 -酸-碱” 处理，使最终转为-OH -型或盐型交换剂；对于阳离子交换

35、剂则用 “酸- 碱-酸” 处理，使最终转为-H -型交换剂。洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的 pH 和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。2. 加样与洗脱加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的 pH 和离子强度，所选定的 pH 值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达到满意的分离效果，上样量要

36、适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的 15%。加样蛋白浓度低于20 mg/mL，上样体积小于柱体积的1/3 。洗脱：已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的 pH 或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变 pH 与离子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变 pH 或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同 pH 与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱 pH 与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。最好的洗脱方法是连续梯度洗脱：两个容器放于同一水平上，第一个容

37、器盛有一定 pH 的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同 pH 的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。第一容器中某一时间的盐浓度可用下式进行计算： C C2（C2C1）（1V）A2/A1 式中 A 1、A 2分别代表两容器的截面积： C1、C2分别表示容器中溶液的浓度； V 为流出体积对总体积之比。当 A 1 A 2 时为线性梯度，当A 1A 2时为凹形梯度， A1A2&

38、#160;时为凸形梯度。 进行离子交换层析的最佳洗脱 溶液 pH 值一般与预分离蛋白质的等电点相差一个单位。这使蛋白质的净电荷量能保证将其结合在离子交换树脂上，又不需在洗脱时采用高强度的离子浓度或 pH 值相差悬殊的苛刻的洗脱条件。洗脱时应满足以下要求： 洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不致太拥挤。 梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。 梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。 流速： 1 mL/cm 2 · min ，过快会吸附不完全，

39、分离不清，洗脱峰平坦。3. 洗脱馏份的分析按一定体积（ 5-10 mL/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。4. 离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生。如离子交换纤维素可用 2 mol/L NaCl 淋洗柱，若有强吸附物则可用 0.1 mol/L NaOH 洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为： 0.5 mol/L NaOH- 水 - 乙醇 - 水 -20 % NaOH-水。保存离子交换剂时要加防腐剂。对阴离子交换剂宜用 0.002

40、 % 氯已定（洗必泰），阳离子交换剂可用乙基硫柳汞（ 0.005）。有些产品建议用 0.02叠氮钠。离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。实验四 酶活力及蛋白质浓度的测定一 、实验目的1.学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法2掌握比色法测定溶菌酶的酶活 二、实验原理  考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓 度的快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝G250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质

41、通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beers law）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1

42、10µg蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。 此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。三、实验试剂与器材考马

43、斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G250，4.7%(W/V)乙醇。 标准蛋白质溶液：结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液。未知蛋白质溶液，试管及试管架， 移液管，UV2000型分光光度计。四、实验操作方法(一) 标准法制定标准曲线（1）取14支试管，分两组按下表a平行操作。分别加入样品、水和试剂，即用1.0 mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加

44、入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 ml，然后用无离子水补充到0.1 ml。最后各试管中分别加入5.0 ml考马斯亮兰G-250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。（2） 加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595。(3) 绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。(0.5 mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50) 表a试管编号01234561m

45、g/ml标准蛋白溶液/ml00.010.020.040.060.080.10.15mol/L NaCl/ml0.10.090.080.060.040.020.00考马斯亮蓝试剂/ml5ml摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色每管中蛋白质含量（mg） A595nm(二) 微量法制定标准曲线取12支试管，分两组按下表b平行操作。绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。表b试管编号0123451mg/ml标准蛋白溶液/ml00.010.020.030.040.050.15mol/L NaCl/ml0.10.090.080.070.060.05

46、考马斯亮蓝试剂/ml5ml摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595nm(三) 未知样品蛋白质浓度测定测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/ml）。（4） 溶菌酶的活性测定（1） 酶液配制：准确秤取溶菌酶5mg,用0.1mol/L,pH6.2 磷酸缓冲液配成1mg/ml的酶液，再将酶液稀释成50g/ml。（2） 底物配制：取干菌粉5mg加入上述缓冲液少许，在研钵中研磨2Min,倾出，稀释到15-25ml。（3） 活力测定：先将酶和底物分别放入2

47、5水浴中预热10min，吸取底物悬浮液4ml放入比色杯中，在450nm出测吸光度，然后吸取酶液0.2ml，测定30s和5min30s的吸光度。以平均每分钟光密度下降0.001作为一个活力单位（由于溶菌酶对小球菌细胞壁的降解做用导致光密度的降低）。计算方法如下：酶活性 （U）=（ODt0-ODt1）*1000*A,其中ODt0为30s时的光密度，ODt1为5Min30s时的光密度;A为酶的稀释倍数，酶活性为每毫克冻干溶菌酶所具有的活性单位。注意事项 （1） 如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的520min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。（2） 测定中，蛋白染料复合物会有

48、少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。实验五 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定一、实验目的1. 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）测定蛋白质纯度与分子量的原理2. 掌握SDSPAGE垂直板电泳分离蛋白质技术3. 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子质量及染色鉴定二、实验原理 PAGE电泳是根据蛋白质分子（或其它生物大分子）所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率而分离成若干条区带。然而有时两个分子量不同的蛋白质，由于其分子大小的差异、被它们所带电荷的差别补偿而以相同的速度向阳极移动，因而不能达到分离的目的。SDS-PAGE就是设

49、法将电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度。SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合蛋白质疏水部分，形成SDS-蛋白质复合物。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4g SDS/1g蛋白质。由于SDS带有负电荷，使各种SDS-蛋白质复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质分子原有的电荷差别。这样的SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量有关。当蛋白质的分子量间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程： 1g

50、Mr =KbmR 式中：Mr为蛋白质的分子量；K为常数；b为斜率；mR为相对迁移率。在条件一定时，b和K均为常数。若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。三、实验试剂与器材垂直板型电泳槽，直流稳压电源，电炉，脱色摇床， 50或100l微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽，烧杯，吸量管，常头滴管等蛋清（S1）、粗分离样品（S2）、离子交换层析中穿透峰下降段样品（S3）、离子交换层析洗脱峰样品（S4），橡胶手套；2×上样缓冲液、10%SDS、30%丙烯酰胺贮存液、分离胶缓冲液（1

51、.5 mol/L pH8.8 Tris-HCl 缓冲液）、浓缩胶缓冲液（0.5 mol/L pH6.8 Tris-HCl 缓冲液）、10%过硫酸铵(AP)、TEMED、pH8.3 Tris-Gly电泳缓冲液、1%琼脂糖溶液、染色液、脱色液四、实验内容与步骤 （一）蛋白样品的处理 取200µL 上述备用蛋白样品于带塞的小离心管中，加入200µL 的2×上样缓冲液，混匀，轻轻盖上盖子，封口膜封紧瓶口以免加热时迸出，在100沸水浴中加热35min，取出后10000r/min 离心10min，取上清待用。 （二）SDS-PADE实验步骤1电泳玻璃板洗净，并把玻璃板在灌胶支架上固定好。( 试样格（梳子）临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。) 2用电泳缓冲液配制1%的琼脂糖凝胶，煮沸溶解后冷却至55左右，加入制板槽槽内封板。（固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板.）3按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约5cm左右，之后加少许蒸馏水，静置30分钟。（凝胶配制过程要迅速,