大鼠肝细胞原代培养模型的研究

1、大鼠肝细胞原代培养模型的研究摘要摘要 目的目的: 为肝细胞功能及相关的研究提供一种客观的、简便的大鼠肝细胞原代培养模型, 并鉴定肝细胞的功能。方法方法: 在传统的两步灌流法的基础上代肝细胞的细胞周期和细胞凋亡情况。 结果结果: 分离得到的肝细胞成活率可达90% 以上, 纯度可达95%以上; 流式细胞术结果表明原代肝细胞大多处于G0、G1 期, 且基本无凋亡 。结论结论: 体外培养的肝细胞活力和纯度均较高, 体外培养后细胞功能正常, 是一种实用的体外研究肝细胞良好的细胞学模型。关键词关键词 ：大鼠; 肝细胞; 原代培养; 细胞模型; 中图分类号: R965. 1文献标识码: A文章编号: 100

2、9-2501( 2005) 07-0743-01 材料与方法材料与方法 1. 1 主要材料 SPF( special pathogen free) 级雄性Sprague-Dawley 大鼠, 体重150 200 g。1. 2 大鼠原代肝细胞培养和细胞纯度及活率鉴定 以0. 6% 戊巴比妥钠麻醉大鼠, 开腹, 分离肝门静脉, 经门静脉插管, 开放下腔静脉, 以流速5mlmin- 1灌流500 ml 37 的前灌流液( 142 mmolNaCl、6. 7mmol KCl、10 mmol HEPES、pH 7. 4) , 冲洗肝脏中的血液。将肝脏完整分离下来, 转入自制的循环灌流杯中, 以37 预热

3、的0. 1% IV 胶原酶循环灌流10 min, 流速4 ml#min- 1。当肝包膜下肝组织呈龟背状裂隙、胶原酶灌流液充满肝包膜下时停止。去除肝包膜, 分离肝细胞, 置于37 e度低速振荡10 min 过150 目筛, 以清洗液清洗细胞, 50 g 离心5 min 3 次获取肝细胞。细胞计数, 台盼蓝染色计数细胞活率。将细胞以105 个Pml 浓度接种于96孔板中, 37 、5 % CO2、100% 湿度条件下培养24 h,换液去掉未贴壁的细胞, 以后每24 h 换液1 次。取部分细胞离心收集, 20% 甲醛固定, 常规HE 染色后, 镜下计数每视野的肝细胞来计算细胞纯度。1. 3 流式细胞

4、术测定细胞周期 将分离下来的肝细胞以800 rmin离心5 min, 收集细胞, PBS 洗2次。冰浴下加入- 20 度预冷的70% 的乙醇( PBS 稀释) , 放置4 过夜。14 000 g , 短时离心, 弃上清, 去除乙醇, PBS 洗2 次。以500 Ll PBS 重悬细胞, 加RNase A 至终浓度为20 mgL, 于37 e孵育30 min。置于冰上, 加PI( Potassium iodide) 至终浓度为50 mgL,冰浴30 min, 流式细胞仪检测细胞荧光, CellQuest软件包分析数据, 计算原代大肝细胞细胞周期的比率。1. 4 流式细胞术测定细胞凋亡 根据Ann

5、exin VPPI双标试剂盒说明书操作, 将分离下来的肝细胞调整细胞浓度为 105 106 个Pml; 取1 ml 细胞液,4 度, 1 000 rmin 离心10 min, 弃上清; 加入1 ml 预冷的PBS, 轻轻震荡, 重悬细胞; 4 度 , 1 000 rmin离心10 min, 弃上清; 重复步骤离心2 次; 将细胞重悬于200 Binding Buffer 中; 加入10 Ll Annexin VFITC和5 Ll PI, 轻混匀, 避光室温反应15 min; 加入300 Ll Binding Buffer, 在1 h 内上机检测。1.5 统计学处理 实验数据以均数“加减 ”标准

6、差( x s ) 表示, 应用SPSS 11. 0软件分析, 各组之间显著性比较采用单因素方差分析( one-way ANOVA)。2 结果结果 2. 1 原代肝细胞培养存活率和纯度 所分离的肝细胞以台盼蓝拒染法检测细胞成活率平均达90%以上; 将肝细胞1 000 rmin离心沉淀, 20% 甲醛固定, 常规HE 染色观察。肝细胞纯度鉴定的结果显示, 本实验中分离的肝细胞纯度可达95% 以上, 细胞核蓝染, 细胞外形呈多角形, 胞体较大, 大部分是单核, 也有双核的细胞, 适合用于进一步的实验研究。( 图1) 图1 大鼠肝细胞( HE染色) 2. 2 原代肝细胞细胞周期和细胞凋亡 PI 染色,

7、 流式细胞术测定结果表明, 处于G0、G1 期的肝细胞占总细胞数的90. 62%, 说明原代肝细胞大部分处于非增殖状态; 采用Annexin V 和PI 双标记、流式细胞仪测定荧光强度的方法, 进一步确定原代肝细胞凋亡率。一般情况下, 凋亡细胞应出现在象限图的右上( UR) 和右下( LR) 象限, 呈高密度团块状, 如图可见原代肝细胞基本无凋亡( 图2) 。流式细胞术检测结果表明原代肝细胞的凋亡率为( 0. 120. 11)%,基本无细胞凋亡。参考文献 1 白文启. 大肠癌诊治进展中的哲学思考 J . 临床医药实践杂志, 2003; 12: 875- 7 2 Marc I, Brand, S

8、ergio C, David WD, Jeffrey W, Milsom, etal . Development of a reliable colorectal cancer liver metastasisModel J . J Surg Res, 1996; 63: 425- 32 3 Ann F, Chambers, Alan C, Groom. Dissemination and growth ofcancer cells in metastatic sites J . Nature Review Cancer,2002; 2: 563- 72 4 Helene L, Pierre B, Achilles A, Demetriou, Jacek R. Responseof cultured fetal and adult rat hepatocytes to gr