黄芪甲甙对衰老HELF细胞端粒酶活性及klotho表达的影响

1、黄芪甲甙对衰老HELF细胞端粒酶活性及klotho表达的影响 作者：郭蕾 魏晓东 欧芹 王昭 朱贵明【摘要】 目的 探讨黄芪甲甙对衰老人胚肺成纤维细胞(HELF)端粒酶活性及抗衰老基因klotho mRNA表达的影响。方法 体外培养 HELF，实验组从50代开始加入黄芪甲甙，倒置显微镜观察细胞形态，MTT方法检查细胞活力，Dimiri氏法检测半乳糖苷酶活性，TRAPPCR银染法检测端粒酶活性，RTPCR法检测klotho mRNA表达。结果 与青年组比较：衰老组细胞活力和klotho mRNA表达均降低(P<0.01)、半乳糖苷酶活性升高(P<0.01)；与衰老组相

2、比：黄芪甲甙可降低半乳糖苷酶活性(P<0.01)、提高细胞活力、端粒酶活性和klotho mRNA表达(P<0.01)。结论 黄芪甲甙可以通过改变细胞端粒酶活性、klotho基因的表达而发挥其抗HELF细胞衰老的作用。 【关键词】 黄芪甲甙；端粒酶；klotho；衰老人胚肺成纤维细胞黄芪抗衰老作用的研究以体内实验1和血清药理学2方法为常见,本实验以复制性衰老人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblast，HELF)为研究对象，以黄芪的单体成分黄芪甲甙直接作用于衰老细胞，观察其对细胞衰老水平的影响及其作用机制，为黄芪甲甙抗衰老作用的确

3、定及其分子药理学研究提供可靠的理论和实验依据。2 / 151 材料与方法1.1 实验分组和处理HELF细胞从23代开始，按常规一分二传代培养，35代为青年细胞，50代为衰老细胞，分四组：青年组：(33±2)代为青年组；黄芪甲甙组：黄芪甲甙溶于二甲基亚砜(DMSO)，用含0.1%黄芪甲甙的DMSO处理HELF；对照组：培养液中加入同等剂量的DMSO作为对照，用含0.1%黄芪甲甙的DMSO处理HELF；衰老组：(52±3)代为衰老组。1.2 药物与试剂TRAPRCR银染试剂盒、HELF细胞株(南京凯基生物公司)，黄芪甲甙购自上海融禾医药科技发展有限公司(批号：090224)，D

4、MSO、焦碳酸二乙酯（DEPC）为Sigma公司产品， Trizol、RTPCR试剂盒购自大连宝生物有限公司，半乳糖苷酶染色试剂盒购自碧云天。20 mg黄芪甲甙溶于2 ml DMSO中，制成10 mg/ml的储存液，-20保存，用时含10%胎牛血清的DMEM培养液稀释1 000倍，使其终浓度为1 g/ml，(DMSO终浓度为0.1%)。1.3 指标测定倒置光学显微镜下观察细胞形态，噻唑蓝（MTT）法测细胞活力，酶联免疫仪 490 nm测得光吸收值。Dimiri氏方法3检测半乳糖苷酶活性，细胞核被蓝染定义为半乳糖苷酶阳性染色，计算阳性率。TRAPPCR银染法检测端粒酶活性4，提取细胞端粒酶，并在

5、94 5 min；94 30 s；50 30 s；72 90 s；3036个循环72 延伸10 min。 扩增；12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳， 17.5 v/cm预跑1 h，垂直电泳4050 min。银染，经Tanon2500R数码凝胶图像分析系统照相分析。RTPCR法检测klotho基因mRNA表达，RNA提取及逆转录： Trizol提取细胞总RNA，参照TaKaRa RNA LA PCRTM Kit(AMV)Ver提供的条件进行逆转录，引物序列：上游5TGGCACAGAGGTTACAGCATC3；下游3GACTAACCTATCTTGGACGGA5；扩增片段长度820 bp。选用actin

6、作内参，上游5CTACAATGAGCTGCGCGTGGC3；下游5CAGGTCCAGACGCAGGATGGC3，扩增片段长度273 bp，以klotho/actin进行半定量分析。 94 2 min，94 30 s，57 30 s，72 1.5 min，35个循环，最后72延伸10 min进行PCR，扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶行水平电泳，电泳条件：80 V， 30 min，溴化乙锭显色，用Tanon2500R凝胶成像分析系统摄像，并进行面积灰度扫描。1.4 统计学分析数据采用x±s表示，统计经SPSS16.0软件处理，采用方差分析的LSDt检验进行组间比较。2 结果2.1 黄芪甲甙

7、对衰老HELF细胞形态学改变的影响见图1。青年细胞生长良好，呈长梭形或不规则形，无角质形成，细胞混杂生长。衰老细胞排列不规则，体积较大，形态扁平，胞浆区域增大，细胞质/细胞核的比例增加，胞浆中可见较多颗粒或空泡，青年细胞偶见。黄芪甲甙组与同代正常衰老组细胞相比较，在形态上有明显差别，衰老表型不是十分明显。2.2 黄芪甲甙对衰老HELF细胞活力的影响多组间比较LSDt方差分析结果显示，53代、58代、63代结果F值分别为：1.252E3、1.102E3、1.721E3(E表示科学计数法)(P<0.01)；黄芪甲甙组、对照组和衰老组细胞活力比青年组(1.558±0.051)

8、显著降低(P<0.01)；但黄芪甲甙组细胞活力显著高于衰老组和对照组(P<0.01)；衰老组与对照组比较差别无统计学意义(P>0.05)。见表1。表1 黄芪甲甙对衰老HELF细胞活力的影响(略)2.3 黄芪甲甙对衰老HELF细胞半乳糖苷酶活性的影响青年组细胞没有被蓝染，不具有半乳糖苷酶活性；多组间比较LSDt方差分析结果显示，53代、58代、63代结果F值分别为：74.156、108.439、43.377，各组之间差异有统计学意义(P<0.01)；与青年组比较，衰老组细胞半乳糖苷活性显著升高(P0.01)；与衰老组比较，黄芪甲甙组半乳糖苷

9、酶活性显著降低(P0.01)；衰老组和对照组比较无统计学意义(P>0.05)。见表2。2.4 黄芪甲甙对HELF细胞端粒酶活性的影响青年组细胞端粒酶活性无表达；多组间比较LSDt方差分析结果显示，53代、58代、63代结果F值分别为：97.058、130.467、77.025(P<0.01)；与衰老组比较，黄芪甲甙组细胞端粒酶活性明显增强(P<0.01)；衰老组与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。见图2，表3。表2 黄芪甲甙对衰老HELF细胞半乳糖苷酶活性的影响，表3 黄芪甲甙对衰老HELF细胞端粒酶活性的影响(略)。2.5 黄芪甲

10、甙对衰老HELF细胞klotho mRNA表达的影响黄芪甲甙对衰老HELF细胞klotho mRNA表达的影响多组间比较LSDt方差分析结果显示，53代、58代、63代结果F值分别为：299.703、582.621、1.361E3(P<0.01)。与青年组(1.001±0.014)比较，衰老组、对照组和黄芪甲甙组klotho mRNA表达含量显著降低，53代、58代、63代组间比较有显著差异(P<0.01)；与衰老组比较，黄芪甲甙组klotho m RNA表达含量显著升高，衰老组与对照组比较差别无统计学意义。见图3，表4。表4 黄芪甲甙对衰老HELF细胞k

11、lotho mRNA表达的影响(klotho/actin)(略)3 讨论 有关衰老研究证明，体外细胞的衰老与体内组织的衰老有直接相关性5。本实验结果显示，黄芪甲甙组细胞衰老形态不明显，细胞活力增强，半乳糖苷酶活性明显下降，提示黄芪甲甙在体外有很好的抗衰老作用；黄芪甲甙组细胞活力相对青年组下降，而半乳糖苷酶活性相对升高，提示已经在向衰老方向发展的细胞不可能完全恢复到青年水平，药物干预只能起到延缓衰老的作用。而与衰老组相比，对照组细胞的形态、细胞活力、半乳糖苷酶活性变化均不明显，说明DMSO无抗衰老的效果，发挥作用的是黄芪甲甙。 染色体末端由DNA与调节蛋白组成的端粒(telomere)有防止染色

12、体末端降解、融合而起到保护染色体完整性、维持细胞稳定性的作用。端粒酶(telomerase)是一种能利用自身RNA为模板合成端粒DNA的核酸蛋白酶，能弥补随着细胞有丝分裂逐渐缩短的端粒长度。研究证明，端粒与细胞寿命的控制密切相关6。人类端粒长度大约215 kb，由于存在末端复制问题，DNA每复制1次，端粒 DNA就会丢失50200 bp，随着细胞分裂次数的增加，端粒DNA也在进行性地缩短，当缩短到一定限度后，便不能维持染色体的稳定，使细胞失去了分裂增殖能力而衰老死亡，这种缩短就是衰老的标志。因此，端粒也被称为细胞的“生命钟”7。实验结果提示黄芪甲甙处理后的细胞，端粒酶活性显著提高。说明，黄芪甲

13、甙可通过提高HELF细胞端粒酶活性，进而由激活的端粒酶有效地抑制端粒长度的缩短，结果阻止了端粒的丢失，细胞因此能够维持正常分裂，使细胞进行正常染色体复制。如果无法激活端粒酶，细胞将只能面临衰老的结果。因此，黄芪甲甙可通过激活HELF细胞端粒酶活性起到延缓细胞衰老的作用。 Klotho基因是与人类衰老密切相关的一种新型基因8，有研究表明，该基因表达不足会引起衰老相关的病症。在衰老过程中该基因表达下降，如果将其转入到表达水平较低且有衰老相关疾病的大鼠或小鼠模型上，提高其表达，则衰老相关病症大大改善9，10，说明该基因有抗衰老的功能。使用黄芪甲甙处理细胞后，klotho表达升高，因此认为，黄芪甲甙还

14、可通过提高klotho基因的表达水平，起到延缓衰老的作用。但关于黄芪甲甙对klotho表达调节的分子机制尚有待深入的研究。【参考文献】 1 张鹏霞,朴金花,欧芹,等.黄芪对老年小鼠脑线粒体MnSOD,MDA及脑细胞凋亡影响的实验研究J.中国老年学杂志,2003;23(9):5967.2 李泓梅,赵丹威,张鹏霞,等.黄芪血清药理对人胚肺二倍体成纤维细胞(HDF)抗衰老作用机制的研究J.中国老年学杂志，2005;25(12):15302.3 Dimiri GP，Lee X，Basile G,et al.A biomarker that identifies senescent human cell

15、s in culture and in ageing skin in vivoJ.Proc Natl Acad Sci USA，1995；92（20）：93637.4 Savoysky E,Akamatsu K,Tsuchiya M,et al.Detection of telomerase activity by combination of TRAP method and scintillation proximity assay(SPA)J.Nucleic Acids Res,1996；24(6):11756.5 赵亮,张宗玉,童坦君.生物体衰老与复制衰老体内与体外研究J.生理科学进展，

16、2000;31(3):20510.6 Greider CW,Blackburn EH.The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificityJ.Cell，1987；51(6):88798.7 Griffith JD,Comeau L,Rosenfield S,et al.Mammalian telomeres end in a large duplex loopJ.Cell，1999；97(4)：50314.8 Kuroo M，Matsumura Y，Aizawa H，et al.Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageingJ.Nature，1997；390(6655):4551.9 ShirakiIida T,Iida A,Nabeshima Y,et al.Improvement of multiple pathophysiological phenotypes of klotho (kl/kl) mice by