EColi感受态细胞的制备质粒DNA的转化提取与酶切鉴定

1、1会计学EColi感受态细胞的制备质粒感受态细胞的制备质粒DNA的转化的转化提取与酶切鉴定提取与酶切鉴定二二.实验原理实验原理 1 1、感受态细胞制备、感受态细胞制备: :所谓所谓感受态感受态是指受体细胞处于容易吸收外源是指受体细胞处于容易吸收外源DNADNA的一种生的一种生理状态，可以通过物理与化学方法诱导形成，也可以自然形成，在基因工程技术理状态，可以通过物理与化学方法诱导形成，也可以自然形成，在基因工程技术中通常采用诱导的方法。用于转化的受体菌细胞一般是中通常采用诱导的方法。用于转化的受体菌细胞一般是限制限制- -修饰系统（修饰系统（Restriction-ModificationRes

2、triction-Modification）缺陷的变异株，以防止对导入的外源缺陷的变异株，以防止对导入的外源DNADNA的切割，的切割，用符号用符号R R- -M M- -表示。其基本原理是：细菌处于表示。其基本原理是：细菌处于00的的CaClCaCl2 2低渗溶液中，会膨胀成球形低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒DNADNA形成抗形成抗DNaseDNase的羟基的羟基- -钙磷酸钙磷酸复合物黏附于细胞表面，复合物黏附于细胞表面，经经 过过42短时间的热激处理，促进细胞吸收短时间的热激处理，促进细胞吸收DNA复合物，

3、复合物，在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，在选择培养基上可获得所需的裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化子转化子。 2、碱裂解法小量制备质粒、碱裂解法小量制备质粒DNA：碱裂解法是基于：碱裂解法是基于线性大分子染色体线性大分子染色体DNA与小分子环形质粒与小分子环形质粒DNA的变性的变性复性的差异达到分离目的的，在复性的差异达到分离目的的，在pH12.012.6的碱性环的碱性环境中，线型染色体境中，线型染色体DNA和环型质粒和环型质粒DNA氢键会发生断氢键会发生断裂，双链解开而变性，但质粒裂，双链解开而变性，但质粒DNA由于其

4、闭合环型结由于其闭合环型结构，氢键仅发生部分断裂，而且其互补链不完全分离；构，氢键仅发生部分断裂，而且其互补链不完全分离；当将当将pH值调节到中性并在高盐浓度下，已分开的染色值调节到中性并在高盐浓度下，已分开的染色体体DNA互补链不能复性而交联形成不溶的网状结构，互补链不能复性而交联形成不溶的网状结构，通过离心，大部分染色体通过离心，大部分染色体DNA、不稳定的大分子、不稳定的大分子 RNA和蛋白质和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，而复合物等一起沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合环状的质粒部分变性的闭合环状的质粒DNA在中性条件下很快复在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型，呈可溶

5、性状态保存与溶液中，性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶液中，离心后上清中便含有所需要的质粒离心后上清中便含有所需要的质粒DNA。 3、限制性内切酶：、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一又称为内切酶或限制酶，是一类能识别双链类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的分子特异性核酸序列的DNA水解酶，水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物是体外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。中。 (4) (4)、有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列，甚至切割的位点也相同，称、有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列，甚至切割的位点也相同，称为为同裂酶同裂酶或或异源

6、同工酶异源同工酶，如，如Hpa IIHpa II与与Msp IMsp I；有的识别位点不同，但对；有的识别位点不同，但对DNADNA切割后可产生切割后可产生相同的粘性末端，称为相同的粘性末端，称为同尾酶同尾酶，如，如BamHBamH I I与与BglBgl IIII。 影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素： DNADNA的纯度；的纯度； DNADNA的甲基化程度；的甲基化程度； 酶切消化反应的温度；酶切消化反应的温度； DNADNA的分子结构；溶液中离子浓度及种类；的分子结构；溶液中离子浓度及种类； 缓冲液的缓冲液的 pHpH值。值。 4、琼脂糖凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳

7、: 琼脂糖溶化再凝固后能形成琼脂糖溶化再凝固后能形成带具有一定形状、大小与孔隙度的固体基质带具有一定形状、大小与孔隙度的固体基质 (密度与密度与琼脂糖浓度相关琼脂糖浓度相关)；而生理条件下，核酸分子的糖；而生理条件下，核酸分子的糖-磷磷酸骨架中磷酸基团呈酸骨架中磷酸基团呈离子化离子化状态，因此将核酸分子置状态，因此将核酸分子置于电场中时，它们会向正极迁移，由于糖于电场中时，它们会向正极迁移，由于糖-磷酸骨架在磷酸骨架在结构上的重复性，相同数量的双链结构上的重复性，相同数量的双链DNA几乎具有等量几乎具有等量的净电荷，因此他们能以同样的速度向正极方向迁移。的净电荷，因此他们能以同样的速度向正极方

8、向迁移。在一定的电场强度下，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构象。分子本身的大小和构象。分子量较小的分子量较小的DNA分子，比分子，比分子量较大的分子量较大的DNA分子，具有较紧密的构型，所以分子，具有较紧密的构型，所以其其电泳迁移速率也就比同等分子量的松散型的开环电泳迁移速率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性分子或线性DNA分子要快分子要快。直接用低浓度的。直接用低浓度的EB进行进行染染色，可确定色，可确定DNA在胶中的位置。在胶中的位置。 影响琼脂糖凝胶电泳影响琼脂糖凝胶电泳DNADNA迁移率的因素：迁移率的因素： DNAD

9、NA的分子大小；的分子大小； 琼脂糖浓度；琼脂糖浓度； DNADNA构象；构象； 电场强度；电场强度； 碱基组成与温度；嵌入染料的存在；电泳缓冲液的组成。碱基组成与温度；嵌入染料的存在；电泳缓冲液的组成。 三实验材料与设备：三实验材料与设备：1 1、用品与与仪器：、用品与与仪器： 超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养箱、恒温振荡器、移液器、微超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝胶型离心管等、台式冷冻高速离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝胶成像仪、冰箱、制冰机等

10、；成像仪、冰箱、制冰机等； 1.5mL 1.5mL 与与0.5mL Eppendorf 0.5mL Eppendorf 管、管、tiptip头头 、烧杯、量筒、烧杯、量筒 镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、 吸水纸，一次性塑料手套等；吸水纸，一次性塑料手套等； E.coli DH5受体菌受体菌(R-M-)， pGEX-PDIP-r质粒质粒(AmpR) LBLB培养基培养基: :蛋白胨蛋白胨 10g/L10g/L，酵母提取物，酵母提取物 5g/L5g/L， NaCl 10g/LNaCl 10g/L，琼脂粉，琼脂粉 15g/L15g/L（固

11、体培养基），用（固体培养基），用10 10 mol/Lmol/L的的NaOHNaOH调节调节pHpH为为7.07.0，高压灭菌；，高压灭菌； 氨苄青霉素贮存液：浓度氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg50-100mgmLmL； 含有抗菌素的含有抗菌素的LBLB平板培养基：将配置好的平板培养基：将配置好的LBLB固体培固体培养基高压灭菌后，冷却到养基高压灭菌后，冷却到6060度左右，加入氨苄青霉素度左右，加入氨苄青霉素（终浓度为（终浓度为50g50gmLmL浓度浓度50-100g50-100gmLmL）；）； 0.1mol/LCaCl0.1mol/LCaCl2 2：称取：称取1.1g1.1g进

12、口无水进口无水CaClCaCl2 2，溶于，溶于70mL70mL双蒸水中，定容到双蒸水中，定容到100mL100mL，过滤后灭菌；，过滤后灭菌；0.1mol/LCaCl0.1mol/LCaCl2 2 1515甘油：甘油：100ml 0.1mol/L 100ml 0.1mol/L CaClCaCl2 2 溶液内含有溶液内含有15ml15ml甘油，高压灭菌；甘油，高压灭菌； 溶液溶液I: 50mmol/LI: 50mmol/L葡萄糖，葡萄糖，10mmol/L EDTA 10mmol/L EDTA (pH8.0)(pH8.0)， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)25mmol/L T

13、ris-HCl (pH8.0)； 溶液溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS ( (现配现用现配现用) )； 溶液溶液III: III: 乙酸钾溶液乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL(3M, pH=4.8)( 60mL的的5mol/L KAc, 11.5ml 5mol/L KAc, 11.5ml 冰醋酸，冰醋酸，28.5mL H2O)28.5mL H2O)； RNase ARNase A： 10mg/ml10mg/ml； TETE缓冲液缓冲液: 10mmol/L: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/LT

14、ris-HCl, 1mmol/L，EDTAEDTA，pH8.0pH8.0； 5TBE缓冲液：缓冲液：0.45mol/L Tris硼酸，硼酸，0.01 mol/L EDTA, pH 8.0； 10Loading buffer：1% SDS, 0.05%溴酚兰，溴酚兰，50的甘油；的甘油； 无水乙醇；无水乙醇； 7070乙醇；乙醇； 标准分子量片段；标准分子量片段； 核酸内切酶核酸内切酶 EcoR I (TaKaRa)； EcoR I酶解缓冲液酶解缓冲液(10 buffer H)； 琼脂糖；琼脂糖； 溴化乙啶（溴化乙啶（EB）染色液）染色液(10mg/ml)。四操作步骤四操作步骤: ( (一一)

15、) 感受态细胞的制备：感受态细胞的制备： 1 1、从新活化的、从新活化的E.coliE.coli DH5 DH5平板上挑取一平板上挑取一单菌落单菌落，接种于，接种于3 35ml LB5ml LB液体培养中，液体培养中，3737振荡培养至对数生长期振荡培养至对数生长期( (12h左右左右) )； 2 2、将该菌悬液以、将该菌悬液以1:1001:1001:501:50转接于转接于100ml LB100ml LB液体培养基中，液体培养基中，3737振荡扩大培养，振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔当培养液开始出现混浊后，每隔202030min30min测一次测一次ODOD600600，至，至O

16、DOD600600为为0.30.30.50.5时停止培养时停止培养，并转装到，并转装到1.5 mL1.5 mL离心管中；离心管中； 3 3、培养物于冰上放置、培养物于冰上放置20min20min； 4 4、 0 044，4000g4000g离心离心10min10min，弃去上清液，加入，弃去上清液，加入1 mL1 mL冰冷的冰冷的0.1mo10.1mo1L CaClL CaCl2 2溶溶液，小心悬浮细胞液，小心悬浮细胞, , 冰浴冰浴2020分钟；分钟；CaClCaCl2 2纯度至关重要，不同厂家，纯度至关重要，不同厂家，甚至同一厂家不同批号的产品均影响感受态的转化效率甚至同一厂家不同批号的产

17、品均影响感受态的转化效率 5、04， 4000g离心离心10min，倒净上清培养液，再用倒净上清培养液，再用1.0 mL1.0 mL冰冷的冰冷的0.1mo10.1mo1L L CaClCaCl2 2溶液溶液轻轻悬浮轻轻悬浮细胞，冰浴细胞，冰浴20min20min； 6 6、 04， 4000g离心离心10min，弃去上清液，加入弃去上清液，加入100 L100 L冰冷的冰冷的0.1mo10.1mo1L L CaClCaCl2 2溶液，溶液，小心悬浮细胞小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液； 8 8、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实

18、验，、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在如果在4 4放置放置1224h，其转，其转化效率可以增高化效率可以增高46倍倍；也可加入占总体积也可加入占总体积1515左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml1.5ml离心管中，置于离心管中，置于-70-70条件下，可保存半年至一年。条件下，可保存半年至一年。（二）质粒（二）质粒DNADNA的转化：的转化： 1 1、每、每100L100L感受态细胞悬液中加入感受态细胞悬液中加入1L1L质粒质粒DNA,DNA,轻轻摇匀，同时设置三组对照：轻轻摇匀，同时设置三组对照：( (1)1)不加质粒，不加质粒，(2

19、)不加受体菌，不加受体菌， (3)加已知具有转化活性的质粒加已知具有转化活性的质粒DNA，具体操作按下表进行具体操作按下表进行：*阳性对照，用已知具有转化活性的pGEX-PDIP-r质粒DNA进行转化 2、冰上放置、冰上放置2030min，然后，然后42水浴热激水浴热激90120 Sec，迅速冰上冷却迅速冰上冷却2min； 3、 立即向上述立即向上述Ep管中加入管中加入0.8mL LB液体培养基，液体培养基，摇匀后于摇匀后于37振荡培养约振荡培养约1530min ，使受体菌恢复正，使受体菌恢复正常生长状态及表达抗性基因；常生长状态及表达抗性基因； 4、取培养液、取培养液50L接种于含抗菌素的接

20、种于含抗菌素的LB平板培养基平板培养基上，用玻璃涂棒涂匀；上，用玻璃涂棒涂匀； 5、将培养皿放在、将培养皿放在37恒温培养箱培养恒温培养箱培养30 min,待菌待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37恒温培养恒温培养箱内培养过夜箱内培养过夜(14-16h) ；（三）碱裂解法小量制备质粒（三）碱裂解法小量制备质粒DNA:DNA: 1 1、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培养基中，种到液体培养基中，3737震荡培养震荡培养12121616小时；小时； 2 2、将、将1.5mL1.5mL菌液加入菌液加入Ep

21、Ep离心管中，离心管中，12000 g12000 g离心离心30 Sec30 Sec，弃上清液，在吸水纸上扣干；，弃上清液，在吸水纸上扣干； 离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮 3 3、加入、加入100100 L L预冷的溶液预冷的溶液I I ，于涡旋振荡器上，于涡旋振荡器上振荡悬浮细菌细胞，尽量使细胞分散；振荡悬浮细菌细胞，尽量使细胞分散； 溶液溶液I I中的葡萄糖的作用是增大让一让的粘度，减少提取中的葡萄糖的作用是增大让一让的粘度，减少提取 过程中的机械剪切力，防止染色体过程中的机械剪切力，防止染色体DNA DNA 的断裂；的断裂；EDTA

22、EDTA的作的作用是与二价离子（用是与二价离子（CaCa2 2）结合，降低）结合，降低DNaseDNase对对DNADNA的降解。的降解。 4 4、加入、加入200200 L L新配制的溶液新配制的溶液II, II, 盖紧管口盖紧管口, ,快速快速颠倒离心管颠倒离心管, ,以混匀内容物以混匀内容物, ,冰上放置冰上放置3 35min;5min; 溶液溶液II II中的中的NaOHNaOH与与SDSSDS可裂解细胞，使可裂解细胞，使DNADNA变变 性以及性以及SDSSDS使蛋白变性并形成交联的网状结构使蛋白变性并形成交联的网状结构 5 5、加入、加入150150 l l溶液溶液III, III

23、, 加盖后颠倒加盖后颠倒6-76-7次混匀，冰次混匀，冰上放置上放置2 23min3min； 溶液溶液III III为低为低pHpH的醋酸钾缓冲液，中和的醋酸钾缓冲液，中和NaOHNaOH，以便使部，以便使部 分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体DNADNA不能正确复性不能正确复性 6、12000 g12000 g离心离心6 min6 min，将上清移入另一干净的，将上清移入另一干净的Ep管中；管中； 7 7、加、加2 2倍上清体积倍上清体积( (约约1mL)1mL)的无水乙醇的无水乙醇, , 振荡混匀，振荡混匀，室温放置室温放置2min.2min. 8、 12

24、000g离心离心10min，弃上清液，再用，弃上清液，再用70的乙醇的乙醇洗涤一次，洗涤一次， 12000g离心离心1min，离心管倒置于吸水纸上，离心管倒置于吸水纸上扣干，然后在中空浓缩系统上干燥质粒；扣干，然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9、加入、加入40 L含含20 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或的灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约约8min)，存于，存于20或直接用于酶切或直接用于酶切。 ( (四四) )提取质粒的酶切鉴定与琼脂糖凝胶电泳：提取质粒的酶切鉴定与琼脂糖凝胶电泳： 1、在、在0.5mL Ep管中

25、依次加入下列溶液于管中依次加入下列溶液于0.5ml离离心管中心管中 提取质粒提取质粒DNA 3.0 L 10 buffer H 1.0 l EcoR I 2.0 U dd H2O 5.8 L 10 L 1U: 11U: 1单位酶通常定义为，在建议缓冲液及温度下，单位酶通常定义为，在建议缓冲液及温度下， 在在20 20 L L 反应液中反应反应液中反应1h1h，使，使1 1 g DNAg DNA完全消化所需的酶量完全消化所需的酶量. . 2、 轻轻混匀轻轻混匀, 4000g离心离心10秒秒 ，置于，置于37水浴中水浴中酶解酶解1.5h。 3、酶解完成后，加入、酶解完成后，加入1.2 l 10上样

26、缓冲液上样缓冲液(或或2 l 6上样缓冲液上样缓冲液), 混匀混匀. 4、称取、称取1g琼脂糖，置于三角瓶中，加入琼脂糖，置于三角瓶中，加入100mL 0.5TBE或或1TAE缓冲液，瓶口倒扣一个小烧杯，缓冲液，瓶口倒扣一个小烧杯，将该三角瓶置于微波炉加热直至琼脂糖溶解。将该三角瓶置于微波炉加热直至琼脂糖溶解。 5、将梳子放置在制胶槽上，在冷却至、将梳子放置在制胶槽上，在冷却至60左右的左右的琼脂糖凝胶液加入一小滴琼脂糖凝胶液加入一小滴EB，小心混匀小心混匀，倒到制胶槽，倒到制胶槽上，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层，上，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层，不不要产生气泡（厚度约为要

27、产生气泡（厚度约为34mm）； 6、 室温下静置室温下静置30min左右，待凝固完全后，左右，待凝固完全后，轻轻轻轻拔出梳子拔出梳子。 7、制好胶后将凝胶连同内槽放在含有、制好胶后将凝胶连同内槽放在含有0.5TBE或或1TAE缓冲液的电泳槽中使用缓冲液的电泳槽中使用(注意注意: :电泳槽中的缓电泳槽中的缓冲液应与配胶用的缓冲液成分、浓度一致冲液应与配胶用的缓冲液成分、浓度一致)。 8、用微量加样器将样品分别加入胶板的样品孔内、用微量加样器将样品分别加入胶板的样品孔内加完样后的凝胶板即可通电进行电泳（加完样后的凝胶板即可通电进行电泳（80100V的电的电压下电泳，一般情况下，压下电泳，一般情况下

28、，电压电压/ /电极间距离应小于电极间距离应小于5V/cm5V/cm），当溴酚兰移动到距离胶板下沿约），当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处停处停止电泳。止电泳。 9、在紫外灯、在紫外灯(310nm波长波长)下观察染色后的凝胶。下观察染色后的凝胶。DNA存在存在处显示出红色的荧光条带处显示出红色的荧光条带(在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤，拍照电泳，拍照电泳图谱时，可采用凝胶成象系统图谱时，可采用凝胶成象系统)。五五. 实验结果报告：实验结果报告： 1、转化效率的计算、转化效

29、率的计算 ： 转化子总数菌落数（转化反应原液总体积转化子总数菌落数（转化反应原液总体积/涂板菌液体积）涂板菌液体积） 转化效率转化效率（每微克质粒每微克质粒DNA的转化子数的转化子数） 转化子总数（个转化子）转化子总数（个转化子）/加入质加入质粒粒DNA的量（的量（g） 2、质粒提取与酶切鉴定结果，贴上打印实验照片并标明照片上各、质粒提取与酶切鉴定结果，贴上打印实验照片并标明照片上各DNA条带的条带的含义。含义。二二.实验原理实验原理 1 1、感受态细胞制备、感受态细胞制备: :所谓所谓感受态感受态是指受体细胞处于容易吸收外源是指受体细胞处于容易吸收外源DNADNA的一种生的一种生理状态，可以

30、通过物理与化学方法诱导形成，也可以自然形成，在基因工程技术理状态，可以通过物理与化学方法诱导形成，也可以自然形成，在基因工程技术中通常采用诱导的方法。用于转化的受体菌细胞一般是中通常采用诱导的方法。用于转化的受体菌细胞一般是限制限制- -修饰系统（修饰系统（Restriction-ModificationRestriction-Modification）缺陷的变异株，以防止对导入的外源缺陷的变异株，以防止对导入的外源DNADNA的切割，的切割，用符号用符号R R- -M M- -表示。其基本原理是：细菌处于表示。其基本原理是：细菌处于00的的CaClCaCl2 2低渗溶液中，会膨胀成球形低渗溶

31、液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒DNADNA形成抗形成抗DNaseDNase的羟基的羟基- -钙磷酸钙磷酸复合物黏附于细胞表面，复合物黏附于细胞表面，经经 (4) (4)、有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列，甚至切割的位点也相同，称、有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列，甚至切割的位点也相同，称为为同裂酶同裂酶或或异源同工酶异源同工酶，如，如Hpa IIHpa II与与Msp IMsp I；有的识别位点不同，但对；有的识别位点不同，但对DNADNA切割后可产生切割后可产生相同的粘性末端，称为相同的粘性末端，

32、称为同尾酶同尾酶，如，如BamHBamH I I与与BglBgl IIII。四操作步骤四操作步骤: ( (一一) ) 感受态细胞的制备：感受态细胞的制备： 1 1、从新活化的、从新活化的E.coliE.coli DH5 DH5平板上挑取一平板上挑取一单菌落单菌落，接种于，接种于3 35ml LB5ml LB液体培养中，液体培养中，3737振荡培养至对数生长期振荡培养至对数生长期( (12h左右左右) )； 2 2、将该菌悬液以、将该菌悬液以1:1001:1001:501:50转接于转接于100ml LB100ml LB液体培养基中，液体培养基中，3737振荡扩大培养，振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔当培养液开始出现混浊后，每隔202030min30min测一次测一次ODOD600600，至，至ODOD600600为为0.30.30.50.5时停止培养时停止培养，并转装到，并转装到1.5 mL1.5 mL离心