BOP基因的克隆及鉴定

1、Bop基因克隆摘要：以pUC18质粒为载体，bop基因为目的基因，通过PCR扩增出含目的基因，将克隆载体pUC18和bop基因经限制性内切酶酶切后，在T4DNA接酶连接下，形成重组质粒并转化入大肠杆菌DH5a。通过氨苄青霉素平板筛选出抗性转化子，对重组子进行PCR和酶切，电泳鉴定检测完成了bop基因额的克隆。关键词：基因克隆；PCR；BOP基因第一章1.前言1.1 基因工程狭义上仅指基因工程。是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传，表达出新产物或新性状。重组DNA分子需在受体细胞中复制扩增，故还可将基因工程表征为分子克

2、隆（Molecular Cloning）或基因克隆（Gene Cloning）。广义上包括传统遗传操作中的杂交技术、现代遗传操作中的基因工程和细胞工程。是指DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术：基因重组、克隆和表达的设计与构建（即DNA重组技术）；下游技术：基因工程菌（细胞）的大规模培养、外源基因表达产物的分离纯化过程。广义的基因工程概念更倾向于工程学的范畴。广义的基因工程是一个高度的统一体：上游重组DNA的设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想；下游过程则是上游重组蓝图的体现与保证。-基因工程产业化的基本原则。基因工程是指重组DNA技术的产业化设

3、计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞或基因工程生物体的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型。 从实质上讲，基因工程的定义强调了外源DNA分子的新组合被引入到一种新的寄主生物中进行繁殖。这种DNA分子的新组合是按工程学的方法进行设计和操作的，这就赋予基因工程跨越天然物种屏

4、障的能力，克服了固有的生物种（species）间限制，扩大和带来了定向改造生物的可能性，这是基因工程的最大特点。基因工程包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构成新的重组的DNA，然后送到受体生物中去表达，从而产生遗传物质的转移和重新组合。11.2 PCR技术基本原理 PCR技术的基本原理：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依靠于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱

5、氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。   PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。类似于DNA的自然复制过程，其特异性依靠于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作预备；模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DN

6、A经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的适温延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保存复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保存复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。21.3 感受态细胞 感受态细胞（competent cell）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直

7、观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。21.4 酶切鉴定 实验在重组质粒构建，重组质粒pUC18-bop采用BamH I、Hand 双酶切鉴定，在对双酶切产物进行1琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像图中可以看到所得条带都不是很清晰，有拖尾现象出现。这可能由于未待胶完全凝固时加样了；重组质粒条带有明显拖带出现，这与质粒提取，提纯操作有关！但可以看出其分子量同bop基因分子量（1

8、200bp左右）一至。酶切能进一步证实bop基因的成功克隆。但就实验设计来看，为更清晰看到双酶切前后及PCR扩增片段与bop基因区别，笔者建议将克隆载体pUC18质粒，PCR扩增产物，酶切后的克隆载体及目的基因在一块琼脂糖凝胶上电泳。【2】2实验材料与仪器2.1实验材料2.1.1 生物材料大肠杆菌（Escherichia coli）DH5,克隆载体pUC 18由武汉大学东湖分校生物技术实验室保存，含bop基因的pUC 19质粒的大肠杆菌由武汉大学东湖分校金卫华老师提供。2.1.2 生化材料T4DNA连接酶，BamH I及Hind核酸内切酶等均购自大连Takara公司，氨苄青霉素（Amp）购自上

9、海生工公司，Marker购自Fermentas公司，电泳用琼脂糖及细菌培养用琼脂均购自晶美公司。DNA回收试剂盒购自MBI公司。2.2主要实验试剂2.2.1 LB液体培养基：精确称取胰化蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，NaCI lg放入烧杯内，加蒸馏水充分溶解后定容至100mL，121高压下蒸汽灭菌20min。储存于4备用。2.2.2 LB固体培养基：取配置好的未高压蒸汽灭菌的LB液体培养基50ml加入细菌培养用琼脂(BactoAgar)0.5g，混匀后121高压蒸汽灭菌20min。储存于4备用。2.2.3 碱性裂解液：精确称取葡萄糖0.495g，Tris碱0.0303g，二水乙二胺四乙酸二钠

10、0.146g与小烧杯中，用蒸馏水充分溶解后定容至50ml。2.2.4 碱性裂解液：精确移取0.2mol/L的NaOH 20L，1的SDS 20L，加蒸馏水160L混匀。(注意:0.2mol/L的NaOH和1的SDS分开配,临时混合用)2.2.5 碱性裂解液：精确移取5mol/L的乙酸钾30ml，冰乙酸5.8ml，加入蒸馏水并定容至50ml。2.2.6 上样缓冲液：精确称取溴酚蓝2.5mg，加入60甘油0.6ml，50EDTA0.5g，摇匀后加蒸馏水至1ml。2.2.7 0.1molL CaCl2 ：精确称取1.19无水CaCl2定容至100ml，121，121高压蒸汽灭菌20分钟，4"

11、;C保存。2.2.8 灭菌蒸馏水：蒸馏水水分装后121高压蒸汽灭菌后，4保存备用。2.3主要实验仪器洁净工作台（等级：100级，上海博迅实业有限公司医疗设备）高速离心机（D-37520，sigma） 电子天平（JY2002，上海衡平仪器仪表厂） 分析天平（AUY120,SHIMADZU） 数显鼓风干燥箱（GZX-9240 MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）MJ-300BS-霉菌培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）超速离心机（D-78532 Tuttlingen，Hettich） 微量加样枪 凝胶成像系 PCR仪 恒温振荡器（CHA-S，国华企业） 稳压稳流电泳仪（JY-600PJ，北京

12、君意东方）调速多用振荡器（HY-4，国华电器有限公司）美的电冰箱（美的集团电冰箱制造有限公司）3实验方法3.1菌种活化（1） LB培养基的配置称取蛋白胨1g、氯化钠1g、酵母提取物0.5g放于烧杯中，加适量蒸馏水搅拌溶化并定容至100ml。完全溶解后，分装到两个三角瓶中，每个三角瓶中各50ml。向其中一个三角瓶中加入1.2g琼脂粉后，塞上棉塞，并用报纸和棉线扎紧瓶口。（2）灭菌 将枪头、50mlLB固体培养基、50mlLB液体培养基、装有牙签的培养皿、10支试管、四个培养皿放入灭菌锅121灭菌20min.（3）无菌接种在无菌操作台中，取出LB固体培养基，待其温度降至50左右（不烫手）,加入50

13、L氨苄青霉素.混匀后，倒三个平板。培养基凝固后，分别划线接种含PUC18 、PUC19质粒的大肠杆菌菌种，编号1、2。平板倒置放在37培养箱中培养过夜。（4） 挑单菌落 在无菌操作台中，取出LB液体培养基，待其温度降至50左右（不烫手）,加入50L氨苄青霉素.充分混匀后，分装于10支试管中，每支试管各5ml。用镊子取无菌牙签挑取1、2平板上的单菌落，接种于于5ml LB含氨卞青霉素（0.1g/ml）的液体培养基内，37，250rpm，恒温摇床振荡增殖培养过夜。3.2 SDS碱裂解法制备质粒 （1） 细菌收集用微量移液枪各取1mL两种菌液至1.5ml EP管内做好标记，6 000 rpm离心3m

14、in，弃尽上清液。再次取样1mL菌液至同一EP管内，重复离心，留沉淀。（2） 细菌裂解向上述沉淀中加入100L冰预冷的碱裂解液，强烈振荡混匀（用移液枪吹打）至菌悬液完全浑浊；加入200L新配置的碱裂解液于菌悬液中，盖严管盖，轻轻颠倒混匀4-5次，但切勿振荡，冰浴约5min，至瓶盖下出现粘稠丝状物为止；再加入150L预冷的溶液，盖严管盖，温和振荡数次，冰浴5min。（3） 提取质粒10 000rpm 室温离心5min，取上清至一个新的无菌的1.5mL EP管中。（4）质粒纯化向上述上清中加入等体积酚氯仿(1:1)，振荡混匀，10000rpm离心5min，上清转移至另一个EP管中；将酚氯仿的混合物

15、换成等体积的氯仿，振荡混匀，10000rpm离心5min，上清转移至另一个EP管中；向上述上清中加入等体积的异丙醇，轻微振荡后摇匀，室温静置5min；10000rpm离心10min，去上清，向EP管中加入70%酒精200l，盖紧管口，颠倒几次，10 000rpm离心2min，弃去上清液，在50烘箱中烘干至沉淀变透明。重复以上操作，再制备等量两种菌种的纯化质粒各一支，分别标记PUC18 、PUC19。（5） 纯化质粒DNA 将同种纯化质粒的两管混合，加入50L蒸馏水，并加入2L 的去除了DNA酶的RNA酶，-20冰箱保存备用。3.3 质粒DNA琼脂糖凝胶电泳检测（1） 配胶称取琼脂糖0.25g放

16、入三角瓶，加25ml电泳缓冲液，在电炉上充分加热溶解。滴加一小滴EB（溴化乙锭）溶液，使溶胶成微红色，摇匀。（2） 制胶在室温下冷却至65左右，向放好梳子和挡板的槽内到胶，厚度约0.3cm左右。待胶体凝固后，小心拔出梳子，将电泳胶放到电泳槽的平台上，加电泳缓冲液使其刚好浸没胶面。（3） 加样分别取获得的质粒DNA 10L在塑料手套与2L含溴酚蓝指示剂的上样缓冲液，混匀后取10l上样。同时取5L DNA Marker上样。（4） 电泳以上样槽一端为负极接通电源，调节电压至100V,约20min后，根据溴酚蓝指示剂的迁移位置，决定是否终止电泳。（5）紫外观察切断电源，取出凝胶，置于紫外透视仪上观察

17、实验结果并拍照。3.4 DNA酶切（1）取一离心管，分别加入： 5L无菌水、2L10xBuffer、 11L质粒DNA 、1LBamH I 、1L Hand ，总体积共20L。（2）混匀后，离心5秒，37酶切过夜。3.5酶切后产物回收纯化（1）配胶称取琼脂糖0.3g放入三角瓶，加30ml电泳缓冲液，在电炉上充分加热溶解。滴加一小滴EB（溴化乙锭）溶液，使溶胶成微红色，摇匀。（2）制胶在室温下冷却至65左右，向放好梳子和挡板的槽内到胶，厚度约0.3cm左右。待胶体凝固后，小心拔出梳子，将电泳胶放到电泳槽的平台上，加电2L泳缓冲液使其刚好浸没胶面。（3）加样分别取获得的质粒DNA 20L在塑料手套

18、与4L含溴酚蓝指示剂的上样缓冲液，混匀后上样。同时取5L DNA Marker上样。（4） 电泳以上样槽一端为负极接通电源，调节电压至100V,约20min左右。3.6 酶切载体pUC 18 与bop基因的连接反应（1）取一离心管，分别加入：2L酶切pUC 18、15L酶切外源基因片段、1L T4 连接酶、2L10×T4 连接酶 Buffer，总体积共20L。（2）混匀后，离心5秒，置于16恒温水浴箱内静置过夜。3.7 CaCl2制备感受态细胞(1) 活化菌种 从接有大肠杆菌DH5的LB平板上挑取单菌落，接种到含5ml LB培养基的无菌试管中，37，250rpm恒温摇床中震荡过夜。

19、(2)扩大培养 取1L菌液转移到装有5ml LB培养基的试管中(1：50)，37，250rpm恒温摇床培养3h 。(3) 将活化好的菌种与冰水混合物中放置10min，取1ml菌液置于1.5ml无菌离心管中，4 4000rpm离心5min，倒掉上清。(4) 在上述沉淀中加入800L冰预冷的0.1mol/L的CaCl2（已灭菌），用移液器吹打悬浮菌体。(5)重复上述两个步骤，6000rpm离心5min，去上清，收集菌体，再加入100L冰预冷的0.1mol/L的Call2（已灭菌），重悬细胞，于-20冰箱放置备用。2.2.8质粒DNA的转化（1）从-20冰箱中取出感受态细胞(2001)，移取501置

20、于空离心管中，再加入20l连接产物，温和混匀.(2)先室温静置30min，再冰浴静置lO-30min，然后，42静置水浴热激90s，立即移置冰浴中，放置30min使之冷却。（3）分别取100l转化菌液均匀涂布于3个事先制备好的氨苄青霉素（0.1g/ml）LB琼脂平板上，并以501感受态细胞涂布3个平板作为对照组。 （4）将平板正向放置在37恒温培养箱1h，直到表面液体都渗到培养基后再倒置培养过夜后观察。3.8 PCR扩增目的基因（1）依次向PCR反应管中加入无菌水20.5l、10xPCR buffer 2.5l、20mmolL 4种dNTP混合液 0.5l 、20molL正向引物 0.5l 、

21、20molL负向引物 0.5l、1.2lTapDNA聚合酶 0.5l、模板DNA 1l,总体积25l.（以上试剂均事先在冰箱中冷藏保存）（2）充分混匀后，将PCR反应管放置在PCR仪的加热板上。（3）梯度PCR按下列条件扩增：先95变性5 min，再按如下参数循环30次：94变性30s，60退火30 s，72延伸1min30s 。最后，72保温5min.（4）PCR回收产物检测按照2.2.3称取琼脂糖0.2g放入三角瓶，加20ml电泳缓冲液配胶、制胶，取10lPCR产物和2l 6x1000 loading buffer混合液10l上样，同时取5L DNA Marker上样。观察电泳后结果并拍照

22、。34 结果与讨论4.1 实验结果4.1.1 pUC18和pUC19-bop质粒DNA电泳鉴定提取含pUC18和pUC19-bop两种质粒DNA，蒸馏水溶解，RNA消化酶处理，经1琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统成像。与DNA Marker相比较，两种质粒DNA在1200bp到2000bp之间均有一条清晰明亮DNA条带 (图1)。 1 2 3 4 5 6 7 M bp 2000 1000 0 图1 pUC18质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定M：DL2000Marker；17：pUC18质粒DNA；4.1.2 pUC19-bop质粒PCR扩增产物电泳鉴定从pUC19-bop质粒经PCR特异性扩增目的基

23、因bop，经1琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统成像。与DNA Marker相比较，在1000bp到2000bp之间有一条明显特异性条带，与预期大小1200bp相符，初步确定此处为PCR扩增得到的含bop基因片段；在100bp处有条带出现，初步推断此处PCR扩增体系中的引物（图2）。 1 2 3 4 5 6 7 8 M bp 2000 1200 0图2 bop基因的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果M：DL2000Marker；18：PCR扩增产物4.1.3 克隆载体pUC18酶切产物电泳鉴定将克隆载体pUC18Hand 酶切，经1琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统成像。与DNA Marker相比较，孔

24、上样孔在2000bp之上有一条带，与预期大2656bp相符，可以初步确定此处为此处为pUC18经Hand 酶切后质粒DNA；（图3）。电泳条带清晰，无拖尾和污染出现，说明经酶切的克隆载体pUC18及目的片段可用于下一步于载体连接。 2000图3 克隆载体pUC18及bop基因片段琼脂糖凝胶电泳结果M：DL2000Marker；2条光带为酶切后的pUC18；4.1.4 重组质粒的制备及抗性筛选目的片段和pUC18 Hand酶切后，用T4DNA连接酶16静置过夜后，转化到大肠杆菌DH5感受态细胞。转化产物在Amp+的LB平板上（设计空白、阳性和阴性对照组）37培养过夜，只有转化质粒在Amp+的LB培养基上有菌落形成。图4导入重组质粒的感受态细胞 图5感受态细胞 4.1.5 重组质粒的PCR鉴定挑取阳性重组转化子白色菌落，在含有0.1g/ml氨苄青霉素的5m1 LB液体培养基培养过夜，小量提取质粒DNA，另取小量菌液做PCR扩增反应，将提取到的重组质粒DNA及PCR扩增产物