高速逆流色谱技术

1、高速逆流色谱技术目 录介绍1高速逆流色谱的原理11.系统描述21.1主机21.2恒流泵21.3紫外检测器31.4恒温循环器31.5色谱工作站32.主机描述32.1操作42.1.1传感器控制面板42.1.2电源开关42.1.3样品进样口及样品出样口42.1.4进口42.1.5出口42.2六通阀42.3进样步骤82.4控制面板92.4.1功能键介绍92.4.2控制面板的操作92.5TBE-300B高速逆流色谱的工作流程103.安装103.1检查包裹103.2安装环境103.3连接管103.4连接保温系统的管路113.5连接信号线124.操作124.1准备124.2操作程序124.3系统平衡134.

2、3.1单泵平衡134.3.2双泵平衡144.4样品分离145.维护145.1清洗系统145.2警告156.系统特性及工作参数15附录A15附录B16附录C17同田生物介绍逆流色谱（CCC）是一种无固体载体支持的液-液分配色谱技术。与其他柱色谱相比，逆流色谱不会导致不可逆吸附，样品，变性，污染及 等问题。除此之外，它能够分离分子量从小变到大的化合物，甚至一些生物大分子。高速逆流色谱（HSCCC）是逆流色谱中的最新的发展。高速逆流色谱不仅减少的分离时间，而且也极大地提高了分离度和制备能力。高速逆流色谱的应用：1、 制备性地分离毫克到克规模的样品；2、 从粗样品中分离目标化合物；3、 分离放射性同位

3、素。高速逆流色谱在分离天然产物中的优势：1、 更加方便和迅速；2、 不需要对样品进行前处理；3、 液-液分配容积系统的选择广泛；4、 因为没有固体载体，所以无死吸附，无污染；5、 高的重现性及重复性。高速逆流色谱的原理高速逆流色谱是基于一种特殊的现象流体动力学平衡。当高速逆流色谱在运转时，在呈螺旋状盘绕的线圈的高速行星式运动产生的离心力的作用下，不相容的两相将不断地混合。其中一相将作为固定相(上相或者下相)，而另一相将作为流动相通过恒流泵不断地注入柱子中去。固定相在行星运动产生的离心力作用下会保留在螺线管柱中，而流动相将不断地穿过固定相然后经出口流出。溶解物被流动相带入柱子中，在两相溶剂之间不

4、断地重复分配，然后根据各自不同的分配系数一次流出柱子。在流动相中分配系数大的溶质将先被洗脱出来，在流动相中分配系数小的溶质将后被洗脱出来。图1描述了流体动力学运动以及行星运动中不相容的两相溶剂的分布情况。在描述的上部分中，流体动力学平衡达到稳定后，柱子中出现彻底不同的两个区域：靠近轴直径四分子一的区域是混合区；该区域两相溶剂高频混合。其他区域是固定区：溶剂分成两层。重相溶剂相在系统外部，轻相溶剂系统在系统内部。在两相表面之间有一个分界线。描述的下部分是柱子从到到拉伸图，其与上部分描述中的和是符合的。随着柱子的旋转，每一混合区域都将以同样的速度朝着柱子的尾端流动（类似海浪表面的运动原理）。图1

5、螺旋管柱中流体动力学运动及两相溶剂分布在螺线管柱的任意一部分，两相溶剂总是以很高的频率混合和分层。当柱子以800转/分的速度旋转时，流动将在一分钟内13次通过固定相。因此，流动相流率在一个相对宽跨度的范围内，高速逆流色谱仍然达到很高的分离效率。1.系统描述TBE-300B高速逆流色谱系统包括如下几个部分：TBE-300主机，泵，检测器，温度调节循环器及色谱工作站。1.1主机主机分离样品。在螺旋管柱中，样品将被分成单一成分。根据它们各自的分配率，不同的成分将依次随流动相流出。主机系统包括，速度调节，六通阀，分离柱，保温膜等。1.2恒流泵恒流泵以恒定流率将主机泵入主机中。当泵运转时，泵的过滤器应该

6、处于溶剂表面之下以避免空气进入泵中，导致分离效率受影响。注意：建议采用中压及低压泵。安全压力设为2Mpa，精确度不超过0.1mL。1.3紫外检测器检测器会利用脉冲将经过分离的各组分的信号转变为电信号，同时将电信号传递到色谱工作站。在收集信号前，应该将检测器预热45min。1.4恒温循环器通过提供包裹有保温膜的恒定温度的工作介质，恒温循环器将帮助分离过程维持一个恒定及合适地温度。1.5色谱工作站色谱工作站将来自检测器的电信号经相关软件转换为数字信号，并记录它们的起伏。2.主机描述流路六通阀进样六通阀进口出口样品进口样品出口电源开关传感器控制面板图3 TBE-300B主机前面视图2.1操作2.1.

7、1传感器控制面板控制和显示旋转速度（转/分）。2.1.2电源开关向上推表示开，向下推表示关。用于接通和切断电源。当仪器不工作时，必须切断设备电源。在切断电源之前，必须保证主机完全停止运转。2.1.3样品进样口及样品出样口使用两个注射器针头作为样品进样口和出样口。将装有样品溶液的干净注射器A与样品进样口相连，将另一只空的注射器B与样品出样口相连。通过抽注射器B将注射器A中的样品吸入样品环中。2.1.4进口通过管将泵与分配柱的进口相连接。泵将流动相从进口经六通阀（当连接时）泵入分配柱中。主机面板上以In标记。2.1.5出口高速逆流色谱柱通过管与检测器相连。检测器不断地检测流出物。主机面板上以Out

8、标记。2.1.6六通阀见下面的2.2部分。2.2六通阀仪器配备有两个六通阀：流路转换六通阀（阀A）和进样六通阀（阀B）。阀A用于控制流动相的流路；在正向洗脱的情况下，当阀A转向In（错误的设置），流动相的流动方向是从分离柱的头到分离柱的尾。当阀A转向Out时，流动相的流动方向是从分离柱的尾到分离柱的头。过程A和B：过程A 流动相：亲水性相。洗脱方向：从头到尾（向下）。当阀A处于In时，流动相的流动方向是从分离柱的头到分离柱的尾。在亲脂性相中分配系数小的（K值）组分1首先被洗脱出来。其次，组分2被洗脱出来。K值大的组分3和4很难被洗脱出来而保留在疏水性的固定相中。洗脱组分3和4的操作：1. 在不

9、停主机的情况下，停泵；2. 将阀A从In转向Out；3. 调换流动相和固定相。用疏水性的相作为流动相，而用亲水性的相作为新的固定相；4. 重新连接，开泵；5. 如果出现基线漂移和真实的洗脱速度与设定的洗脱速度不一致的情况，在管的出口设置一个反压。6.过程B 流动相：疏水性相。 洗脱模式：从尾到头（向上）。如图C所示，当阀A转向Out，组分3和4的分配系数减小，然后被洗脱下来，因为亲水相和疏水相之间的调换。如图d所示，当阀A处于“In”且用亲水相作为流动相时，成份1和2被一次洗脱出来。当阀A处于“Out”且用亲脂相作为流动相时，成份3和4被洗脱出来。这样，样品中所有的成份都被洗脱出来了。 阀B是

10、用于将待分离的样品引入分离柱中。当阀B转向“Load”时，样品进入样品环中；然后，将阀B转向“Inject”，样品被流动相带入分配柱中。两个阀的连接及阀A的工作流路描述：图4 当阀A转向“In”时（阀B处于Inject）图5 当阀A转向“Out”时（阀B处于Inject）注意：当主机顺时针旋转时，阀A应该转向In。相反，当主逆时针旋转时，阀A应该转向Out。样品经过阀B的描述：图6 当阀B转向Load注射器与样品环相连，样品被注入样品环中（阀A处于In）图7 当阀B转向Inject泵与样品环相连，同时样品环与注射器之间的连接中断。样品环中的样品被流动相带入分离柱中。（阀A处于In）。当进样阀转

11、向Load。当进样阀转向Load位置时，拉注射器B的活塞使进样管中产生一个负压，注射器A中的样品在负压的作用下进入进样阀；然后将进样阀转向Inject位置。这样，整个进样完成。2.3进样步骤1、称取适量待分离样品；2、用分离系统溶剂（流动相或者固定相或者两者的混合溶剂）溶解样品。溶液中不应出现可见的颗粒。3、将进样阀转向“Load”（在转换时，操作要迅速以防瞬时产生的高压使管道爆破）。4、通过注射器将样品吸入样品环中。5、将阀B转向“Inject”。6、清洗进样阀的进样管道清洗步骤如下：1） 向注射器A中倒入大约20mL清洗液（例如乙醇）；2） 通过注射器B将清洗液抽入样品环中；3） 重复步骤

12、1和2，直到载样管道被清洗干净。注意：在进样时，首先通过进样阀B向样品环中注入一些空气以从Outlet端排除样品环中的空气；然后，拉注射器B的活塞将样品吸入样品环中。2.4控制面板控制面板用于调节分离柱的旋转参数。缓慢的增加（顺时针）或减少（逆时针）旋转速度直到获得理想速度。2.4.1功能键介绍：调高及调低设定值“FWD”：顺时针旋转键。选着顺时针旋转模式。“REV”：逆时针旋转键。选着逆时针旋转模式。速度调节旋钮。调节旋转速度。顺时针旋转增加转速，逆时针旋转减小转速。“STOP”：停止键。关闭主机。2.4.2控制面板的操作调节顺时针旋转速度1、 打开电源开关。三秒钟后，显示屏将闪烁。2、 按

13、下FWD键，顺时针旋转指示灯将变亮。3、 缓慢正向调节速度调节旋钮直到显示器上的速度到达理想值。调节逆向旋转速度1、 打开电源开关。三秒钟后，显示屏将闪烁。2、 按下REV键，逆时针旋转指示灯将变亮。3、 正向缓慢调节速度调节旋钮直到显示器上的速度到达理想值。停止旋转1、 逆时针缓慢调节速度调节旋钮直到显示屏显示速度为0。2、 按下STOP。旋转指示灯将熄灭，显示器上的0将闪烁。改变旋转方向A、 从正向旋转变成反向旋转1、 按照停止旋转的操作步骤停止分离柱的正向旋转。2、 按照逆向速度调节操作步骤操作。B、 从逆向旋转变成正向旋转1、 按照停止旋转的操作步骤停止分离柱的逆向旋转2、 按照正向速

14、度调节操作步骤操作2.5TBE-300B高速逆流色谱的工作流程3.安装3.1检查包裹在安装之前，请仔细检查仪器，看是否存在明显的破损以及附件是否齐全。3.2安装环境必须将仪器放置在一个长大约1500mm，宽大约750mm的稳定而安全的平台上。在仪器底部和平台之间放置一块厚3mm的弹性橡胶垫以防震动。确保将仪器安放在装有空调的房间内，并使其远离易燃易爆物品。3.3连接管.将滤头放入已配好的溶剂中。.将泵的出口端与TBE-300主机进口端通过聚四氟乙烯管相连。用扳手将接口扭紧至不漏液。.将溶剂泵入高速逆流色谱仪主机。.用聚四氟乙烯管将主机路出口端与检测器流通池进口端相连。.溶剂从主机流出，经管路进

15、入检测器流通池中。.最终，溶剂经检测流入收集容器中。3.4连接保温系统的管路将循环器的出口端与主机背面的INLET端相连。然后，将主机背面的OUTLET端与循环水浴器的进口端相连。所有的连接都需要很好的固定。3.5连接信号线从检测器中产生的信号经由信号线传入色谱工作站中。注意：在信号线的端口有红、黑两个终端。根据颜色将这些终端相连。4.操作4.1准备以一定的比例混合固定相和流动相。将混合液静置几个小时或者超声脱气半个小时。连接电源、信号线及管路。确保电源及信号线连接牢固，并确保流通管路无漏液。仔细检查管线保证它们处于正确的连接位置。4.2操作程序打开水浴：打开循环器的电源开关，介质将在循环器和

16、主机保温管路之间循环。根据用户使用指南设定温度，然后开始水浴。达到设定温度后，样品将在一个恒定的温度下被分离。警告：1.在开启主机前，确保加热循环介质已处于循环状态以防主机齿轮热膨胀被损坏。 2.我们建议采用蒸馏水作为温度调节循环器的工作介质，并且应该经常更换水。 3.循环器的设定温度应该小于40。 4.温度调节循环器上显示的温度比保温管中的实际温度小2。4.3系统平衡在行星运动下，当流动相通过螺旋管柱时，它会逐渐占据柱子中固定相的部分空间。由于行星运动，柱子中的两溶剂将到达动力学平衡。流动相不断地通过固定相并流出。在此过程中，柱子中仍然会保留部分固定相。我们称这一过程为系统平衡。平衡系统有两

17、种方法：4.3.1单泵平衡当色谱系统只配置一个当通道泵时，单泵平衡是唯一可行的方法。操作步骤如下：a)打开泵，以最高的流速将配好的固定相从主机进口端泵入主机；当固定相从出口端流出时，停泵。现在，主机中的管路充满了固定相；注意：1.在实验之前，应该将固定相和流动相静置24小时或者超声脱气半个小时。 2.确保固定相足够充满管路；确保泵的砂芯滤头总是处于固定相的液面之下以防将空气泵入分离柱中。 3.要经常清洗泵的砂芯滤头。 4.保持流体的压力在2MPa下以防主机中管路爆破。5.当泵下相时，做如下检查： 5-1.确保进样阀处于INJECT档； 5-2.检查管路有无泄漏情况。如果有，按照下述操作解决：a

18、.如果管路破了，用新的管路替换。b.如果管路的连接出有泄漏，将它们扭紧。c.如果仍然有泄漏情况，检查管路末端的气封垫是否损坏；如果是，则用新的替换。 5-3.检查管路是否堵塞。如果是，压力会逐渐增高。当超过2MPa，管路会爆破。因此，如果管路被堵塞，应该尽快地停泵。不要运行泵，除非故障被解决。b）打开主机电源开关，按下控制面板上的FWD键。然后缓慢地顺时针旋转速度调节柄知道旋转速度到达理想值。使主机逆时针旋转，先按REV键，其他操作同上。c）将泵进口端的滤头插入流动相液面下；运行泵，将流动相以适合的流速（建议2mL/min）泵入柱子中使系统平衡。警告：1.应该缓慢增加或减小旋转速度； 2.确保

19、泵的滤头总是处于流动相的液体中，以防空气被泵入分离柱中。 3.保持流体压力小于2MPa，以防损坏分离柱。 4.当环境中的温度低于5时，在关掉主机后，将循环系统中的所有水排空。 5.当长时间不使用仪器时，将循环系统中的水排放干净。4.3.2双泵平衡当高速逆流色谱系统配备有2个单通道泵或一个双通道泵时，我们能够选择这种方法。具体步骤如下： 以合适的比例设定两个泵的流率，然后同时运行它们。流速大的泵用于泵固定相，而流速小的泵用于泵流动相。 溶剂从主机的流出口流出，表明溶剂已经充满柱子，停止泵固定相；然后，设定流动相的流率作为工作流率。按照设定的速度和方向运行主机。 当溶剂在主机中到达平衡时，流出物为

20、流动相。4.4样品分离1.平衡后，记下固定相流出物的体积。通过注射器进样，同时调整检测器及色谱工作站的参数。记下色谱图，并收集样品成份。注意：在检测之前，运行检测器45min；通过记录固定相的体积，我们能够计算保留率。2.收集到成份后，关掉主机，排空管中的液体（用气体或者液体），同时收集固定相中的样品成份。5.维护5.1清洗系统a.在排完管路中的所有溶剂后，向分离柱中泵入大约50mL甲醇或乙醇；b.停泵，并将主机进口端与一气体供应装置相连。然后，将清洗溶剂经由吹出。c.如果需要，重复步骤1-2两次；d.在低于300的转速下逆时针旋转分离柱5min，同时向分离柱中吹气以排出剩余的溶剂。注意：根据

21、样品的特性选择清洗剂；甲醇和乙醇是常用的清洗剂。 如果溶剂系统中溶解有某种盐或者缓冲液，首先用蒸馏水清洗系统，然后用甲醇或乙醇清洗； 在清洗过程中，可以将主机与检测器相连以便检测器的流通池能够同时被清洗。5.2警告保持流体压力小于2MPa（大约每平方厘米20千克），以防分离柱被损坏。主机应该远离危险品（至少1m）。操作过程中，至少应有一人负责看管。6.系统特性及工作参数：管路容积：260mL旋转速度范围：01000rpm，建议转速范围700900rpm流动相的流速：通常采用1.52.5mL/min样品环体积：20mL最大压力：2MPa（每平方厘米20千克）电压：220±20v，频率：

22、50Hz尺寸：330×600×550mm重量：80Kg环境：高度<3000m 相对湿度<80% 温度：10-30附录ATBE-300系统测试（A）分离苯酚及间苯二酚 溶剂系统：正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水（1:1:1.2：0.8）根据上述比率配制溶液，并静置过液。上相溶剂作为固定相，而下相溶剂作为流动相。溶解样品（30mg苯酚和30mg间苯二酚）在上相和下相的混合溶剂中。1、测量柱溶剂（主机中管路的体积） 将500mL上相溶剂置于有刻度的烧瓶中，并泵入分离柱中。持续泵入固定相直至上相溶剂从出口端流出，流出液体积达到20mL。停泵后，记录有刻度烧瓶中剩余上相溶剂的体

23、积和流出液的体积：柱溶剂计算（Vwhole）：Vwhole=500-Vremianing-Voutflow(1)Vwhole分离柱的全容积（mL）Vremianing有刻度的烧瓶中剩余上相溶剂的容积（mL）Voutflow流出液的体积（mL）2、固定相保留率的测量分离柱充满上相溶剂后，让分离柱以850rmp速度顺时针旋转。同时，将流动相以2.0mL/min的流速泵入分离柱中。当流动相从出口端开始流出时，记录被流动相推出的上相溶剂的容积（Vpushed）；固定相保留率计算：固定相保留率=(Vwhole-Vpushed)/(Vwhole-Vsample loop)×100%（2）固定相的

24、保留率值应该大于40%3、 确认标准峰系统平衡后，通过进样阀装载样品。然后，用流动相以2.0mL/min洗脱直到标准峰出现。整个洗脱过程将被高度逆流色谱工作站记录下来。附录B经常清洗在正常使用一段时间后，管壁上会附着一些沉淀物。这些沉淀物会使样品受到污染，使管路堵塞甚至破裂。因此，为避免这些事情的发生，我们建议经常清洗。清洗分离柱的程序：a) 准备60mL0.5%NaOH溶液，并将其泵入分离柱中。停泵，并让分配柱在较低的速度（不超过300rmp）下旋转30min。然后，停止旋转，并用气体吹出管路中的NaOH溶液；b) 向分离柱中泵入100mL水（85），让分配柱在较低的速度（不超过300rmp

25、）下旋转30min以使管壁上残留的碱液排出柱子。然后，用气体将管路中的水慢慢吹出。c) 重复步骤b2-3次，使残留的NaOH溶液被完全排出。d) 向分离柱中泵入100mL丙酮（分析纯），并让分配柱在较低的速度（不超过300rmp）下旋转3-4min。当丙酮在柱子中均匀分布后，增加转速（不超过600rmp），并让其旋转30min。然后，停止旋转，并用气体将管路中的丙酮缓慢吹出。e) 向分离柱中泵入100mL甲醇（分析纯）。让分配柱在较低的速度（不超过300rmp）下旋转半个小时。然后，停止旋转，并将管路中的甲醇慢慢吹出。到此，整个清洗过程就完成了。警告：！在整个清洗过程中，泵的保护压力应该设为1MPa以避免管道因堵塞而破裂。！不能使用饱和碳酸氢钠溶液以防生成沉淀导致管路堵塞。！如果步骤3的清洗结果不好，重复步骤3一到两次直到管路中流出的液体澄清透明。！如果整个清洗程序不能达到理想结果，建议更换清洗剂（氯仿或者乙醇）。！设备正常使用情况下，建议每6个月对设备进行一次完全的清洗。！整个清洗过程产生的废液应该分别存放于不同的容器中。！每年更换一次连接管路（1440工作小时），每6个月