乙脑病毒E蛋白的原核表达、纯化及初步鉴定

1、乙脑病毒E蛋白的原核表达、纯化及初步鉴定 作者：高淑娴，张伟，任君萍，雷迎峰，丁天兵，宋建华，马文煜，徐志凯 【Abstract】 AIM: To construct gene encoding Japanese encephalitis virus (JEV) envelope glycoprotein and to express E protein in BL21(DE3). METHODS: Using RTPCR, the gene encoding E protein was amplified. The gene was cloned into pET28a(+) and the

2、 recombinant plasmid pET286HisE was transformed into BL21(DE3). The 6HisE protein expressed in BL21(ED3) was determined by SDSPAGE and Western Blotting. The expression product in inclusion body was purified by NiNTA chromatography. RESULTS: Sequencing of E gene revealed that the mutation rate was 0.

3、2(3/1500) and the base mutation didnt change the amino acid nonsense. The recombinant expression vector pET286HisE was constructed and the 6HisE protein was successfully expressed in an insoluble form. After expression and purification by metal chelate affinity chromatography, purified 6HisE fusion

4、protein was obtained. CONCLUSION: The E protein can be expressed in prokaryotic cell and would be useful for further research on the receptor of JEV and its infection mechanisms. 2 / 15【Keywords】 encephalitis virus, Japanese; viral envelope proteins; recombinant fusion proteins 【摘要】目的： 构建乙脑病毒（JEV）E蛋

5、白重组载体并在原核细胞BL21(DE3)中表达. 方法： 采用RTPCR扩增片段,定向克隆入pET28a(+)中；重组载体pET28a6HisE转化BL21(DE3),通过酶切、SDSPAGE和Western Blotting检测其载体构建和蛋白表达；表达产物包涵体经NiNTA亲和层析纯化. 结果： 构建得到原核融合重组载体pET28a6HisE；诱导后表达得到6HisE融合蛋白，纯化得到表达产物并进行了初步的鉴定. 结论： 表达并纯化得到JEV E蛋白原核表达产物. 【关键词】 脑炎病毒，日本；病毒包膜蛋白质类；重组融和蛋白质类 0引言 流行性乙型脑炎（Japanese encephalit

6、is, JE）简称乙脑，是由嗜神经的乙脑病毒（JEV）所致的中枢神经系统性传染病1. JEV属包膜病毒科黄病毒属，呈球型，直径2030 nm，核心含单股RNA，有衣壳，有三个结构蛋白，即E蛋白、核蛋白C和膜蛋白M. E蛋白为糖蛋白，包裹在病毒的表面，它决定着病毒的毒力及其宿主范围，不仅在与宿主细胞受体结合及随后的膜融合中发挥重要作用，而且可刺激产生中和抗体2. 我们对E蛋白进行了原核表达、纯化及鉴定，为进一步研究病毒的受体和病毒的感染机制提供了有利条件. 1材料和方法 1.1材料pET28a(+)表达载体和XL10, BL21(DE3)宿主菌为本试验室保存. P1，P2引物合成及序列测定由三博

7、远志生物技术有限责任公司完成；限制性内切酶、PMD18T，EXTaq聚合酶和连接试剂盒（宝航公司）；逆转录试剂盒（Invitrogen公司）；JEV鼠源性mAb和兔源多克隆抗体由本实验室制备；猴抗鼠红外标记二抗、羊抗兔红外标记二抗（Rockland公司）；红外成像系统（LICOR公司）；高速低温离心机（BECKMAN公司）；恒温摇床（上海智城公司）. 1.2方法 1.2.1片段的扩增及表达载体的构建用Trizol提取JEV RNA，以8 L RNA为模板,1 L P1为引物,1 L dNTP 65水浴5 min,冰浴1 min, 2 L 10×RT缓冲液,4 L 25 mmol/LM

8、gCl2,1 L RNaseout Recombinant Inhibitor, 42水浴2 min；加1 L superscriptTM混匀；42水浴50 s；70水浴15 min；加1 L RAaseH混匀；37水浴20 min；将得到的产物进行PCR扩增，5端引物：5CGCTCGAGTTAAGCATGCATTGGTCGCTAA3；3端引物：5CGGAATTCTTTAATCGTTGTCTGGGAATGGGCAATCGTGAC3. 反应条件为：94 5 min，94 50 s；55 1 min；72 1 min 30 s, 30个循环，72 15 min.10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析扩增产

9、物，回收目的片段. 将回收的PCR产物克隆入PMD18T载体中转化Ecoli E.XL10感受态细胞，EcoR和Xhol酶切鉴定，阳性克隆送公司测序；测序正确后，EcoR和Xhol双酶切PMD18TE质粒和表达载体pET28a,回收目的片段,连接；转Ecoli E.XL10感受态细胞；挑克隆；提取质粒；酶切鉴定载体构建. 阳性克隆质粒转化表达宿主菌BL21(DE3)；提取质粒；酶切鉴定；阳性克隆保留菌种. 1.2.2工程菌的诱导表达及可溶性分析用载体构建成功的菌种划抗性平板，挑取单克隆在37培养至A600 nm为0.40.6，加入100 mg/L IPTG诱导4 h. 1000 r/min,

10、4 10 min离心收菌. 弃上清后用PBS洗菌体，用去离子水重悬菌体. 加入2×SDS上样缓冲液进行样品处理. 另离心收集菌体，以溶液STE(50 mmol/L TrisCl (pH 8.0) ,1 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl)重悬菌体，超声破菌（间隔10 s,超声8 s,共15 min）. 分别收集上清和沉淀，上清用5×SDS上样缓冲液处理，沉淀用1×SDS上样缓冲液处理后彻底重悬. 取上述各样品做SDSPAGE用2.5 g/L考马斯R25溶液室温染色2 h后脱色. 1.2.3重组蛋白的鉴定同上取上清和沉淀样品分别进行处理并做SD

11、SPAGE，随后将电泳蛋白转移到NC膜上（转移缓冲液：甘氨酸39 mmol/L,Tris碱48 mmol/L,SDS 3.7 mg/L,甲醇200 ml/L），100 V转移80 min 后用25 mmol/L TBS平衡NC膜10 min,用0.5 g/L的脱脂奶4封闭5 h ，用TBS·T洗膜3次,10 min/次，1200稀释JEV鼠源性mAb，1100稀释JEV兔源性多抗，4孵育过夜，然后用TBS·T洗膜3次，10 min/次，再与12500稀释的猴抗鼠抗体和羊抗兔抗体分别孵育，4作用90 min后洗膜3次，10 min/次，然后进行扫描分析. 1.2.4重组蛋白的

12、纯化参照Qiagen公司镍离子亲和层析柱（NiNTA）操作说明进行. 离心收集500 mL诱导宿主菌，冰浴15 min；按5 mL/g湿菌的比例加入含8 mol/L尿素的缓冲液B(pH 8.0),室温下轻轻搅拌使细菌裂解至溶液清亮，4, 8563 g离心收集上清，弃去沉淀；将500 mL/L的NiNTA树脂悬浮液1 mL与一定量的清亮裂解上清于室温轻柔混匀（100 r/min摇动60 min）后，将混合液装柱；收集穿过峰，留小样进行SDSPAGE；然后用缓冲液W(20 mmol/L咪唑,pH 8.0)洗柱，再用缓冲液E(250 mmol/L咪唑,pH 8.0)洗脱，收集洗脱液. 取不同峰值样品

13、进行SDSPAGE分析. 2结果 2.1重组表达载体的构建阳性重组质粒酶切产物在大小约1500 bp处出现条带（图1），与预期大小相符. 序列测定结果有三个碱基突变（第30位碱基C突变为T，第705位碱基A突变为G，第1298位碱基T突变为A），皆为无意义突变. M: DL2000 DNA marker; 1: 空pET28a; 2: pET28aE双酶切产物. 图1pET28aE的酶切鉴定（略） 2.2融和蛋白E的表达与溶解形式的分析经SDSPAGE检测，在Mr约53 000处有明显的条带，与预期的6HisE融和蛋白大小一致. 融和蛋白主要以包涵体形体存在于沉淀中，但上清中也有少量的诱导表达

14、的融和蛋白. 薄层扫描显示其占菌体总蛋白的40%（图2）. M: 标准蛋白质marker; 1: 空pET28a未诱导细胞; 2: 空pET28a诱导细胞; 3: 重组载体pET28aE未秀导细胞; 4: 重组载体pET28aE诱导细胞; 5: 重组载体pET28aE诱导细胞裂解上清; 6: 重组载体pET28aE诱导细胞裂解沉淀. 图2E蛋白的表达及可溶性分析（略） 2.3融和蛋白E的大量表达及纯化利用NiNTA agarose 柱通过金属螯合亲和层析进行纯化，从大肠杆菌BL21(DE3)表达菌体的沉淀中变性、纯化得到6His E融合蛋白. 纯化的蛋白经PEG4000浓缩后经透析除去尿素，应

15、用紫外光吸收法定量分析表明获得蛋白的浓度约为0.759 g/L（图3）. 2.4E蛋白的Western Blotting用Odyssey扫描，在预期大小处可见清晰条带，提示纯化的E蛋白较好地保持了与抗JEV的多抗和单抗的结合活性（图4,5）. M: 标准蛋白质marker. 1: 空pET28a未诱导细胞; 2: 空pET28a诱导细胞; 3: 重组载体pET28aE诱导细胞裂解上清; 4: 重组载体pET28aE诱导细胞裂解沉淀; 59: 纯化的融和蛋白. 图36HisE蛋白的纯化（略） 1, 2: pET28aE诱导细胞; 3: pET28aE未诱导的细胞; 4: 空pET28a诱导的细胞

16、; 5: 空pET28a未诱导的细胞. 图4融合蛋白6HisE的JEV多抗Western Blotting鉴定（略） 1, 2: pET28aE诱导细胞; 3: pET28aE未诱导的细胞. 图5融和蛋白6HisE的JEV mAb Western Blotting分析（略） 3讨论 JEV与西尼罗病毒（West Nile virus, WNV）、登革病毒（Dengue virus, DV）同属黄病科黄病毒属成员3，其E蛋白有着与JEV E 蛋白有着相似的结构和功能，例如它们都有着三个结构域，即,2，4. 蛋白结构域主要承担着整个蛋白结构的形成；结构域包含一个融合环，推测其与病毒与宿主细胞的膜融

17、合有关；而结构域则被认为是病毒与宿主细胞受体结构的部位2，5. Chu等4用WNV E 蛋白结构域蛋白不仅能抑制WNV对C6/36细胞、Vero细胞的侵入，还能够抑制DV2对这两种细胞的入侵. 作为同属病毒它们有着很相似的结构和交叉的功能，但它们又有着种的特异性. 例如，研究已证明WNV E蛋白是三聚体，而不是像DV E 蛋白是二聚体，并且揭示和分析了WNV E蛋白的表位抗原位点3，揭示了DV2型E 蛋白晶体结构，明确了DV2 E 蛋白各区的功能4. 另外，已有报道用黄病毒科的其他病毒的E蛋白和E蛋白区蛋白成功的筛选到受体蛋白或受体复合物6-8. 目前JE仍然威胁着人类的健康，在亚洲国家每年仍

18、有JE 50 000例，其中有10 000例死亡9. 然而关于JEV的致病机制到目前为止仍不明确. JEV的E蛋白在病毒与敏感细胞结合过程中起着重要的作用，JEV敏感细胞表面有病毒的相应受体，但其性质和结构尚未明确. 由于E蛋白的真核表达糖基化过多，严重影响了E蛋白的生物学活性，我们力图用原核表达系统表达E蛋白，在多次尝试不同表达载体与宿主菌之后，成功的构建了E蛋白的原核表达载体. 对原核表达产物的可溶性分析结果表明，表达的E蛋白主要以包涵体的形式存在于菌体裂解后的沉淀中（占表达总量的95%左右）. 表达的E蛋白经纯化后用SDSPAGE和Western Blotting鉴定，结果表明其Mr大约

19、为53 000,与预期大小一致；表达的E蛋白均能与JEV的单抗和多抗结合，表明其具有较好的反应原性. 实验中观察到E蛋白与多抗的结合要强于与单抗的结合，分析其原因，可能是由于多抗所针对的抗原表位多，而单抗只针对单一抗原表位，因此蛋白与单抗的结合受到一定影响. 基金项目：国家自然科学基金（30400378） 【参考文献】 1 冯国和,窦晓光,王玉梅，等. 流行性乙型脑炎DNA 疫苗研究新进展J. 国外医学流行病学传染病学分册，2005,(32):368-370. 2 Lin CW, Wu SC. A functional epitope determinant on domain III of

20、the Japanese encephalitis virus envelope protein interacted with neutralizingantibody combining sites J. J Virol, 2003,77(4):2600-2606. 3 Kanai R, Kar K, Anthony K, et al. Crystal structure of West Nile virus envelope glycoprotein reveals viral surface epitopes J. J Virol, 2006,80(22):11000-11008. 4

21、 Chu JJ, Rajamanonmani R, Li J, et al. Inhibition of West Nile virus entry by using a recombinant domain from the envelope glycoprotein J. J Gen Virol. 2005;86(Pt 2):405-412. 5 Modis Y, Ogata S, Clements D, et al. A ligandbinding pocket in the dengue virus envelope glycoprotein J. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100(12):6986-6991. 6 ReyesDel Valle J, ChavezSalinas S, Medina F, et al. Heat shock protein 90 and heat shock protein 70 are component