基因克隆与表达的载体PPT学习教案

1、会计学1基因克隆与表达的载体基因克隆与表达的载体vectors第1页/共244页？vectors 本质？本质？第2页/共244页在基因工程操作中，把能携带外源在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体进入受体细胞复制、整合或表达的工具称为细胞复制、整合或表达的工具称为载体载体。载体的本质是载体的本质是DNA。经过人工。经过人工构建的载体，不但能与外源基构建的载体，不但能与外源基因相连，因相连，导入导入受体细胞，而且受体细胞，而且还能利用本身的调控系统使外还能利用本身的调控系统使外源基因在新的细胞中源基因在新的细胞中复制复制。第3页/共244页1. 运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效

2、转入受体细胞2. 为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力3. 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 Within the host cell the vector multiplies, producing numerous identical copies not only of itself but also of the gene that it carries. 第4页/共244页 （2）在宿主细胞内能独立复制。）在宿主细胞内能独立复制。 replicate independently in host cell（3）有一段多

3、克隆位点。）有一段多克隆位点。 Multiple cloning sites 外源外源DNA插入其中不影响载体的复制。插入其中不影响载体的复制。（4）有选择性标记。）有选择性标记。 selectable marker（5）分子量小，拷贝数多。）分子量小，拷贝数多。 Low molecules and multiple copies （6）容易从宿主细胞中分离纯化。）容易从宿主细胞中分离纯化。 Easy isolation and purification from host cells.（1）具有对受体的可转移性。）具有对受体的可转移性。transferable第5页/共244页复制位点复制位

4、点选择性标记选择性标记克隆位点克隆位点克隆载体克隆载体表达载体表达载体表达调控元件表达调控元件必必须须的的第6页/共244页 基因工程中常用的载体有基因工程中常用的载体有4类：类： 质粒（质粒（plasmid） 单链单链DNA噬菌体噬菌体M13 噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物 柯斯质粒（柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（动物病毒（virus） 第7页/共244页一、质粒（一、质粒（plasmid） 存在存在于多种宿主细胞中、于多种宿主细胞中、独立独立于染色体以外的可于染色体以外的可自主复自主复制制的的双链闭合环状双链闭合环状DNA分子。分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。存在于细菌、霉

5、菌、蓝藻、酵母等细胞中。第8页/共244页第9页/共244页质粒的命名规则质粒的命名规则 天然存在的质粒：其符号的第一个字天然存在的质粒：其符号的第一个字母要大写，并不用斜体字，书写时母要大写，并不用斜体字，书写时要用括号括起来，如（要用括号括起来，如（ColE1）。）。 重组质粒：通常是用小写重组质粒：通常是用小写p后加两个后加两个大写字母表示大写字母表示.第10页/共244页构建质粒的研究人员或构建质粒的研究人员或完成此项工作的研究机完成此项工作的研究机构构例如：pSC101 plasmid 质粒质粒质粒试验质粒试验研究类号研究类号Stanley Cohen第11页/共244页（1）分子小

6、：）分子小： 1-200 kb质粒质粒DNA仅占细胞染色体组一小部分，一般约仅占细胞染色体组一小部分，一般约1-3左右。左右。不同质粒不同质粒DNA的分子量差异相当显著，质粒的分子量差异相当显著，质粒DNA分子小的不足分子小的不足2 kb，大的可达，大的可达100 kb以上，以上，多数在多数在10 kb左右左右。最小的仅能编码。最小的仅能编码23种中等大小的蛋白质，两者之间相差竞达上百倍。种中等大小的蛋白质，两者之间相差竞达上百倍。第12页/共244页（2）编码基因少：）编码基因少： 2-3个中等大小的蛋白质。个中等大小的蛋白质。 （3）环状：）环状：双链环状双链环状DNA。如抗生素抗性等，赋

7、予细菌一些额外的特性。如抗生素抗性等，赋予细菌一些额外的特性。（非必须）（非必须）第13页/共244页 共价闭合环状共价闭合环状DNA（cccDNA)呈超螺旋（呈超螺旋（SC）（）（super coil）Covalent close circular DNA第14页/共244页 线形线形DNA （ linear ，lDNA）一条链上有一至数个缺口。一条链上有一至数个缺口。第15页/共244页同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：迁移率不同：scDNA最快、最快、l DNA次之、次之、ocDNA最慢。最慢。SCOCl DNA第16页/共244页（

8、1） 严紧型质粒（严紧型质粒（stringent plasmid）拷贝数少拷贝数少，只有，只有1-3个拷贝。个拷贝。（2） 松弛型质粒（松弛型质粒（relaxed plasmid）拷贝数多拷贝数多，一般，一般10个以上。个以上。（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。1. 复制复制p39质粒的拷贝数质粒的拷贝数 ：指在正常生长条件下，每个细菌细指在正常生长条件下，每个细菌细胞或每条染色体所对应的平均质粒数。胞或每条染色体所对应的平均质粒数。（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）第17页/共244页 2. 不相容性（不相容

9、性（incompatibility） 在没有选择压力的情况下，两种在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切亲缘关系密切的不的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存的现象。在同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存的现象。在细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥(稀稀释释)掉。这样的两种质粒称为不相容质粒。掉。这样的两种质粒称为不相容质粒。 前提条件：前提条件：只有在确实证明第二种质粒只有在确实证明第二种质粒B已经进入已经进入含有第一种质粒含有第一种质粒A的寄主细胞，而它的的寄主细胞，而它的DNA并不受寄主并不受寄主细胞限制体系的降解作用，但这两

10、种质粒却不能长期稳细胞限制体系的降解作用，但这两种质粒却不能长期稳定共存，在这种情况下，我们才能够说定共存，在这种情况下，我们才能够说A和和B是不亲和是不亲和的质粒。的质粒。第18页/共244页在大肠杆菌中的质粒，可以分为：在大肠杆菌中的质粒，可以分为： 3. 质粒的转移性质粒的转移性（1） 接合型质粒接合型质粒（2） 非接合型质粒非接合型质粒能自我转移能自我转移不能自我转移不能自我转移第19页/共244页如：如：F质粒（性质粒、或质粒（性质粒、或F因子）：因子）：甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。到原先不存在该质粒的受体

11、菌中。通过接合作用转移到新宿主内，又叫通过接合作用转移到新宿主内，又叫自我转移型质粒自我转移型质粒。分子量大，拷贝数少，宿主广，不符合基因工程的安全要求分子量大，拷贝数少，宿主广，不符合基因工程的安全要求除了带有自我除了带有自我复制复制所必需的遗传信息外所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌还带有一套控制细菌配对配对和质粒和质粒接合转移接合转移的基因的基因第20页/共244页第21页/共244页Donor cellRecipient cell Conjugative plasmidPilus 菌毛菌毛Plasmid transfer by conjugation between bacteria

12、l cells.第22页/共244页 R质粒（抗性质粒）质粒（抗性质粒）带有一种或数种带有一种或数种抗生素抗性基因抗生素抗性基因，使寄主获得同样，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（的抗生素抗性性状（resistance）。）。分子量小，拷贝数多，符合基因工程的安全要求分子量小，拷贝数多，符合基因工程的安全要求虽然带有自我虽然带有自我复制复制所必需的遗传信息，但失去了控所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒制细菌配对和质粒接合转移接合转移的基因，因此不能从一的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。个细胞转移到另一个细胞。第23页/共244页第24页/共244页带有控制带有控制大肠杆菌素（

13、大肠杆菌素（colicin）合成的基因合成的基因大肠杆菌素对不带大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。质粒的大肠杆菌有毒。第25页/共244页（1）如：分子量大，拷贝数低）如：分子量大，拷贝数低1、天然质粒的局限性、天然质粒的局限性第一个用于基因克隆的天然质粒第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长，分子长 9.1 kb。有一个有一个EcoR I酶切位点充当克隆位点酶切位点充当克隆位点，Tetr 作为筛选标志。作为筛选标志。第26页/共244页第27页/共244页ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin E1）可以通过插入失活筛选。但细菌群

14、体容易自可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗发突变出抗colicin E1的细胞的细胞.colicin E1能杀死不含能杀死不含ColE1 质粒的菌。质粒的菌。第28页/共244页（1） 具有复制起始位点（具有复制起始位点（ORI）（2）具有合适的选择标记基因）具有合适的选择标记基因（3）若干限制性内切酶的单一位点（）若干限制性内切酶的单一位点（MCS）是筛选的标志。理想的载体应该有两种选择标记基因是筛选的标志。理想的载体应该有两种选择标记基因用来插入外源用来插入外源DNA片断，且插入后不影响复制功片断，且插入后不影响复制功能能一般选择组装松弛型质粒复制起始位点。一般选择组装松弛型

15、质粒复制起始位点。第29页/共244页第30页/共244页（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数）具有较小的分子量和较高的拷贝数缩短长度缩短长度“轻装上阵轻装上阵”，大于，大于15 kb的质的质粒的转化率明显下降粒的转化率明显下降第31页/共244页氨苄青霉素抗性（氨苄青霉素抗性（Ampr） 卡那霉素抗性卡那霉素抗性 （Kanr） 四环素抗性四环素抗性 （Tetr） 链霉素抗性链霉素抗性 （Strr） 氯霉素抗性氯霉素抗性 （Cmlr）（1）选择标记）选择标记绝大多数质粒载体都是用抗生素抗性标记绝大多数质粒载体都是用抗生素抗性标记：第32页/共244页i）氨苄青霉素（）氨苄青霉素（Ampicil

16、lin，Amp）青霉素的衍生物。青霉素的衍生物。通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死杀死生长的细菌生长的细菌。a）抑菌原理）抑菌原理b）细菌抗性原理）细菌抗性原理Ampr基因编码基因编码 -内酰胺酶内酰胺酶，特异地切割，特异地切割氨苄青霉素的氨苄青霉素的 -内酰胺环。内酰胺环。 第33页/共244页通过与通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌生长的细菌。b）细菌抗性原理）细菌抗性原理Cmlr 编码编码乙酰转移酶乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙，特异地使氯霉素乙酰化

17、而失活。酰化而失活。a）抑菌原理）抑菌原理第34页/共244页通过与通过与30S核糖体亚基结合，导致核糖体亚基结合，导致mRNA错译。错译。通过于通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌生长的细菌。通过与通过与70S核糖体结合，导致核糖体结合，导致mRNA发生错读发生错读。第35页/共244页第36页/共244页第37页/共244页使受体菌发生遗传性状的改变的基因。使受体菌发生遗传性状的改变的基因。第38页/共244页第39页/共244页当带有当带有抗生素抗性基因抗生素抗性基因的的载体载体进入受体

18、菌后，进入受体菌后，受体菌才能生长。受体菌才能生长。不带有不带有抗生素抗性基因抗生素抗性基因的受体菌不能在含有抗的受体菌不能在含有抗生素的培养基（选择培养基）中生长。生素的培养基（选择培养基）中生长。活活死死抗性基因抗性基因抗生素抗生素第40页/共244页（1）高拷贝数的质粒载体）高拷贝数的质粒载体ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。派生质粒具有高拷贝数的特点。 而且在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合而且在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制，达到每个细成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝数胞的拷贝数1000-3000个！质粒

19、个！质粒DNA含量可达细胞含量可达细胞DNA总量的总量的40-50。适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。基因产物。第41页/共244页Plasmid amplification第42页/共244页 但有特殊用途但有特殊用途:由由pSC101派生来的载体，分子量小，拷贝数低。派生来的载体，分子量小，拷贝数低。当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。，就需要低拷贝的载体。pLG338、pLG339、p

20、HSG415等等不适合大量扩增不适合大量扩增DNA用。用。第43页/共244页这是一类这是一类温度敏感型复制控制温度敏感型复制控制质粒。质粒。温度低（低于温度低（低于37 oC），拷贝数很少；），拷贝数很少； 温度增加（温度增加（40 oC）时，拷贝数会很快增加到）时，拷贝数会很快增加到1000个以上。个以上。如如pBEU1、pBEU2。runaway plasmid vectors1979年年B. E. Uhlin等构建。等构建。第44页/共244页载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。因内部。如如pDF41、pDF42、pBR329。抗生素抗性

21、抗生素抗性外源外源DNA无抗生素抗性无抗生素抗性第45页/共244页如如pUR2、pTR262等。等。只有带有选择标记基因的转化菌细胞，才能只有带有选择标记基因的转化菌细胞，才能在选择培养基上生长。在选择培养基上生长。直接选择转化后的细胞。直接选择转化后的细胞。目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。Direct selection vectors第46页/共244页主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的基因如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的基因置于大肠杆菌的转录置于大肠杆菌的转

22、录-翻译信号控制之下。翻译信号控制之下。注意启动子的性质，终止子、起始密码注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。、终止密码的阅读正确。第47页/共244页复制起始点复制起始点ORI 选择标记选择标记 多克隆位点多克隆位点MCS2）大肠杆菌操纵子元件）大肠杆菌操纵子元件阻遏基因阻遏基因 I 操纵基因操纵基因O 启动基因启动基因P 核糖体结合位点序列（核糖体结合位点序列（SD） 转录终止信号区。转录终止信号区。1）普通克隆载体元件）普通克隆载体元件第48页/共244页 质粒载体的选择质粒载体的选择理想质粒载体应具备的条件理想质粒载体应具备的条件* *第49页/共244页1. pS

23、C101第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。（1）类型）类型天然质粒，属低拷贝型。天然质粒，属低拷贝型。（2）长度）长度9.09 kb（3）选择标记）选择标记四环素抗性四环素抗性Tetr第50页/共244页6个克隆位点：个克隆位点： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I 主要使用主要使用EcoR I。（其中（其中Hind III、BamH I、Sal I 3个位于、个位于、Tetr内部）内部）第51页/共244页（1）类型）类型天然质粒，属高拷贝型。天然质粒，属高拷贝型。（2）长度）长度6.3 kb

24、。（3）选择标记）选择标记特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每个细胞合成后，质粒仍然能复制达到每个细胞1000-3000拷贝之多！拷贝之多！大肠杆菌素（大肠杆菌素（colicin）E1和对和对E1免疫免疫的基因（的基因（immE1）第52页/共244页 colicin E1基因的结构基因的结构ceaimmkil结构基因结构基因免疫基因免疫基因溶菌基因溶菌基因 杀死不含有杀死不含有ColE1细菌的原因细菌的原因cea + kil基因产物基因产物 不被其他细菌的不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因所杀死的原因imm基

25、因基因第53页/共244页EcoR I位于位于E1内部，插入外源内部，插入外源DNA会导致会导致E1失活，使受体菌不能合成失活，使受体菌不能合成E1（ColE1-），但），但仍然表现出对仍然表现出对E1免疫型（免疫型（ImmE1+）。）。EcoR IColicin E1外源外源DNA无无Colicin第54页/共244页 用对外源用对外源colicin E1的免疫性和自身不能合成的免疫性和自身不能合成colicin E1作选择，操作非常繁杂。作选择，操作非常繁杂。 对对colicin E1敏感的细菌群体中自发突变产生敏感的细菌群体中自发突变产生抗抗colicin E1的频率很高！的频率很高！C

26、olE1抗抗 colicinE1杀杀ColE1-仍抗仍抗 colicinE1不杀不杀ColE1-插入片断插入片断ColE1第55页/共244页复制位点复制位点选择性标记选择性标记克隆位点克隆位点克隆载体克隆载体表达载体表达载体表达调控元件表达调控元件必必须须的的第56页/共244页严紧型：严紧型：松弛型：松弛型：拷贝数拷贝数是否转移是否转移接合型：接合型：非接合型：非接合型： 1-3个拷贝个拷贝10个以上个以上F质粒，不安全质粒，不安全 R 质粒，安全质粒，安全 Col质粒质粒第57页/共244页不相容性不相容性 在没有选择压力的情况下，两种在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切亲缘关系密切

27、的不的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存的现象。在同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存的现象。在细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥（稀细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不相容质粒。释）掉。这样的两种质粒称为不相容质粒。 如果在其寄主细胞中存在着一种接合型的质粒，非如果在其寄主细胞中存在着一种接合型的质粒，非接合型质粒也可以被转移。这种由共存的接合型质粒引接合型质粒也可以被转移。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫做质粒的迁移作用。发的非接合型质粒的转移过程，叫做质粒的迁移作用。质粒的迁移作用质粒的迁移作用第58页/共2

28、44页（1）高拷贝数的质粒载体：）高拷贝数的质粒载体： ColE1、pMB1温度低（低于温度低（低于37 oC），拷贝数很少；），拷贝数很少； 温度增加（温度增加（40 oC）时，拷贝数会很快增加到）时，拷贝数会很快增加到1000个以上。个以上。第59页/共244页（4） 插入失活型质粒载体插入失活型质粒载体抗生素抗性抗生素抗性外源外源DNA无抗生素抗性无抗生素抗性第60页/共244页第61页/共244页1. pSC101第62页/共244页2. ColE1（1）天然质粒，高拷贝，可氯霉素扩）天然质粒，高拷贝，可氯霉素扩增增（2）长度）长度6.3 kb。（3）选择标记：大肠杆菌素）选择标记：大

29、肠杆菌素E1 对对E1免疫的基因免疫的基因第63页/共244页pSP2124质粒的质粒的Ampr基因基因（1）元件来源）元件来源分子克隆之父分子克隆之父Boyer的两个博士后的两个博士后Bolivar和和Rodriguez构建构建 复制起点复制起点 ori来源于质粒来源于质粒pMB1系列，系列，高拷贝高拷贝型复制起点型复制起点 Ampr基因基因 Tetr基因基因pSC101的的Tetr 基因。基因。第64页/共244页（2）长度）长度4363bp（3）选择标记）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性。氨苄青霉素和四环素抗性。（4）克隆位点）克隆位点其中其中9个会导致个会导致Tetr基因失活（如基因失活

30、（如BamH I、Sal I）；）；3个会导致个会导致Ampr基因失活（基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。）。24个克隆位点。个克隆位点。第65页/共244页第66页/共244页 双抗生素抗性选择标记双抗生素抗性选择标记 没有获得载体的寄主细胞没有获得载体的寄主细胞 在在Amp或或Tet中中都都死亡。死亡。获得载体的寄主细胞获得载体的寄主细胞 在在Amp或或Tet其中之一其中之一中死亡。中死亡。插入失活，分两次先后选择：插入失活，分两次先后选择：第67页/共244页外源基因外源基因BamH IAmp中存活中存活但在但在Tet中死亡中死亡外源基因外源基因Pst ITet中存活中存活但

31、在但在Amp中死亡中死亡第68页/共244页氯霉素扩增之后，每个细胞可达氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000 copy，达细胞，达细胞DNA总量的总量的4050 安全安全失去了转移蛋白基因失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。不能通过接合转移。 分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大4361bp，载体越小越好。，载体越小越好。 10kb的的DNA在纯化过程中容易断裂。在纯化过程中容易断裂。第69页/共244页保留了转移蛋白（保留了转移蛋白（bom）的）的作用位点作用位点。 部分质粒虽不含部分质粒虽不含tra基因，但含有基因，但含有bom位点（位点（ori

32、T），当宿主细胞内同时含有），当宿主细胞内同时含有mob基因的辅助质基因的辅助质粒时，粒时， mob基因的产物可打开非接合质粒的基因的产物可打开非接合质粒的oriT位位点，借助于接合质粒点，借助于接合质粒tra基因的产物，使非接合质粒基因的产物，使非接合质粒被动迁移到受体细胞中，发生迁移作用。被动迁移到受体细胞中，发生迁移作用。第70页/共244页University of California的的J. Messing和和J. Vieria于于1978年，在年，在pBR322的基础上改造而的基础上改造而成。属于正选择载体。成。属于正选择载体。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11

33、、pUC18、pUC19第71页/共244页 复制起点复制起点pBR322的的 ori但其上失去了克隆位点。但其上失去了克隆位点。 Ampr 基因基因 lacZ的启动子的启动子大肠杆菌大肠杆菌 lacZ基因基因大肠杆菌大肠杆菌lacZ的的 -肽链序列，肽链序列， 是是lacZ 的的5末端片断，用于蓝白斑筛选。末端片断，用于蓝白斑筛选。pBR322的的Ampr基因基因第72页/共244页（2）长度）长度约约2686bp（3）克隆位点）克隆位点10个连续的单一限制酶切位点，个连续的单一限制酶切位点，位于位于lacZ基因的基因的5端。端。第73页/共244页第74页/共244页AAGCTTGCATG

34、CCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCGGGGTACCGAGCTCGAATTC53EcoRISacIKpnISmaIXmaIBamHIXbaISalIAccIHincIIPstISphIHindpUC19lacZGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT53EcoRI SacIKpnISmaIXmaIBamHIXbaISalIAccIHincIIPstISphIHindpUC18lacZ第75页/共244页Ampicillin 抗性抗性和和 lacZ的的 肽互补肽互补（蓝白斑）相结合。（蓝白斑）相结合。 X-

35、gal -半乳糖苷酶显色底物半乳糖苷酶显色底物（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactoside）（5-溴溴-4氯氯-3-吲哚葡萄糖苷）吲哚葡萄糖苷）第76页/共244页 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶能把无色的化合物能把无色的化合物X-gal分解成分解成半乳糖和一个半乳糖和一个深蓝色深蓝色的物质的物质5-溴溴-4-氯靛蓝。氯靛蓝。X-gal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶第77页/共244页1） -肽（肽（ lacZ ）：）： -半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。氨基酸）。lacZ只有在

36、只有在4聚体的状态下才有功能聚体的状态下才有功能.C端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aa4聚体聚体第78页/共244页受体菌基因组的受体菌基因组的 -半乳糖苷酶基因的氨基端半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失有缺失（缺失 肽），不能形成肽），不能形成4聚体的活聚体的活性酶，不能分解性酶，不能分解X-gal 受体菌株：受体菌株：JM系列系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a第79页/共244页pUC质粒载体上

37、的质粒载体上的lacZ 编码编码 肽与受体菌缺肽与受体菌缺失突变的失突变的 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶“互补互补”，形成，形成4聚体聚体，从而能分解，从而能分解X-gal，产生蓝色物质。，产生蓝色物质。C端大部分端大部分N端的端的11-41aapUC lacZ 受体菌受体菌lacZ第80页/共244页pUC载体上载体上LacZ的的5端有一段多克隆位点（端有一段多克隆位点（MCS）区，本身虽不干扰）区，本身虽不干扰LacZ的合成，但插入外源基的合成，但插入外源基因就会阻止因就会阻止LacZ的合成。不能互补。的合成。不能互补。 lacZ 5 3 肽移码突变肽移码突变lacZ 5 3 肽肽不互补不互补互

38、补互补MCS外源外源DNA第81页/共244页IPTG是乳糖的类似物。能诱导是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ 的的C端端部分部分和载体的和载体的lacZ 肽肽都表达。从而互补。都表达。从而互补。但载体但载体MCS上插入外源上插入外源DNA后，仍然不能后，仍然不能产生产生 肽！肽！IPTG第82页/共244页通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。插入。MCS无插入时，互补，蓝菌斑。无插入时，互补，蓝菌斑。 MCS有插入时，不互补，白菌斑。有插入时，不互补，白菌

39、斑。第83页/共244页第84页/共244页第85页/共244页 更小的分子量，更高的拷贝更小的分子量，更高的拷贝pUC18为为2686bp，500700拷贝。拷贝。 选择方便选择方便X-gal显色、抗生素双重直接选择。显色、抗生素双重直接选择。 克隆便利克隆便利具有多克隆位点（具有多克隆位点（MCS），使有两个不同粘性），使有两个不同粘性末端的外源末端的外源DNA方便地插入。方便地插入。 测序方便测序方便M13通用引物通用引物第86页/共244页pGEM-T vector第87页/共244页AATTT vectorPCR productT4 DNA ligaseAA第88页/共244页1.

40、丧失迁移功能的质粒载体丧失迁移功能的质粒载体pBR327在在pBR322的基础上去掉了的基础上去掉了1089bp的片段的片段（2）比）比pBR322有更高的拷贝，平均每个细胞中含有更高的拷贝，平均每个细胞中含有有30-45个拷贝。个拷贝。（1）删除）删除bom识别位点，即便在共存的识别位点，即便在共存的F质粒提供质粒提供转移装置的条件下，也不可能发生迁移作用。保证转移装置的条件下，也不可能发生迁移作用。保证了基因工程的安全性。了基因工程的安全性。第89页/共244页2. 能在体外转录克隆基因的质粒载体能在体外转录克隆基因的质粒载体pGEM-3Z由由pUC派生而来，主要区别是在派生而来，主要区别

41、是在MCS的两侧的两侧分别加了一个噬菌体分别加了一个噬菌体启动子启动子T7和和SP6。T7启动子启动子SP6启动子启动子MCSlacZ Amprori可被可被T7和和SP6的的RNA聚合酶识别转录。聚合酶识别转录。第90页/共244页 如果加入纯化的如果加入纯化的T7或或SP6 RNA聚合酶，在试聚合酶，在试管里就可以体外转录管里就可以体外转录mRNA 外源基因正接反接都可以转录。外源基因正接反接都可以转录。pGEM-4Z与与pGEM-3Z相同，只是相同，只是T7启动子和启动子和SP6启启动子的动子的位置互换位置互换。 MCS与与pUC18的完全一样。的完全一样。第91页/共244页（1）穿梭

42、质粒载体的结构）穿梭质粒载体的结构人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同类群的寄主中存活和复制的质粒载体。在两种不同类群的寄主中存活和复制的质粒载体。（shuttle plasmid vectors）第92页/共244页Yeast复制起点复制起点复制起点复制起点选择标记选择标记Yeast选择标记选择标记MCS大肠杆菌大肠杆菌 枯草杆菌穿梭载体枯草杆菌穿梭载体 大肠杆菌大肠杆菌 酿酒酵母穿梭载体酿酒酵母穿梭载体 大肠杆菌大肠杆菌 动物细胞穿梭载体动物细胞穿梭载体第93页/共244页第94页/共244页 也能利用其它细胞系统（酵母

43、、枯草杆菌、也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。哺乳动物细胞等）进行基因表达。 可以自如地在两种不同寄主细胞之间来可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。回转移基因。构建、克隆构建、克隆表达表达Animal cell 利用大肠杆菌进行基因克隆利用大肠杆菌进行基因克隆第95页/共244页1. 质粒稳定遗传必须的两个条件：质粒稳定遗传必须的两个条件：（1）每个世代、每个质粒至少要复制一次）每个世代、每个质粒至少要复制一次（2）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分配）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分配到两个子细胞中。到两个子细胞中。第96页/共244页有主动分配和随

44、机分配两种假说。有主动分配和随机分配两种假说。（1）主动分配）主动分配天然质粒。天然质粒。具有一个具有一个控制质粒拷贝分配控制质粒拷贝分配的功能区（的功能区（Par），能以主动分配的方式确保质粒能正确分配，能以主动分配的方式确保质粒能正确分配到两个子细胞中。到两个子细胞中。第97页/共244页人工构建的质粒载体人工构建的质粒载体缺失了缺失了par区区，只能以，只能以随机分配方式分到子细胞中。随机分配方式分到子细胞中。人工质粒人工质粒（一般情况下也能保证质粒的稳定遗传）（一般情况下也能保证质粒的稳定遗传）但在一定条件下会出现质粒丢失的现象但在一定条件下会出现质粒丢失的现象。第98页/共244页在

45、寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。（segregation instability）第99页/共244页（structural instability）寄主基因组的插入序列插入质粒、质粒间的同源寄主基因组的插入序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失。重组等都会使质粒发生插入或缺失。ISdimer重组重组第100页/共244页（1）新陈代谢负荷：）新陈代谢负荷：使寄主细胞生长减缓：使寄主细胞生长减缓：质粒载体使寄主的世代时间延长约质粒载体使寄主的世

46、代时间延长约15%。减缓的程度与质粒的分子量成正比。减缓的程度与质粒的分子量成正比。复制、转录和翻译负荷复制、转录和翻译负荷丢失质粒的细胞反而会成为优势群体！丢失质粒的细胞反而会成为优势群体！第101页/共244页不同细胞个体之间的质粒载体拷贝数的差不同细胞个体之间的质粒载体拷贝数的差异程度，称差度。异程度，称差度。低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定。低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定。差度（差度（variance）：）：是产生无质粒细胞的重要原因。是产生无质粒细胞的重要原因。高拷贝数的质粒载体差度大，拥有少量拷贝数的高拷贝数的质粒载体差度大，拥有少量拷贝数的菌体多，发生丢失的可能性大。菌体多，发

47、生丢失的可能性大。第102页/共244页质粒载体之间发生重组会形成二聚体、三聚体，甚至四聚质粒载体之间发生重组会形成二聚体、三聚体，甚至四聚体等所谓的质粒寡聚体，其稳定性比单体差。体等所谓的质粒寡聚体，其稳定性比单体差。含有大分子量插入片断的质粒载体普遍能形成质粒寡聚体含有大分子量插入片断的质粒载体普遍能形成质粒寡聚体。野生型野生型中，质粒在寄主的中，质粒在寄主的重组酶重组酶作用下会发生作用下会发生重组形成重组形成二聚体质粒二聚体质粒。二聚体灾难（二聚体灾难（dimer catastrophe）：）：重组的质粒二聚体一旦形成，便会以高出质粒单体分子两重组的质粒二聚体一旦形成，便会以高出质粒单体

48、分子两倍的速度进行复制，从而导致出现质粒寡聚体的克隆增殖倍的速度进行复制，从而导致出现质粒寡聚体的克隆增殖第103页/共244页第104页/共244页（1）丧失迁移功能的质粒载体：）丧失迁移功能的质粒载体： pBR327第105页/共244页（1）主动分配：）主动分配： 天然质粒天然质粒第106页/共244页（1）新陈代谢负荷）新陈代谢负荷差度（差度（variance）：）：二聚体灾难（二聚体灾难（dimer catastrophe）：）：低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定。高拷贝数的低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定。高拷贝数的质粒载体差度大，发生丢失的可能性大。质粒载体差度大，发生丢失的可能性

49、大。第107页/共244页噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异高效率高特异性性地地侵染侵染宿主细胞，然后或宿主细胞，然后或自主复制繁殖自主复制繁殖，或，或整合整合入宿入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状两种状态态还会还会相互转化相互转化。上述特性使得噬菌体或病毒的上述特性使得噬菌体或病毒的DNA能被开发成为基因能被开发成为基因工程的有用载体，因为：工程的有用载体，因为：1.高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞2.自主复制繁殖性能使外源基因在受体细

50、胞中高效扩自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增增第108页/共244页分为两种：分为两种：1. 溶菌周期：溶菌周期：感染细菌后，立即在菌体内复制和合成蛋白感染细菌后，立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。烈性噬菌体（烈性噬菌体（virulent phage)第109页/共244页第110页/共244页感染细菌后，将自己的感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染整合到细菌的染色体色体DNA中。形成这一过程称为中。形成这一过程称为溶源化溶源化。整合到细菌染色

51、体的噬菌体整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为称为原噬菌原噬菌体体，随细菌的染色体复制而复制。，随细菌的染色体复制而复制。温和噬菌体（温和噬菌体（temperate phage)原噬菌体（原噬菌体（prophage)：第111页/共244页第112页/共244页双链噬菌体载体双链噬菌体载体噬菌体噬菌体单链噬菌体载体单链噬菌体载体M13 cosmid克隆载体克隆载体第113页/共244页（1）长度为）长度为48 502 bp； （2）双链线性）双链线性DNA； （3）两端）两端5末端带有末端带有cos位点，可以环化。位点，可以环化。 DNA两端各有两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形的粘性末端，

52、粘性末端形成的双链区域称为成的双链区域称为cos位点。位点。1. DNA分子的特点分子的特点cos位点（位点（cohensive-end site）：）：第114页/共244页 DNA进入菌体后，形成双链环状进入菌体后，形成双链环状DNA复制型（复制型（RF DNA）第115页/共244页 DNA上有至少上有至少61个基因，有一半是必需的，与个基因，有一半是必需的，与自身的活动有关，功能相近的成簇排列。自身的活动有关，功能相近的成簇排列。 噬菌体生长的噬菌体生长的非必需基因，非必需基因，约占约占1/3，位于尾部合，位于尾部合成至阻遏之间的区段（成至阻遏之间的区段（J-N基因），为可替换区。基因

53、），为可替换区。第116页/共244页第117页/共244页（1） 噬菌体是一种温和噬菌体。噬菌体是一种温和噬菌体。对大肠杆菌具有很高的感对大肠杆菌具有很高的感染能力，以原噬菌体的形式长期潜伏在溶原细胞中染能力，以原噬菌体的形式长期潜伏在溶原细胞中，容易保存。并且在一定条件下又可转入溶菌生长，容易保存。并且在一定条件下又可转入溶菌生长途径，进行大量增殖。途径，进行大量增殖。（2）能承载比较大的外源）能承载比较大的外源DNA片断。片断。野生型野生型 噬菌体头部容噬菌体头部容许包装许包装 DNA分子大小分子大小75%105%的的DNA片断，约片断，约36.451kb.而且而且 DNA上约有上约有2

54、0kb的区域对的区域对 噬菌体噬菌体的生长不是绝对需要的，可以缺失或被外源的生长不是绝对需要的，可以缺失或被外源DNA取取代。代。（3） DNA分子上分子上有多种限制性内切酶位点。有多种限制性内切酶位点。第118页/共244页（1）基因组太大（）基因组太大（48 502bp）；）；（2）酶切点太多，它有）酶切点太多，它有5个个BamH位点，位点，6个个Bg位点，位点，5个个EcoR位点。位点。（3 3）野生型只能接纳一定长度的）野生型只能接纳一定长度的DNA。相当于。相当于噬菌体的噬菌体的75-105%，那么能接纳，那么能接纳DNADNA最大为最大为： 49kb 噬菌体的缺陷：噬菌体的缺陷：第

55、119页/共244页 去除非必需区，建立克隆或替换位点去除非必需区，建立克隆或替换位点 非必需区内插入选择标记基因非必需区内插入选择标记基因 突变某些基因，使它成为安全载体突变某些基因，使它成为安全载体 删除删除 DNA必须区段上常用的限制酶切点必须区段上常用的限制酶切点 本身有本身有5个个 EcoR I 和和7 个个Hind III切点！切点！（1）构建过程）构建过程第120页/共244页两种类型：两种类型：插入型插入型: :噬菌体非必需区两侧有一对限制噬菌体非必需区两侧有一对限制性酶切位点，可被外源性酶切位点，可被外源DNADNA置换的载置换的载体，称为置换型载体。体，称为置换型载体。只含

56、一个限制性位点可供插入外源只含一个限制性位点可供插入外源DNADNA的载体，这类的载体，这类噬菌体载体称插噬菌体载体称插入型载体。入型载体。第121页/共244页 插入型载体（插入型载体（insertion vectors)只具有一个可供外源只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点，也有一些有两个插入的克隆位点，也有一些有两个位点，但彼此靠近。广泛用于位点，但彼此靠近。广泛用于cDNA及小片段及小片段DNA的克隆。的克隆。插入位点位于合成活性阻遏物区域（插入位点位于合成活性阻遏物区域（cI基因基因）内）内cI基因表达，使基因表达，使 噬菌体进入溶源状态。噬菌体进入溶源状态。EcoR I gt10

57、（43 340 bp）第122页/共244页插入插入导致导致cI基因失活，基因失活，载体载体DNA不能进入溶源期不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成，受体菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。清晰的噬菌斑。 没有外源没有外源DNA插入的插入的 载体感染受体菌形成载体感染受体菌形成混浊噬混浊噬菌斑菌斑。如如 NM1149载体的两个克隆位点（载体的两个克隆位点（EcoR I 和和Hind III）都是位于）都是位于cI基因内部。基因内部。第123页/共244页 gt10基因组中引入了基因组中引入了LacZ序列。序列。感染感染LacZ突变的大肠杆菌，经突变的大肠杆菌，经IPTG的诱导，利的诱导，利用用X-g

58、al的显色反应的显色反应作选择标记。作选择标记。EcoR ICharon16A第124页/共244页可可克隆较大的克隆较大的DNA片段（片段（923kb），构建基因组文库），构建基因组文库两个两个MCS，反向重复位于非必需区两端，反向重复位于非必需区两端用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源成的外源DNA片断置换。片断置换。选择标记选择标记：可取代片断中如果包含：可取代片断中如果包含LacZ，可用，可用Xgal显色显色作筛选标记。作筛选标记。 可置换区可置换区MCSMCS左左 臂臂右右 臂臂包 装 蛋包 装 蛋白白溶 源 循溶 源

59、循环环裂 解 生裂 解 生长长第125页/共244页 EMBL4的可置换片断内部还有的可置换片断内部还有Sal I酶切位点。酶切位点。以便于进一步消化中间片断，防止自我连接。以便于进一步消化中间片断，防止自我连接。左臂左臂可置换区可置换区右臂右臂EcoR I BamH I Sal ISal I BamH I EcoR ISal I Sal I EMBL4第126页/共244页Charon40的可置换片断是由的可置换片断是由DNA短片重复构成，短片重复构成，片断之间有片断之间有Hae I 切点切点。在克隆的时候，可以用在克隆的时候，可以用Hae I 酶进一步将可置换片断切成酶进一步将可置换片断切

60、成小片断，以防止重新与载体连接。小片断，以防止重新与载体连接。左臂左臂可置换区可置换区右臂右臂MCSMCSCharon40Hae I第127页/共244页置换型载体置换型载体第128页/共244页 DNA象质粒载体那样直接转化细菌时效率远象质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低。比质粒低。必须利用噬菌体外壳的作用必须利用噬菌体外壳的作用 转导转导在试管中与在试管中与 噬菌体的噬菌体的头部头部和和尾部尾部蛋白人工装蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组组DNA注入受体菌中。注入受体菌中。（1）体外包装：）体外包装：第129页/共244页第1