第3章 蛋白质的共价结构

1、一、蛋白质一级结构的测定一、蛋白质一级结构的测定什么是什么是PrPr的一级结构？的一级结构？蛋白质中氨基酸的排列顺序。1.定义 19691969年，国际纯化学与应用化学委员年，国际纯化学与应用化学委员会（会（IUPACIUPAC） 规定：规定： 蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连中蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连中AAAA的的排列顺序，包括二硫键的位置。排列顺序，包括二硫键的位置。 2.2.一级结构的意义一级结构的意义u自1953年英国剑桥大学Sanger F，报告了牛胰岛素两条多肽链的氨基酸序列以来，至今已知约100 000个不同蛋白质的氨基酸序列，其中相当一部分序列是应用Sanger首先确立的原

2、理测定得到的。u但现在大多数是根据编码蛋自质的基因核苷酸序列推导出来的。 3.蛋白质一级结构的测定 蛋白质一级结构测定是研究蛋白质其他蛋白质一级结构测定是研究蛋白质其他层次的结构和蛋白质功能的基础测定层次的结构和蛋白质功能的基础测定蛋白质一级结构的方法蛋白质一级结构的方法 有直接测定法和间接测定法。有直接测定法和间接测定法。1 1间接测定法间接测定法是先得到某一种蛋白质基因的核苷酸序是先得到某一种蛋白质基因的核苷酸序列，然后根据通用的遗传密码表间接推列，然后根据通用的遗传密码表间接推导出由其决定的氨基酸序列。导出由其决定的氨基酸序列。原核生物：原核生物：可先直接从它的基因组可先直接从它的基因组

3、DNADNA中得到目标蛋白的基因，然后测定基因中得到目标蛋白的基因，然后测定基因的碱基序列，找出可读框的碱基序列，找出可读框(ORF)(ORF)，最后，最后根据遗传密码反推出氨基酸序列；根据遗传密码反推出氨基酸序列；真核生物：真核生物：可以先得到目标蛋白的可以先得到目标蛋白的cDNAcDNA，然后测定，然后测定cDNAcDNA的碱基序列，找的碱基序列，找出出ORFORF，最后同样根据遗传密码反推出，最后同样根据遗传密码反推出氨基酸序列。氨基酸序列。间接测定法的优点：间接测定法的优点：快速，不需要纯化快速，不需要纯化蛋白质，与直接测定多肽链的氨基酸序蛋白质，与直接测定多肽链的氨基酸序列相比，测定

4、列相比，测定DNADNA的碱基序列要容易得的碱基序列要容易得多。多。间接测定法缺点：间接测定法缺点：无法确定经后加工的无法确定经后加工的蛋白质的最终序列，无法确定修饰的氨蛋白质的最终序列，无法确定修饰的氨基酸，也得不到任何二硫键的信息。基酸，也得不到任何二硫键的信息。问接测定法对问接测定法对含量低、不容易纯化含量低、不容易纯化的蛋的蛋白质很有用。许多难以纯化的膜内在蛋白质很有用。许多难以纯化的膜内在蛋白都是这种方法最先得到它们的一级结白都是这种方法最先得到它们的一级结构的。构的。另外，对于一些另外，对于一些未知的蛋白质未知的蛋白质，间接测间接测定法也很有用。定法也很有用。 1.1.样品必需纯（

5、样品必需纯（97%97%以上）以上） 2.2.知道蛋白质的分子量知道蛋白质的分子量 3.3.知道蛋白质由几个亚基组成知道蛋白质由几个亚基组成 4.4.测定蛋白质的测定蛋白质的AAAA组成并根据分子量组成并根据分子量 计算每种计算每种AAAA的个数的个数 5.5.测定水解液中的氨量计算酰胺的含量测定水解液中的氨量计算酰胺的含量前提前提2 2直接测定法直接测定法 测定一级结构的基本原理和方法 基本策略：基本策略：氨基酸顺序直测法片段重叠法氨基酸顺序直测法片段重叠法 基本步骤：基本步骤：( (1)1)测定末端氨基酸数目测定末端氨基酸数目 ( (2)2)拆分蛋白质分子的多肽链拆分蛋白质分子的多肽链 (

6、 (3)3)断开多肽链内二硫键并分离出每条肽链断开多肽链内二硫键并分离出每条肽链 ( (4)4)测定每条多肽链的氨基酸组成测定每条多肽链的氨基酸组成( (5)5)鉴定多肽链鉴定多肽链N N末端、末端、C C末端氨基酸残基末端氨基酸残基 ( (6)6)至少用两种方法将多肽链水解成较小的片段至少用两种方法将多肽链水解成较小的片段 ( (7)7)分离并测定各肽段的氨基酸序列分离并测定各肽段的氨基酸序列 (8)(8)片段重叠法重建完整多肽链一级结构片段重叠法重建完整多肽链一级结构 (9)(9)确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置 将肽段顺序进行叠联以确定完整

7、的顺序将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序 将肽段分离并测出顺序将肽段分离并测出顺序专一性裂解专一性裂解末端氨基酸测定末端氨基酸测定二硫键拆开二硫键拆开纯蛋白质纯蛋白质蛋白质顺序测定蛋白质顺序测定基本方法路线基本方法路线（一）、蛋白质测序策略（一）、蛋白质测序策略(1) 测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。链的数目。（一）、蛋白质测序策略（一）、蛋白质测序策略(2)(2) 多肽链的拆分多肽链的拆分（一）、蛋白质测序策略（一）、蛋白

8、质测序策略 几条多肽链借助几条多肽链借助非共价键非共价键连接在一起，连接在一起，称为寡聚蛋白质，血红蛋白为四聚体，称为寡聚蛋白质，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体。烯醇化酶为二聚体。 可用可用8mol/L8mol/L尿素或尿素或6 6mol/Lmol/L盐酸胍处理，盐酸胍处理，即可分开多肽链即可分开多肽链( (亚基亚基) )。（一）、蛋白质测序策略（一）、蛋白质测序策略(3)(3) 断开二硫键断开二硫键 在在8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L盐酸胍存在下，盐酸胍存在下，用过量的用过量的 - -巯基乙醇巯基乙醇处理，使二硫键还处理，使二硫键还原为巯基，然后用原为巯基，

9、然后用烷基化试剂保护烷基化试剂保护生成生成的巯基，防止重新被氧化。的巯基，防止重新被氧化。（一）、蛋白质测序策略（一）、蛋白质测序策略(4)(4)测定每条多肽链的测定每条多肽链的AAAA组成，并计算组成，并计算出出AAAA成分的分子比成分的分子比 （一）、蛋白质测序策略（一）、蛋白质测序策略( (5 5) )分析多肽链的分析多肽链的N-N-末端和末端和C-C-末端末端( (6 6) )多肽链断裂成多个肽段多肽链断裂成多个肽段 采用两采用两/ /多种多种不同的断裂方法不同的断裂方法将多肽将多肽 断裂成两套或多套肽段，并将其分离。断裂成两套或多套肽段，并将其分离。（一）、蛋白质测序策略（一）、蛋白

10、质测序策略( (7 7) )测定每个肽段的氨基酸顺序测定每个肽段的氨基酸顺序(8)(8)确定肽段在多肽链中的次序确定肽段在多肽链中的次序 利用两利用两/ /多套肽段的多套肽段的AAAA顺序彼此间的顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的交错重叠，拼凑出整条多肽链的AAAA顺序。顺序。（一）、蛋白质测序策略（一）、蛋白质测序策略(9)(9)确定原多肽链中二硫键的位置。确定原多肽链中二硫键的位置。 两类多肽链末端氨基酸残基：两类多肽链末端氨基酸残基： N-N-端氨基酸端氨基酸 C-C-端氨基酸端氨基酸 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-N-端氨基酸分析法。端氨

11、基酸分析法。（二）、末端氨基酸残基测定（二）、末端氨基酸残基测定 Sanger法法 二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）法）法O2NFNO2+ H2N CH CROHN CH CROO2NNO2H+H2OO2NNO2HN CH CROOH+氨基酸氨基酸DNFBN-端氨基酸端氨基酸DNP衍生物衍生物DNP-氨基酸氨基酸（二）、末端氨基酸残基的鉴定（二）、末端氨基酸残基的鉴定N碱性条件碱性条件二硝基苯衍生物二硝基苯衍生物黄色黄色 二甲氨基萘磺酰二甲氨基萘磺酰-AA-AA有强荧光，检测灵敏度高有强荧光，检测灵敏度高 丹磺酰氯（丹磺酰氯（DNSDNS）法）法N(CH3)2SO2ClH2NCHCR

12、OHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸（二）、末端氨基酸残基的鉴定（二）、末端氨基酸残基的鉴定1N(DNS-aa)苯异硫氰酸酯（苯异硫氰酸酯（PITC)PITC)法法（二）、末端氨基酸残基的鉴定（二）、末端氨基酸残基的鉴定1NN=C=S + NCHCOOHHHRPITCNCNCHCOOHHHRSPTC-氨基酸NCHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3无水HF苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯PITC 肽链外切酶肽链外切酶: :从多肽链从多肽链N-N-端逐个向里水解端逐个向里水解 根据不同反应时间测出释放的根

13、据不同反应时间测出释放的AAAA种类和数量，种类和数量， 按反应时间和按反应时间和AAAA残基释放量作动力学曲线残基释放量作动力学曲线 蛋白质蛋白质N-N-末端残基顺序。末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶 水解以水解以LeuLeu残基为残基为N-N-末端的肽键速度最大。末端的肽键速度最大。氨肽酶法氨肽酶法（二）、末端氨基酸残基的鉴定（二）、末端氨基酸残基的鉴定1N 肼化物可与苯甲醛缩合成不溶于水的物质肼化物可与苯甲醛缩合成不溶于水的物质 肼解法肼解法H2NCHCROHNCH CROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH

14、2NCHCRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸（二）、末端氨基酸残基的鉴定（二）、末端氨基酸残基的鉴定2C（二）、末端氨基酸残基的鉴定（二）、末端氨基酸残基的鉴定2C C末端末端AA AA 氨基醇氨基醇 还原法还原法硼氢化锂硼氢化锂 肽链外切酶肽链外切酶: :从多肽链从多肽链C-C-端逐个水解端逐个水解 根据不同反应时间释放出的根据不同反应时间释放出的AAAA种类和数量种类和数量 蛋白质蛋白质C-C-末端残基顺序。末端残基顺序。 四种羧肽酶：四种羧肽酶：A,B,CA,B,C和和Y Y； A A和和B(B(胰脏胰脏) )、C(C(柑桔叶柑桔叶) )、Y(Y(面包酵母面包酵母)

15、) A:A:除除Pro/Arg/Lys/Pro/Arg/Lys/外所有外所有C-C-末端末端AAAA残基残基 B:B:只水解只水解ArgArg和和LysLys为为C-C-末端残基的肽键末端残基的肽键 羧肽酶法羧肽酶法（二）、末端氨基酸残基的鉴定（二）、末端氨基酸残基的鉴定2C（三）、二硫键的断裂（三）、二硫键的断裂 盐酸胍盐酸胍/ /尿素解离多肽链间的非共价力。尿素解离多肽链间的非共价力。 应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。链间的二硫键。1 1、酸水解、酸水解（四）、氨基酸组成的分析（四）、氨基酸组成的分析2 2、碱水解、碱水解1 1、酶解法

16、酶解法: : 内切酶：内切酶：胰蛋白酶胰蛋白酶、糜蛋白酶、糜蛋白酶、 胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶 外切酶：羧肽酶和氨肽酶外切酶：羧肽酶和氨肽酶多肽链的选择性降解多肽链的选择性降解 （五）、多肽链的部分裂解和（五）、多肽链的部分裂解和 肽段混合物的分离纯化肽段混合物的分离纯化 R1=Lys（K）和）和Arg（R） 专一性较强，水解速度快专一性较强，水解速度快 R2=Pro（抑制）（抑制）NH CH COR4NH CH COR3NH CH COR2NH CH COR1肽链肽链水解位点水解位点胰蛋白酶胰蛋白酶trypsin R1=Phe（F）、）、 Trp（W）Tyr（Y）等疏水性

17、）等疏水性AA Leu、Met和和His稍慢稍慢 R2=Pro（抑制）（抑制） pH8-9NH CH COR4NH CH COR3NH CH COR2NH CH COR1肽链肽链水解位点水解位点糜蛋白酶糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）水解速度与相邻水解速度与相邻AAAA性质有关性质有关: : 酸性：酸性：-/-/碱性：碱性：+ + R2=Phe（F）、）、 Trp（W）、）、 Tyr（Y）、）、Leu（L）、）、Ile（I）、）、Met（M）、）、Val（V）及其它）及其它疏水性强的疏水性强的AA水解速度较快水解速度较快NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHC

18、OR2NHCHCOR1肽链肽链水解位点水解位点R2= Pro或或Gly，不水解，不水解R1或或R3=Pro，抑制水解，抑制水解嗜热菌蛋白酶嗜热菌蛋白酶（thermolysin) R1和和/或或R2Phe（F）、）、Trp（W）、）、Tyr（Y）、）、 Leu（L）及其它疏水性）及其它疏水性AA水解速度较快水解速度较快 R1=Pro（抑制）（抑制） pH2NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链肽链水解位点水解位点胃蛋白酶胃蛋白酶PepsinNHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链肽链水解位点水解位点羧肽酶和氨肽酶羧肽酶和氨肽酶2 2、化学

19、裂解法、化学裂解法 溴化氰水解法溴化氰水解法(Cyanogen bromide)选择性地切割由选择性地切割由MetMet羧基形成的肽键。羧基形成的肽键。CH3S：CH2CH2CHNHCNHCHCOOR+BrC+NBr-CH3S+CH2CH2CHNHCNHCHCOORCNCH3SCN CH2CHNHCNHCHCOORCH2+H2O+CH2CHNHCOCH2OH3N+CHCOR高丝氨酸内酯（五）、多肽链的部分裂解和（五）、多肽链的部分裂解和 肽段混合物的分离纯化肽段混合物的分离纯化多肽链的选择性降解多肽链的选择性降解 NH2OH断裂：断裂： 较专一性断裂较专一性断裂Asn-Gly之间的肽键之间的肽

20、键 Asn-Leu及及Asn-Ala键也能部分断裂键也能部分断裂 3 3、肽段的分离纯化：、肽段的分离纯化： 凝胶过滤、凝胶电泳和凝胶过滤、凝胶电泳和HPLCHPLC法法N-N-端分析法端分析法特点：能够不断重复循环，将肽链特点：能够不断重复循环，将肽链N-N-端端氨基酸残基逐一进行标记和解离。氨基酸残基逐一进行标记和解离。1 1、 （六）、肽段氨基酸序列的测定（六）、肽段氨基酸序列的测定Edman于于1950年首先提出。年首先提出。PITCPTC-肽肽2 2、氨肽酶法或羧肽酶法、氨肽酶法或羧肽酶法3 3、质谱法（、质谱法（MSMS） 灵敏度高、所需样品少、测定速度快灵敏度高、所需样品少、测定

21、速度快核糖体核糖体蛋白质链蛋白质链4.4.根据核苷酸序列的推定法根据核苷酸序列的推定法（七）、肽段在多肽链中次序的决定重叠肽（重叠肽（overlaping peptide）所得资料所得资料： 氨基末端残基氨基末端残基 H 羧基末端残基羧基末端残基 S 第一套肽段第一套肽段 第二套肽段第二套肽段 OUS SEO PS WTOU EOVE VERL RLA APS HOWT HO末端残基末端残基 H S末端肽段末端肽段 HOWT APS第一套肽段第一套肽段 HOWT OUS EOVE RLA PS第二套肽段第二套肽段 HO WTOU SEO VERL APS 推断全顺序推断全顺序 HOWTOUSE

22、O VERLAPS借助重叠法确定肽段次序： 胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链 经电泳分离各肽段经电泳分离各肽段 用过甲酸断开二硫键，含有用过甲酸断开二硫键，含有-S-S-的肽段带电性的肽段带电性质发生变化，转向质发生变化，转向90二次电泳，曾含二硫键二次电泳，曾含二硫键的肽段迁移率发生变化的肽段迁移率发生变化 然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置硫键的位置（八）、二硫键位置的确定（八）、二硫键位置的确定胃蛋白酶胃蛋白酶 最适最适pHpH约约2 2，此时二硫键不断开，此时二硫键不断开 专一性低、肽段短专一性

23、低、肽段短H2N-CH-COOH CH2 S S CH2H2N-CH-COOH6HCOOOHH2N-CH-COOH CH2 SO3H H2N-CH-COOH CH2 SH2R-SH+6HCOOHR-S-S-R对角线电泳对角线电泳：把水解的混合肽段点到滤纸中央，在把水解的混合肽段点到滤纸中央，在pH6.5的条的条件下，进行第一向电泳，肽段将按其大小及电荷件下，进行第一向电泳，肽段将按其大小及电荷的不同分离开来。的不同分离开来。然后把滤纸暴露在然后把滤纸暴露在过甲酸蒸气中过甲酸蒸气中，使，使-S-S-断裂。断裂。这时每个含二硫键的肽段被氧化这时每个含二硫键的肽段被氧化成成一对含半胱氨磺酸的肽一对含

24、半胱氨磺酸的肽。+ +- -+ +- -第二向第二向第一向第一向a ab b 滤纸旋转滤纸旋转9090度角在与第一向完全相同的条件下进度角在与第一向完全相同的条件下进行第二向电泳。行第二向电泳。在这里，大多数肽段的迁移率未在这里，大多数肽段的迁移率未变，并将位于滤纸的一条对角线上，而含半胱氨变，并将位于滤纸的一条对角线上，而含半胱氨磺酸的肽段比原来含二硫键的肽小而负电荷增加，磺酸的肽段比原来含二硫键的肽小而负电荷增加，结果它们都偏离了对角线。结果它们都偏离了对角线。 肽斑可用茚三酮显色确定肽斑可用茚三酮显色确定+ +- -+ +- -第二向第二向第一向第一向a ab b+ +- -+ +- -第二向第二向第一向第一向a ab bBrownBrown和和HartlayHartlay对角线电泳图解对角线电泳图解pH6.5pH6.5图中图中a a、b b两个斑点是两个斑点是由一个二硫键断裂由一个二硫键断裂产生的肽段产生的肽段二硫键位置的确定二硫键位置的确定（九）、蛋白质测序举例（十）蛋白质序列数据库（十）