第二章生物工业菌种

1、工业生产常用的微生物及要求工业生产常用的微生物及要求l一、工业生产常用的微生物一、工业生产常用的微生物l细菌（细菌（bacteria）：常用的有枯草芽）：常用的有枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。菌等。l酵母菌（酵母菌（yeast）：属单细胞真核生）：属单细胞真核生物，主要分布于含糖较多的酸性环境物，主要分布于含糖较多的酸性环境中。常用的有：啤酒酵母、假丝酵母、中。常用的有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。类酵母等。啤酒酵母啤酒酵母棒状杆菌棒状杆菌短杆菌短杆菌 棒状杆菌棒状杆菌yeastsl霉菌（霉菌（mould）：喜偏酸性环境。可）：喜偏酸性环境。可用

2、于生产多种酶制剂、抗生素、有机用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。酸及甾体激素等。l放线菌（放线菌（actionmycetes）：原核微）：原核微生物类群。在含有机质丰富的微碱性生物类群。在含有机质丰富的微碱性土壤中分布较为广泛。主要用于生产土壤中分布较为广泛。主要用于生产多种抗生素多种抗生素放线菌放线菌l担子菌（担子菌（basidiomycetes）：主要）：主要用于多糖、橡胶物质和抗癌药物的开用于多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。发。l藻类（藻类（alga）：许多国家已把它作为）：许多国家已把它作为人类保健食品和饲料。还可通过藻类人类保健食品和饲料。还可通过藻类将将CO2转变为石

3、油；国外还有从转变为石油；国外还有从“藻藻类农场类农场”获得氢能的报道。获得氢能的报道。硅藻硅藻担子菌担子菌二、微生物工业对菌种的要求：二、微生物工业对菌种的要求：原料廉价、生长迅速、目的产物产量原料廉价、生长迅速、目的产物产量高。高。易于控制、酶活性高、发酵周期较短。易于控制、酶活性高、发酵周期较短。抗杂菌和噬菌体能力强抗杂菌和噬菌体能力强菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒不产生任何有害的生物活性物质和毒素素G微生物菌种的衰退微生物菌种的衰退A菌种的复壮菌种的复壮B菌种的保藏菌种的保藏工业微生物菌种的工业微生物菌种的 衰退、复

4、壮与保藏衰退、复壮与保藏l一、菌种的衰退：一、菌种的衰退：微生物个体特征微生物个体特征微生物群体特征微生物群体特征各方面各方面发生变化发生变化营养物质代谢营养物质代谢和生长繁殖能和生长繁殖能力下降力下降发酵周发酵周期延长期延长抗不良抗不良环境的环境的性能减性能减弱弱目的产物目的产物的产量下的产量下降降l菌种衰退的原因菌种衰退的原因l菌种性能的改变菌种性能的改变l防止菌种衰退的措施防止菌种衰退的措施菌种衰退的原因菌种衰退的原因菌种保藏不当菌种保藏不当提供不了当的条件或不利的条件提供不了当的条件或不利的条件经诱变得到的新菌株发生回复突变经诱变得到的新菌株发生回复突变l菌种保藏的基本原理是将微生物菌

5、种菌种保藏的基本原理是将微生物菌种保存在不利于微生物活跃生长和代谢的保存在不利于微生物活跃生长和代谢的不良环境中，如不良环境中，如低温、干燥、缺氧、黑低温、干燥、缺氧、黑暗营养饥饿等条件，暗营养饥饿等条件，使微生物代谢速率使微生物代谢速率极为缓慢或处于休眠状态。极为缓慢或处于休眠状态。尽可能保持尽可能保持其活力和使其不发生变异。其活力和使其不发生变异。l高质量保藏，即要求保藏的菌种不死高质量保藏，即要求保藏的菌种不死亡、活性不衰退、特性不变异、分类不亡、活性不衰退、特性不变异、分类不紊乱；紊乱； l随时可提供保持有原始特性的菌种用于随时可提供保持有原始特性的菌种用于l交换和使用。交换和使用。菌

6、种连续传代是造成菌种衰退的直接菌种连续传代是造成菌种衰退的直接原因。原因。菌株经连续传代后，含突变基因的个菌株经连续传代后，含突变基因的个体在数量上逐渐占优势，退化现象逐渐体在数量上逐渐占优势，退化现象逐渐显露。显露。回复突变：指变异菌株因遗传组成的自回复突变：指变异菌株因遗传组成的自身修复，使原有的遗传障碍解除，代谢身修复，使原有的遗传障碍解除，代谢途径发生变化，从而恢复原有的特性，途径发生变化，从而恢复原有的特性，表现出原育种过程中已获得的优良性状表现出原育种过程中已获得的优良性状退化的现象退化的现象l菌种遗传特性的改变菌种遗传特性的改变l菌种生理状态的改变菌种生理状态的改变l菌种遗传特性

7、的改变的原因菌种遗传特性的改变的原因 异核现象导致微生物群体发生变异异核现象导致微生物群体发生变异 自发突变导致菌种遗传特性的改变自发突变导致菌种遗传特性的改变 突变所产生的变种或杂交重组所形成突变所产生的变种或杂交重组所形成的杂种的不稳定性，易发生回复突变的杂种的不稳定性，易发生回复突变或产生分离子或产生分离子菌种生理状态的改变菌种生理状态的改变菌种是由一些变异株混合组成菌种是由一些变异株混合组成菌种培养基影响菌种的生理状态菌种培养基影响菌种的生理状态在某些培养条件下，菌体的某些在某些培养条件下，菌体的某些基因处于活化状态或阻遏状态，基因处于活化状态或阻遏状态，而使菌种的生理状态改变而使菌种

8、的生理状态改变l菌种培养基营养过于丰富不利于孢子形成，菌种培养基营养过于丰富不利于孢子形成，影响发酵；菌种培养基营养贫乏，菌种在影响发酵；菌种培养基营养贫乏，菌种在营养贫乏的培养基中多次传代会使菌体细营养贫乏的培养基中多次传代会使菌体细胞内缺乏某些生长因子而衰退甚至死亡胞内缺乏某些生长因子而衰退甚至死亡l因此培养基应选择具有传代后生产能力不因此培养基应选择具有传代后生产能力不发生明显下降、菌落不易衰老和自溶的正发生明显下降、菌落不易衰老和自溶的正常形态菌落，孢子丰富的培养基。常形态菌落，孢子丰富的培养基。l菌种的复壮菌种的复壮l提供良好的环境条件提供良好的环境条件l定期纯化菌种定期纯化菌种l防

9、止自身突变防止自身突变生产菌种的改良生产菌种的改良G杂交育种杂交育种A原生质体融合原生质体融合BDNA重组技术重组技术l指两个不同基因型的菌株通过接合或指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合使遗传物质重新组合，原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离筛选具有新性状的菌株再从中分离筛选具有新性状的菌株细胞壁细胞壁细胞壁细胞壁溶解酶溶解酶细胞膜细胞膜营养细胞营养细胞原生质体原生质体原生质体融合原生质体融合融合细胞融合细胞原生质体形成原生质体形成原生质体融合原生质体融合细胞壁细胞壁再生再生原生质体融合的基本过程原生质体融合的基本过程影响原生质体融合的主要因素l菌体的前处理菌体的前处理l菌体的

10、培养时间菌体的培养时间l融合剂的浓度融合剂的浓度l融合剂作用的时间融合剂作用的时间l阳离子浓度阳离子浓度l融合的温度及体系的融合的温度及体系的pH值等值等影响原生质体再生的主要因素影响原生质体再生的主要因素l菌体自身的再生性能菌体自身的再生性能l原生质体制备的条件原生质体制备的条件l再生培养基成分再生培养基成分l再生培养条件等再生培养条件等lDNADNA重组技术：就是把外源重组技术：就是把外源DNADNA分分子结合到任何病毒、质粒、或其它载子结合到任何病毒、质粒、或其它载体系统中，组成新的遗传物质，并转体系统中，组成新的遗传物质，并转入宿主细胞内进行繁殖的过程。入宿主细胞内进行繁殖的过程。l可

11、以从复杂的可以从复杂的DNA分子中分离出单分子中分离出单独的独的DNA片段。片段。l可以大量生产高纯度的基因片段及其可以大量生产高纯度的基因片段及其产物。产物。l可以在大肠杆菌中研究来自其它生物可以在大肠杆菌中研究来自其它生物的基因。的基因。l在高等动植物中也可以发展和建立这在高等动植物中也可以发展和建立这种基因操作系统。种基因操作系统。DNA重组过程重组过程目标目标DNA片段的获得片段的获得与载体与载体DNA分子的连接分子的连接重组重组DNA分子引入宿主细胞分子引入宿主细胞筛选含有所需重组筛选含有所需重组DNA分子的宿主细胞分子的宿主细胞对外源基因的表达及稳定性的鉴定对外源基因的表达及稳定性

12、的鉴定l基因的分离基因的分离l去垢剂溶解细胞，酚和蛋白酶去除蛋去垢剂溶解细胞，酚和蛋白酶去除蛋白质，核糖核酸酶去除白质，核糖核酸酶去除RNA，乙醇，乙醇沉淀等步骤。特异目的基因的分离主沉淀等步骤。特异目的基因的分离主要采用：物理分离法、互补要采用：物理分离法、互补DNA分分离法和离法和“鸟枪法鸟枪法”等。等。lDNA分子的切割与连接分子的切割与连接l用限制性核酸内切酶（用限制性核酸内切酶（类，识别顺类，识别顺序通常为序通常为46个核苷酸）进行切割；个核苷酸）进行切割；l限制酶产生的黏性末端、末端转移酶限制酶产生的黏性末端、末端转移酶合成的同聚物接尾以及合成的人工接合成的同聚物接尾以及合成的人工接头等，利用头等，利用DNA连接酶来实现连接酶来实现DNA分子的连接分子的连接载体载体l能在大肠杆菌中自主复制能在大肠杆菌中自主复制l对某些限制酶来说只有一个切口，并对某些限制酶来说只有一个切口，并在酶作用后不影响其自主繁殖能力。在酶作用后不影响其自主繁殖能力。l从细菌核酸中易于分离和纯化。从细菌核酸中易于分离和纯化。