分子生物学技术在食品生物安全方面的应用(XXXX[1]1)

1、食品质量安全食品质量安全理化安全理化安全生物安全生物安全 1. 1. 欧盟要求美国政府保证出口到欧盟地区的所有长粒水稻欧盟要求美国政府保证出口到欧盟地区的所有长粒水稻中不含有未经许可的转基因水稻品系中不含有未经许可的转基因水稻品系LL 601LL 601，该水稻品系是，该水稻品系是由拜耳公司研发的。欧盟表示，至少在今后由拜耳公司研发的。欧盟表示，至少在今后6 6个月将要求进行个月将要求进行转基因水稻的检测，而且可能会要求进行附加检测。日本和转基因水稻的检测，而且可能会要求进行附加检测。日本和韩国也对此表示关注，一些媒体暗示政府可能会发出禁令。韩国也对此表示关注，一些媒体暗示政府可能会发出禁令。

2、 2. 20062. 2006年年20082008年，欧盟、日本等国在中国出口的大米年，欧盟、日本等国在中国出口的大米或米制品中检测到有抗虫转基因大米的污染，这些品系在中或米制品中检测到有抗虫转基因大米的污染，这些品系在中国都没有得到允许商业化种植的许可。因此对中国出口的米国都没有得到允许商业化种植的许可。因此对中国出口的米及米制品加大抽查检测力度。及米制品加大抽查检测力度。Quicktest strip for Cry1Ab/Accontrol testpositivenegativePrimer annealing at 50-70CMelting of DNA at 95CPolymer

3、isation at 72C1. Cycle2. CyclePCR and TaqMan are registered trademarks of Hoffmann La Roche and Perkin Elmer1114692501/4893201901241123244MLect i nM3MRoundup Ready 实时荧光（实时荧光（Real Real timetime） PCRPCR的原理的原理 C CT T值值 表示每个表示每个PCRPCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的的循环数。研究表明，各模板的C CT

4、 T值与该模板的起始拷贝数的值与该模板的起始拷贝数的对数存在对数存在线性关系线性关系，起始拷贝数越多，起始拷贝数越多，C CT T值越小，反之亦然。值越小，反之亦然。图图 1.Rn1.Rn与时间曲线与时间曲线 I实时实时 PCR - TaqMan TechnologyRoche LightCycler 2.0Roche LightCycler 480Applied Biosystems 7500型型PCR仪仪 Biorad iCyclerScreening targetsGene specific targetsConstruct specificEvent specific targetsL

5、evels of specificity GMO sequencesLOWHIGHRecent Bt10 case demonstrates need for construct and event specific methods Cottonseed棉籽poppy seeds罂粟子sesame seeds芝麻籽sunflower seeds葵花子Crustacean甲壳类Fish鱼类almond 杏仁brazil nut巴西木坚果cashew 贾如树坚果chestnut 栗子hazelnut 榛子macadamia nut pine nuts 松子pistachio 阿月浑子的果实peca

6、n美洲山核桃 walnut核桃*Some exemptions are included in the list - Example一些例外在-实例表中列出1.原理： 第一步：加入样品 第二步：加入酶标记物 第三步:加入发色剂及反应停止液加入样品后，如果样品中有过敏原（Allergy)，样品中的过敏原(Allergy)将会与包被在微孔中的特异性抗体结合。孵育15分钟后，洗去没有结合的杂质。加入酶标记物后，酶标记物会与过敏原残留物结合形成“三明治”夹心体，孵育15分钟后，洗去没有结合的没标记物。如果样品中有过敏原，加入发色剂（TMB底物溶液）孵育10分钟后与酶标记物结合显蓝色，加入反应停止液停止

7、反应，溶液显黄色，酶标仪读数或用肉眼判读颜色。2.检测步骤：第一步：加入100ul的样品及标准品到相应的微孔中，轻微混合10秒，孵育15分钟。第二步：倒掉微孔中的液体。第三步：用洗板缓冲液洗板，重复5次。第四步：在吸水纸上拍打，直到微孔中没有残留液体。第五步：100ul酶标记物（绿盖）到每个微孔中， ，轻微混合10秒，孵育15分钟。第六、七、八步：（同第二、三、四步）第九步：加入100ul发色剂（TMB底物），轻微混合10秒，孵育15分钟。第十步：加入100ul的反应停止液，轻微混合10秒。第十一步：肉眼比色（定性检测）或酶标仪读数（定量检测）食品过敏原检测（棉拭子法）-用于设备表面残留的检测

8、第一步：选择一个棉拭子。第二步：在棉拭子管上标记样品号。第三步：放置棉拭子管在棉拭子管架上。第四步：打开棉拭子浸湿溶液管。第五步：将棉拭子插入浸湿溶液管浸湿棉拭子。第六步：转移面拭子，如果棉拭子太湿，在棉拭子浸湿溶液管壁上轻微压一下。第七步：用浸湿的棉拭子交叉的平行线画出阴影，或用自己的方式涂布要检测的区域。第八步：放置棉拭子到对应样品的棉拭子管。第九步：封闭好棉拭子管。第十步：储存棉拭子管，直到提取、分析。过敏原（过敏原（ALLERGY）检测产品表（）检测产品表（ELISA）法）法）1. 检测原理：检测原理： PCRFast是一种即用型的分子生物学方法，用于检测食品、设备残留样品中的特异性D

9、NA片段。检测系统符合国际PCR标准（ISO）。该试剂盒利用实时荧光定量（Real-time PCR)的方法（含有FAM报告基因和非荧光淬灭基因的探针）检测食品及设备残留中过敏原的特异性DNA片段。6.样品提取（DNA提取）： 每次PCR的分析，建议对每个样本进行两次提取，并且每个运行分析都设置提取对照(ISO 21571, 用于检测转基因生物体的食品分析方法和用于衍生产品的核酸提取方法)。 对于不同的样本，用以下优化的CTAB方法可以得到好的结果。根据不同的样本也可以采取不同的提取方法。 对于食品样本，例如蔬菜和动物脂肪或者卵磷脂，应该采用正己烷萃取法提取。 a. 经典的核酸提取方法（如CT

10、AB方法） b. 试剂盒法提取样品核酸试剂盒法提取样品核酸 （用硅胶柱纯化（用硅胶柱纯化DNA，例如：，例如：PCRFast DNA纯化。）纯化。） 一次PCR设置的每个分析系统都要进行提取对照ETC分析，只加入试剂不加样本。6.3 DNA浓度的评估浓度的评估 总DNA的总量大于100ng不能进行PCR反应（用260nm的紫外进行检测，或者通过琼脂糖凝胶进行估算因此，如果是含有高浓度DNA的样本（大豆粉、玉米粉、香肠等样本），DNA提取物必须用0.1 x TE 缓冲液进行稀释。 DNA提取物带有抑制效应（含有可可、巧克力的食品等）同样需要用0.1 x TE 缓冲液进行稀释。例如：用步骤6.1(

11、12)中100l的柱子或者步骤6.2中100l的洗脱柱子，已证明最佳稀释比例如下：香肠样本 1：401：80 玉米粉 1：20大豆粉 1：20 鳀鱼片 纯淀粉 纯 巧克力 1：10和1：20动物饲料 1：101：207. PCR设置设置 7.1 准备 从锡箔袋中取出所需数量的反应管，将其余的反应管和干燥剂放回锡箔袋子，密封好，贮存于2 - 8 C。准备所需量的MasterMix（每个反应管12.5 l）。7. PCR设置设置按下列表格所示吸取相应的量加入反应管：应当包括核酸提取对照、按下列表格所示吸取相应的量加入反应管：应当包括核酸提取对照、PCR阴性对照和阳性对照、试剂空阴性对照和阳性对照、

12、试剂空白对照。白对照。8. 评估：8.1实时评估样本：下表显示了评估。阳性反应应该给出一个最后的荧光值，这个值明显高于阈值。*稀释已提取的DNA样本，再次扩增。“+” = 扩增信号您身边的食品安全专家您身边的食品安全专家8.2.2.扩增图的评估示例：PCRFast Realtime (探针)评估：Fig. 1: 阴性样本(样本无扩增)Fig. 2:阳性样本Fig. 3:抑制反应，稀释提取的DNA，再次扩增内参ITC样本样本内参ITC样本内参ITC您身边的食品安全专家您身边的食品安全专家过敏原（过敏原（ALLERGY）检测产品表（）检测产品表（PCRfast法）法）Immunofast 过敏原快速检测条简介过敏原快速检测条简介规