疏水层析PPT学习教案

1、会计学1疏水层析疏水层析9.1、概述9.2、疏水层析原理9.3、疏水层析介质9.4、疏水层析实验技术9.5、疏水层析的应用9.6、反相层析第1页/共85页第2页/共85页第3页/共85页疏水作用疏水作用(hydrophobic interaction):非极性分子进入水中，有聚集在一起形成最小疏水面积的趋势，保持这些非极性分子聚集在一起的作用则称为疏水作用。第4页/共85页 对于可溶蛋白，溶剂是水，疏水侧链因此被包埋在蛋白质内部。最终的结构是最适合周围溶液的热动力学折衷的结果。第5页/共85页 就球形蛋白质的结构而言，其分子中的疏水性残基数是从外向内逐步增加的。 虽然疏水氨基酸大多被包埋在球形

2、蛋白内部，有些则暴露在外，在蛋白质表面形成疏水区域，这部分暴露在外疏水性基团称为疏水补疏水补丁丁。疏水和亲水部件表面的溶菌酶。最疏水部分是深红色,浅红色的更少的疏水性。最亲水部分显示在深蓝色的,更少的亲水部分是浅蓝色。第6页/共85页高度规则的水壳层包围在配基和蛋白的疏水表面周围。疏水物质被迫融合以减少这种壳的总面积（熵最大）。在纯水中，任何疏水效应都太弱而不能导致配基和蛋白之间或蛋白自身的相互作用。盐能够增强疏水作用。A) 9.2、疏水层析原理B)第7页/共85页第8页/共85页第9页/共85页n对于疏水性很强的物质，则需要在流动相添加适量有机溶剂降低极性才能达到解吸附的目的。第10页/共8

3、5页9.3、疏水层析介质第11页/共85页 R代表疏水配基，代表疏水配基，M代表基质。调节两种代表基质。调节两种反应物的比例可控制介质的配基密度反应物的比例可控制介质的配基密度 第12页/共85页（A）丁基（B）辛基（C）苯基（D）新戊基 偶联至基质的常见配基类型第13页/共85页 对某些蛋白而言，上述有些配基与其结合力对某些蛋白而言，上述有些配基与其结合力太强太强，洗脱，洗脱有时需用有机溶剂，有变性风险；具有时需用有机溶剂，有变性风险；具中等疏水的高分子配基中等疏水的高分子配基( (如聚乙二醇和聚如聚乙二醇和聚丙三醇丙三醇等等) )不仅可提供足够的结合力，且避免了上述缺点。不仅可提供足够的结

4、合力，且避免了上述缺点。第14页/共85页第15页/共85页第16页/共85页9.4、疏水层析实验技术第17页/共85页第18页/共85页 配基的种类和目的蛋配基的种类和目的蛋白的性质在确定疏水相互作白的性质在确定疏水相互作用层析的选择性方面是高度用层析的选择性方面是高度显著的参数。最合适的配基显著的参数。最合适的配基必须通过用目的蛋白进行筛必须通过用目的蛋白进行筛选试验来确定。选试验来确定。图21 在使用一种苯基配基、同样的运行条件下三种单克隆抗体相互作用不同。第19页/共85页第20页/共85页第21页/共85页第22页/共85页第23页/共85页 在实践中，钠、或铵的硫酸盐有效的促进在疏

5、水相互作用层析中配基-蛋白相互作用，在蛋白质结构上有稳定作用。 因此，最常用的盐：Na2SO4、NaCl和(NH4)2SO4 。第24页/共85页第25页/共85页图22 不同盐对选择性的影响：按顺序增大洗脱体积洗脱：细胞色素C、溶菌酶、核糖核酸酶A、-糜蛋白酶原。第26页/共85页第27页/共85页图23 起始溶液中的盐浓度影响选择性和分辨率。第28页/共85页三、第29页/共85页第30页/共85页第31页/共85页四、层析步骤平衡上样平衡除杂洗脱第32页/共85页341. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionEqui

6、librate the column and adjust the sample to binding conditionsHydrophobic ligandGel matrixWater molecules第33页/共85页1. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionGel matrixProteinsHydrophobic groups 第34页/共85页1. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionConc. saltAbsNon-bound pro

7、teins第35页/共85页1. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionTarget elutesConc. saltAbs第36页/共85页Conc. saltAbs1. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionMore strongly bound proteins第37页/共85页第38页/共85页第39页/共85页第40页/共85页大多数条件下，增高温度会增强疏水相互作用，所以在更低的温度工作（通常低于10度）能够使由于疏水相互作用而导致的样品组分间

8、的聚集最小化。降低温度可以作为通过加入去垢剂来提高可溶性的替代方案。第41页/共85页第42页/共85页第43页/共85页第44页/共85页n用过的介质应贮存在含有适当抑菌剂的溶液中，在4 8的条件下保存。第45页/共85页第46页/共85页第47页/共85页Sample: Hybridoma cell culture supernatant, mouse IgG1, anti-IgE. Ammonium sulfate added to 0.5 MColumn: HiLoad 16/10 Phenyl Sepharose HPStart buffer: 20 mM potassium pho

9、sphate, 0.5 M ammonium sulfate, pH 7.0Elution buffer: 20 mM potassium phosphate, pH 7.0 Gradient: 0100% elution buffer in 10 CVFlow: 100 cm/h 在杂交瘤细胞培养液中产生的鼠IgG1 anti-IgE，和Phenyl Sepharose结合非常强，大多的胎牛血清蛋白流过了柱子，最终获得了高于95%的纯度的单抗。第48页/共85页第49页/共85页Column: Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow packed in XK 50/20,

10、 130 ml穿透峰洗脱峰标准品第50页/共85页第51页/共85页第52页/共85页RP-HPLC separates rabbit and human insulin that differ by only a single amino acid. Column: VYDACColumn: VYDAC214TP54 214TP54 EluentEluent: 2730% : 2730% acetonitrileacetonitrile (ACN) in 0.1% TFA over 25 (ACN) in 0.1% TFA over 25 minutes at 1.5 minutes at

11、1.5 mLmL/minute./minute.第53页/共85页第54页/共85页NORMAL PHASE：第55页/共85页第56页/共85页第57页/共85页第58页/共85页第59页/共85页生物大分子：C4C4、C8C8的烷基；的烷基；多肽：多肽：C18C18烷基烷基第60页/共85页第61页/共85页过滤后分别用四氯化碳、丙酮溶剂洗涤，过夜即可。4.5 g正辛基二甲基氯硅烷40 g 四氯化碳密闭容器混匀，超声波脱气100 mg硅胶载体超声波脱气30 min30 min室温下反应24 h24 h第62页/共85页第63页/共85页第64页/共85页第65页/共85页第66页/共85页

12、第67页/共85页第68页/共85页Elution of five peptides at pH 2.0, 4.4 and 6.5 with phosphate as the buffer.Column: VYDACColumn: VYDAC218TP54 (C18, 5 218TP54 (C18, 5 m, 4.6 x 250 mm). m, 4.6 x 250 mm). EluentEluent: : 1530% ACN in 30 min at 1.0 1530% ACN in 30 min at 1.0 mLmL/min; plus A. 20 /min; plus A. 20 mMphosphatemMphosphate, pH , pH 2.0 B. 20 2.0 B. 20 mMphosphatemMphosphate, pH 4.4 C. 20 , pH 4.4 C. 20 mMphosphatemMphosphate, pH 6.5 , pH 6.5 Peptides: 1. bradykinin2. oxytocin3. Peptides: 1. bradykinin2. oxytocin3. angiotensinIIangiotensinII 4.