生化技术思考题

1、生化技术思考题1. *生物大分子制备的主要特点？与化学产品的分离相比较：1) 蛋白质的组成、结构极其复杂，分子差异大导致分离、纯化和鉴定有难度和特殊性；核酸较之要简单。2) 通常以复合物的形式存在，提取分离困难。3) 许多生物大分子离开了生物体环境就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，是生物大分子提取制备最困难之处。4) 许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。5) 生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物，方法的通用性较差。2. 影响抽提的主要因素有哪些？1) PH（碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性物质）；2) 溶剂的极性和离子强度（极

2、性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂）；3) 水解酶（组织细胞破坏后均会释放水解酶降解生物大分子，故需加入抑制剂或调节提取液的PH等方法使水解酶失去活性）；4) 温度（温度升高，溶解度加大）；5) 搅拌（采用温和的搅拌促使提取物的溶解）；6) 氧化（一般在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸以防止蛋白质中的巯基氧化）；7) 金属离子；8) 抽提液与抽提物的比例（一般以5:1为宜）。3. *分离纯化方法主要有哪几类？1) 以分子大小和形态的差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。2) 以溶解度的差异为依据的方法：盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。3) 以电

3、荷差异为依据的方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。4) 以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析等。（1）沉淀法：盐析，有机溶剂沉淀，选择性沉淀；（2）层析技术：吸附层析，疏水层析，离子交换层析，亲和层析，聚焦层析，凝胶层析；（3）快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳；（4）离心。4. 早期分离纯化的特点和要求？1) 特点：a) 粗提取液中物质成份十分复杂b) 欲制备的生物大分子浓度很稀c) 物理化学性质相近的物质很多d) 希望能除去大部分与目的产物物理化学性质差异大的杂质2) 要求：a) 要快速、粗放b) 能较大地缩小体积c) 分辨力不必太高d) 负荷能力要大5. *

4、盐析法的优点？盐析的影响因素？1) 优点：a) 成本低，不需要特别昂贵的设备。b) 操作简单、安全。c) 对许多生物活性物质具有稳定作用。2) 影响因素（主要与盐析常数Ks有关）：a) 蛋白质的种类:蛋白质的种类不同，Ks值会有所不同；分子量越大，沉淀所需盐的量越少； 蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀。b) 蛋白质的初始浓度:0.2%到2%较适宜。c) 无机盐种类:阴离子盐析作用顺序：柠檬酸盐>PO43>SO42>CH3COO>Cl>NO3>SCN阳离子盐析作用顺序（一价）：NH4+>K+>Nad) 温度:（0到4）在高离子强度溶液中，升高温度

5、有利于蛋白质的失水，使之溶解度下降。在低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范围内一般随温度升高而增大。e) pH值:在接近蛋白质等电点（PI）的溶液中进行盐析有利于蛋白质的沉淀。需要注意在高盐溶液中蛋白质的等电点会发生偏移。6. 影响带点颗粒在电场中泳动速度的因子有哪些？（1）颗粒的理化性质：电荷、直径、形状等；（2）电场强度：电场强度越大，带点颗粒的泳动速度越快；（3）溶液性质：PH、离子强度、溶液粘度等；（4）电渗；（5）焦耳热；（6）筛孔：筛孔越大，泳动速度越快；7. 为什么不连续系统或连续系统的聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳分辨率高？琼脂糖凝胶孔径大，仅对少数蛋白质有筛分效

6、应；而不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，且孔径大小可以调节。8. 配15%聚丙烯酰胺凝胶溶液10ml，问需要丙烯酰胺和双丙烯酰胺各多少克？a：b=19:1，所以单体为1.425g，双体为0.075g。9. 哪些因子影响聚丙烯酰胺凝胶的化学聚合速度？预电泳的目的是什么？预电泳时应注意哪些因素？ 聚合影响因素：1.大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。在进行化学聚合前，在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。2.低温会减慢聚合反应速度。3.有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑制聚合反应。预电泳目的：除AP、未聚合丙烯酰胺、杂质。（除AP以免它使某些欠稳

7、定的样品失活或产生意外的影响；另外，除去未聚合的丙烯酸以及能吸收紫外光的杂质为确保电泳参数的恒定）注意事项：1.上下电极槽中均加入分离胶缓冲液，预电泳的电流为3mA/管，时间需30分钟2小时。2.预电泳不能在制好浓缩胶后进行 3.不能用电极缓冲液进行，不然会破坏不连续系统，而使浓缩效应失效。10. 简述琼脂糖凝胶电泳、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、电聚焦、 SDS-PAGE的一般原理及方法。（1） 琼脂糖凝胶电泳原理：借助琼脂糖凝胶的分子筛作用，核酸片段因其分子量或分子形状不同，电泳移动速度有差异而分离。方法：1.适合的电泳缓冲液；2.制备琼脂糖凝胶；3.加样；4.电泳的合适电压和温度

8、； 5.染色；6.凝胶成像.（二）不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： 原理：（1）聚丙烯酰胺凝胶合成：1. 丙烯酰胺和双丙烯酰胺含量的确定2. 丙烯酰胺的聚合 （2）分离效应：浓缩效应、电荷效应、分子筛效应 方法 摆好玻璃管 制备分离胶 预电泳：除AP、未聚合丙烯酰胺、杂质 制备浓缩胶 加样：浓缩胶缓冲液+样本+蔗糖/甘油+指示剂 电泳：先低电流，样品进胶后，调至所需电流 取胶 固定和谱带检测 迁移率测定 谱带保存（三）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)原理：SDS是阴离子表面活性剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质的空间结构，并与蛋白质结合形成SDS-蛋白复合物，

9、蛋白质分子即带大量的负电荷，并远远超过原来所带的电荷，使天然蛋白质分子之间的电荷差别降低，甚至可以忽略。因此，排除了蛋白质的电荷和结构差异，SDS-蛋白质复合物在电泳时的泳动差异就由蛋白质的分子量所决定。方法 凝胶的制备：用0.1% SDS-0.1mol/L磷酸钠缓冲液配置 样品制备：样品溶于2% SDS- 0.1%巯基乙醇-0.01mol/L磷酸钠缓冲液 电泳条件：电极液（0.1% SDS-0.1mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2） 固定与染色：考马斯亮蓝（四）电聚焦：原理：利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体，两性电解质载体在电场作用下，按各自p

10、I形成从阳极到阴极逐渐增加的连续pH梯度。蛋白质是两性电解质，其pI有差异，电泳时分别聚焦于支持物上pH等于各自pI的区域。方法：a.凝胶配制（不考虑分子筛效应，同时加入一定PH范围的载体两性电解质）；b加样；c聚焦（阳极液酸性；阴极液碱性）；d固定与染色；e样品PH的测定；f蛋白质的洗脱、定量；gpI的测定。11. 几种常见的蛋白电泳。常见的核酸电泳。蛋白质电泳：1.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）； 2SDS-PAGE：常用于蛋白质分子量的测定； 3.等电聚焦电泳（IEF）：通过蛋白质PI差异分离； 4.双向电泳：蛋白质组学研究的重要技术。核酸电泳：1.琼脂糖凝胶电泳； 2.PAGE（分离只

11、有几个bp差别的核酸）12. 转移电泳有哪几类?各有何用途？1.Southern blot 检测DNA片段2.Northern blot 检测RNA片段3.Western blot 蛋白质印迹4.Eastern bolt 双向蛋白质印迹法13. 层析的分类？1) 根据固定相“床”的形式分类，层析可以分为柱层析、薄层层析、纸层析和薄膜层析。纸层析是指以滤纸作为基质，点样后用流动相展开，使各组分分离。薄层层析是将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各组分分离。柱层析则是指将固定相填装在管中形成柱形，在柱中进行层析。薄膜层析是将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析的方法进

12、行物质的分离。2) 根据流动相的形式分类，层析可以分为液相层析和气相层析。气相层析是指流动相为气体的层析，而液相层析指流动相为液体的层析。3) 根据分离的原理不同分类，层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。吸附层析是以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术。分配层析是根据在一个有两相同时存在的溶剂系统中，不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。凝胶过滤层析是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种层析技术。离子交换层析是以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进行分离的一

13、种层析技术。亲和层析是根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力(如酶和抑制剂、抗体和抗原、激素和受体等)，将某种配体连接在载体上作为固定相，而对能与配体特异性结合的生物大分子进行分离的一种层析技术。亲和层析是分离生物大分子最为有效的层析技术，具有很高分辨率。14. 凝胶层析中分离系数与洗脱体积及分子的关系？对某物质在凝胶柱内洗脱体积Ve、Vo和Vi之间的关系可用下式表示： VeVoKd*Vi 可改写为： （Ve-Vo） Kd = Vi当Kd0时，Ve=Vo，说明这种溶质相对分子质量大，完全不能进入凝胶颗粒微孔内，被排阻于凝胶颗粒之外而最先洗脱下来；当Kd1时，即Ve小分子 VoVi= Vt ，说

14、明这种溶质的相对分子质量小，完全向凝胶颗粒内扩散，在洗脱过程中将最后流出柱外。当0Kdl时，意味着溶质分子只有部分向凝胶颗粒内扩散，Kd愈大，进入凝胶颗粒内的程度愈大,分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。15. 不同原理层析中K值代表的含义？v 吸附层析中K值表示吸附平衡常数v 分配层析中K值表示分配系数v 离子交换层析中K表示交换常数v 亲和层析中K表示亲和常数16. K 值与那些因素有关，其大小代表的含义？ 被分离物质本身的性质 固定相和流动相的性质 层析柱的温度。v K值大表示其溶质在固定相中浓度大，在洗脱过程中溶质出现较晚v K值小表示某溶质在流动相中浓度大，故在洗

15、脱液中出现较早v 有相似的K值，则表明两组分层析峰会发生重叠，分离效果差17. 概述哪些因素影响离子交换剂的工作交换容量，为什么？工作交换容量，表示树脂在某一定条件下的离子交换能力，它与树脂种类和总交换容量，以及具体工作条件如溶液的组成、流速、温度等因素有关。18. *影响凝胶过滤分离效果的有哪些因素，为什么？凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。影响凝胶过滤分离效果的因素：样品体积和柱体积之间的比值、流速、柱子直径、颗粒大

16、小及分布、装柱密度、颗粒的孔洞以及流动相的粘性。（1）层析柱的选择：层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。（2）凝胶柱的鉴定：凝胶柱的填装情况将直接影响分离效果,凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡.（3）洗脱液的选择：在凝胶层析中流动相只是起运载工具的作用，一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率.凝胶层析洗脱液的选择不那么严格,为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐。（4）加样量：要尽量快速

17、、均匀.加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。（5）洗脱速度：一般洗脱速度要恒定而且合适,洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间会大大延长.提高分辨率的选择应主要包括：选择包括各个待分离组分但分离范围尽量小一些的凝胶，选择颗粒小的凝胶，选择分辨率高的凝胶类型，选择较长、直径较大的层析柱、减少加样量、降低洗脱速度等等。19. *离子交换剂有哪几部分组成？何谓阳离子和阴离子交换剂？离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。将离子交换剂按活性基团分，可分为阳离子交换剂(cation exchang

18、e)（含酸性基团，具有阳离子交换功能）和阴离子交换剂(anion exchange)（含碱性基团，具有阴离子交换功能）。各类交换剂根据其解离性大小，具体又可以分为： 强、中、弱阳和强、中、弱阴。20. 实用的离子交换剂应足那些要求？（1）有高度的不溶性，在各种溶剂中进行交换时，不发生溶解；（2）有疏松的多孔结构或巨大的表面积，使交换离子能在交换剂中进行自由扩散和交换；（3）有较多的交换基团；（4）有稳定的物理化学性质，在使用过程中，不因物理或化学因子的变化而发生分解或变形等现象。1 空气：空气的影响主要是潮解、微生物污染和自动氧化。空气中微生物的污染可使样品腐败变质，样品吸湿后会引起潮解变性，

19、同时也为微生物污染提供了有利的条件。某些样品与空气中的氧接触会自发引起游离基链式反应，还原性强的样品易氧化变质和失活，如维生素C、巯基酶等。温度：每种生物大分子都有其稳定的温度范围，温度升高10，氧化反应约加快数倍，酶促反应增加13倍。因此通常绝大多数样品都是低温保存，以抑制氧化、水解等化学反应和微生物的生成。水份：包括样品本身所带的水份和由空气中吸收的水份。水可以参加水解、酶解、水合和加合。加速氧化、聚合、离解和霉变。光线：某些生物大分子可以吸收一定波长的光，使分子活化不利于样品保存，尤其日光中的紫外线能量大，对生物大分子制品影响最大，样品受光催化的反应有变色、氧化和分解等，通称光化作用。因

20、此样品通常都要避光保存。样品的pH：保存液态样品时注意其稳定的pH范围，通常可从文献和手册中查得或做实验求得，因此正确选择保存液态样品的缓冲剂的种类和浓度就十分重要。时间：生化和分子生物学样品不可能永久存活，不同的样品有其不同的有效期，因此，保存的样品必须写明日期，定期检查和处理。层析；根据待分离混合物中各组分理化性质的差异，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中，由于各组分在流动相中的迁移速度不同，从而得到有效分离的一类物理分离方法分配系数；在一定条件下（如温度、压力）某种组分在固定相和流动相中含量的比值，分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据，常用K表示迁移率；在一定条件下，在相同的时间

21、内某一组分在固定相中移动的距离与流动相本身移动距离的比值，常用Rf表示。亲和层析；亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的内水体积；凝胶颗粒中空穴的体积，凝胶层析中固定相的体积。柱床体积；凝胶柱所能容纳的总体积排阻极限；不能进入凝胶颗粒空穴内部的最小分子量交换容量；指离子交换剂与溶液中离子或离子化合物进行交换的能力。交换容量是表征树脂交换能力的重要参数，其表示方法有质量交换容量（mm

22、ol/g干树脂）和体积交换容量（mmolmL树脂）交联度; 表示离子交换树脂中交联剂的含量。交联度越大，凝胶的网结构越紧密，吸水后膨胀越小，能分离的分子量越小，反之交联度越小，网状结构愈疏松，吸水后膨胀越大1、 层析的分类？根据固定相“床”的形式分类，层析可以分为柱层析、薄层层析、纸层析和薄膜层析。纸层析是指以滤纸作为基质，点样后用流动相展开，使各组分分离。薄层层析是将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各组分分离。柱层析则是指将固定相填装在管中形成柱形，在柱中进行层析。薄膜层析是将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析的方法进行物质的分离。根据流动相的形式

23、分类，层析可以分为液相层析和气相层析。气相层析是指流动相为气体的层析，而液相层析指流动相为液体的层析。根据分离的原理不同分类，层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。吸附层析是以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术。分配层析是根据在一个有两相同时存在的溶剂系统中，不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。凝胶过滤层析是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种层析技术。离子交换层析是以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进行分离的一种层析技术。亲和层析是根据生物大分子和配体

24、之间的特异性亲和力(如酶和抑制剂、抗体和抗原、激素和受体等)，将某种配体连接在载体上作为固定相，而对能与配体特异性结合的生物大分子进行分离的一种层析技术。亲和层析是分离生物大分子最为有效的层析技术，具有很高分辨率。2、 影响凝胶过滤分离效果的有哪些因素，为什么？凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。影响凝胶过滤分离效果的因素：样品体积和柱体积之间的比值、流速、柱子直径、颗粒大小及分布、装柱密度、颗粒的孔洞以及流动相的粘性。（1）层析柱的选择：层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。（2）凝胶柱的鉴定：凝胶柱的填装情况将直接影响分离效果,凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡.（3）洗脱液的选择：在凝胶层析中流动相只是起运载工具的作用，一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率.凝胶层析洗脱液的选择不那么严格,为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定