美国及欧洲药典系统适应性要求

1、S/N = 2H/hFigure 5. Noise and chromatographic peak, compoi系统适应性一国药典系统适应性是气相和液相色谱分析方 法的重要组成部分，用于证明色谱系统的分 离度和重现性能满足样品的分析要求。测试基于这样的原理：仪器、电路、方 法和样品组成一个整体系统，我们可以对这 个系统进行测试评估。影响色谱系统的因素包括： 流动相的组成、离子强度、温度和pH 值 柱子大小、流速、柱温和压力 固定相特点，包括填料类型，载体形状、 粒径、孔径、表面积等。 常用固定相为反相硅胶，以十八碳烷基 健合硅胶最常用，其它经过化学修饰的 硅胶也有使用。分离度Rs是理论塔板

2、数n的函数（也 叫柱效），a是分离因子，k是容量因子（所 有符号的意义见前文“色i普定义和说明”部 分）。在规定的色谱条件序n表示洗脱物 中相邻化合物的分离程度，可作为衡量色诺 系统柱效能的指标，但是不如直接测试的结 果可靠。峰的尖锐程度部分反映柱效，这个 参数对检查微量物质至关重要。标准品或者标准溶液需要重岌进样以 确保精密度。除非个论中有规定，系统适用 性五针的数据的相对标准偏差不超过2.0%. 如果超过2.0%的话，需要进样六针。在含量测定中，如果纯品含量100%, 则相对标准偏差没有最大值限制，这个值可 根据多次进样对照溶液来计算：%RSD=kB/n/t9o% n-1K 为常数0.34

3、9,由公式k=（0.6/）x（t90%T5/V6） 计算得来，省表示B=1.0时六次进样的相对 标准偏差。B是个案中规定的上限。n是对 照溶液的进样次数（3BW6）, t9o%m是自 由度为n-1、置信水平为90%,双侧检验时 的t值。除非另有规定，RSD不能超过卜.表中 的值。此规定不适用于相关物质检测。Relative Standard Deviation Requirents进样次数3456B%RSD上限2.00.410.590.730.852.50.520.740.921.063.00.620.891.101.27对称因子AS,用于衡景峰的对称性， 完全对称时值为1。拖尾越严重，AS的

4、值 越大（见图4）。偶尔也会有值小于1的情 况。如果对称因子与1的差值越大，则枳分 的精密度越差。信噪比（S/N）是系统适应性的一个重 要参数，计算公式如下（图5）：H是峰高，即峰最高点到基线的距离: h是噪音最大值和最小值之间的差值。系统适应性测试的数据通过重k进样 标准品或者特定文件中规定的对照溶液而 得到，此文件中对相关参数的定义同样适用 于其它操作条件，以卜情况可做相应调整: 标准品（包括参考物质）对适应性测试中的所有化合物均适用 在系统适应性测试中为改进色谱系统性能 而作适当调整寸色漕系统的调整不能弥补柱了 和系统本 身的缺陷.为满足系统诂应性要求而对分析方法调整 时，除非另有规定，

5、以下每个变虽的最大值都应 考虑：这些调整需要附加有效数据。为验证新方 法的系统适应性，需要对改变条件后的分析方法 重新评价。多处改动会对系统性能产生积累效果, 在分析之前能仔细号虑。在梯度洗脱中不推荐改 变流动性组成，如果必须改变，则只对溶剂体积 或滞后体积改变。流动相pH （HPLC）：在配备流动相时，水相缓 冲液的pH波动范围在正负0.2个单位 缓冲液盐浓度（HPLC）：在满足pH伉条件下， 缓冲液中盐的浓度波动范围在±10% 流动相的组成（HPLC）：以I、调整限度诂用于 流动相中的小组分（比例小于等于50%）.这些 组分的量可在正负30%范围内调整。但是不能 超过总流动相的1

6、0%.下面是两相体系和三相 体系组分的调整范闱两相体系：溶剂比为50:50时，50的30%是15%.超过了 10%的限度，因此流动相比例只能在40:60到 60： 40范围内调整。容积比为2： 98时，2的30%时0.6%因此改 变范围在14： 98.6到2.6:97.4三相体系：溶剂比为60:35:5时，第二组分35的30%时 10.5%,超过10%的限度，只能在25%到45% 的范围内改变第三组分5的30%是1.5%。加 上组分一共同构成洗脱体系。因此三相体系的比 例变化范围是50:45:5到70:25:5或者 58.5:35:6.5 jHJ 61.5:35： 3.5.紫外可见光检测器的波

7、长：操作过程中不允许 波火有误差，厂家或者其它机构对检测器波K的 校正误差不超过3nmo固定相：柱K：可变范围为原柱长的±70%柱内径（HPLC）：如果线速度恒定可做适当调节， 见流速项（HPLC）下.柱内径（GC）：调整范围为原柱内径的±50% 薄膜厚度（毛细管GC）：调整范围为-50%到 100%粒径（HPLC）：填料颗粒尺、J.可以减小50%. 但是不能增大.粒径（GC）：任满足色谱系统适应性要求的情况 卜粒径由大换小或者由小换大都W以，调料的 粒径比率由最大颗粒的直径除以最小颗粒的直 径而来。流速（GC）：流速可调范国在±50%流速（HPLC）：柱了尺寸改

8、变时，流速可由下式 计算：F2=F1l2d22/l1dl2Fi是文件中规定的流速，单位是mL/min, F?是调整后的流速：k是文件中规定的柱K，12 是使用柱K；山为文件中规定的柱内径，d2为使 用柱内径。流速可变范刖是±50%。进样体积（HPLC）：只要满足精密度和检测限， 进样体积可以适当减少，但不能增加。进样体积和分流体积（GC）：检测器和重现性较 好时可做适当调整。柱温（HPLC）：柱温波动范用在±10°进样口温度（GC）：可调范围±10°程序升温（GC）：温度可做适当改变，需要保持 定温度或者改变到另温度值时，温度变化做 大容许范围

9、是±20°。除非另有规定，系统适应性参数由待测物峰 的数据计算、样品的R，RF, tR实测值应与对照品的实 测值一致，文件中给的相对保留时间值是为了方 便峰的指认，对于相对保留时间没有评判标准。适应性测试时为了确保最终操作结果的有 效性。实验过程中为确保系统适应性，进样前应 做适当的准备工作.配置待测溶液时，溶液中包括一定景的待测 物和-些其它物质（如药品辅料或者杂质）。当 色谱系统仃显著变化时，或者要用特殊试剂，则 要重新做系统适应性实验，否则不能进行样品分 析。2.2.46色谱分离技术色谱分离技术是一种多级分离方法，样 品在固定相和流动相之间多次分配，达到动 态平衡。固

10、定相一般是附在硅胶或者其它同 体我体上的固体或液体，可填充在层析柱上 或铺在薄层版/薄膜上，流动相可以是气体、 液体或者超临界流体。分离原理包括吸附色 谱、分配色谱、离子交换色谱、分子排阻色 i普等,也可根据样品分子的大小、空间体枳、 质量等物理化学性质来分离。本章介绍了系统适应性测试涉及的参 数定义及计算方法，分析方法和仪器介绍等 己分别在以下章节做了介绍： 纸色谱12.26 薄层色谱2227 气相色谱2 2.28 液相色漕2.2.29 排阻色漕2 2 30 超临界流体色谱2.2.45Peak 1Time (f)Figure 2.2.46.-1.定义卜.面分别介绍系统适应性和验收标准 的相关

11、参数定义。有些仪器的软件系统包含 了J些特定参数的计算方法（例如性噪比、 分离度）。操作人员有责任确认该计算方法 是否符合欧洲药典要求，如果有差别，应对 该方法做适当调整以符合药典规定。色谱图反应检洲器的响应信号、洗脱剂浓度或体积 与时间的关系等。理想的色谱图是在平稳的 基线上各色谱峰彼此分离，呈高斯分布。色谱峰色i普柱中洗脱的单个组分或者未分离的多 个组分在检测器上的响应信号，是色谱图的 一部分。一般用蜂面枳、峰高h和半高峰宽 Wh、峰高h和峰宽w,等参数来描述色漕峰。 高斯峰有如下关系（图2.2.46-1）：Wh= 1 18Wx保留时间tR组分从进样到出现最大峰所需时间保留体积Vr组分从进

12、样到出现最大峰所需的流动相体 积，可用保留时间乘以流速F。VR=tR X F死时间tM不被固定相滞留的组分，从进样到出现最大Peak 2峰所需时间死体积Vm不被:固定相滞留的组分，从进样到出现最大 峰所需流动相体积。Vm = 1m X F排阻色谱中用V。表示（见卜.而）保留因子k右时用容量因子£或者分配比Dm表示，计 算公式如下：K =固定-中的、分房=*坦流动相中的丁分星质Kc表示分配常数，也叫平衡分配系数V5表示固定相体积Vm表示流动相体积在色谱系统中某组分的保留因子也订按F 式计算：K=LtM流动相总时间以当组分粒径小于固定相胶 体孔径的最小尺寸时，该组分从进样到出现 最大峰所

13、需时间（图2.2.46-2） 流动相总体积Vt,当组分粒径小于固定相胶 体孔径的最小尺、J.时，该组分从进样到出现 最大峰所需流动相体积，可按下式计算Vt=ttXF滞留时间M：当组分粒径大于固定相胶体孔 径的最大尺寸时，该组分从进样到出现最大 峰所需时间滞留体积Vo：当组分粒径大于固定相胶体 孔径的最大尺寸时，该组分从进样到出现最 大峰所需体积，可按下式计算Vo=toXF分配常数戚：表示排阻色谱中某一组分的洗 脱能力，也叫分配系数，可用卜式计算：tRt。“一 SLC 3nd GCSl20«KClUSI(M)ctironiatographysseEJ«no4)-on 107仲

14、1 o'1 (rTme (0Volume (V>Figure 2.246.-2.arbOBA. mobile phase front B. spot C. line of appheaUonFigure 2246.3B是分析物的移动距离A是溶剂前沿的移动距离100 %SC2XW2<滞留因子RF：在平面色谱中也叫保留因子 Rp表示组分在板上的点到原点之间的距离 与溶剂前沿到原点的距离的比值(图 2 2 46-3 )o塔板数N： H反映柱效，又叫理论塔板数, 计算公式如下：N = 5 54()2是组分的保留时间，Wh是该物质的半高峰 宽色谱柱类型、柱温、流动相以及化合物类型 都

15、会影响理论塔板数的值滞后体积D：也叫梯度延迟体积，指从流动 相混合点至柱头的系统体积，可用以下方法 计算：色谱柱:用适当的毛细管(如1 mXO 12 mm) 代替流动相：A相是水，B相是0 1% (V/V)的 丙酮水流速F：能达到足够的反压为准(如Zml/imn)时间minA相体积百 分比B相体积百 分比0-20100-0Of 10020-300100检测器：检测波长265 nm记录吸光度到达最大值的50%时的时间toj(图 2 245-4)<0 5FineFigure 2.2.46.4DfXF圮=% 5-t 七预没为20 minF为流速，单位为ml/min对称因子A色诺峰的对称因子(图

16、2246-5)按卜.式计 算A=尝I 2dW005表示在二十分之一峰高处峰宽d表示二十分之一峰高处到峰顶点投射到水 平线之间的距离A,值为1表示峰绝对对称，大于1则为拖尾 峰，小于1则为前置峰5 _一Figure 2.2 46.-5分离度R.两组分之间的分离度(2146-1)计算公式 如下tR!和tjc是色谱峰的保留时间Wh!和Wh2是半高峰宽在定量平面色漕中，用移动距离代替保留时间来计算两组分之间的分离度，计算公式如T：皿=i.Ma丝M电Rfi和R口是色谱峰的阻滞因子WM和Wh2是半高峰宽a是溶剂前沿到基线的距离峰谷比(p/v)做有关物质的系统适应性测试时，如果两峰 之间的基线分离效果不好，

17、可以用峰谷比作 为评价依据(图2.246-6)0p/v = p/v*Hp表示基线以上最小峰的最高点到基线的 距离Hr表示基线以上最小峰和主峰之间的最低 点到基线的距离在平面色谱中,用滞留因子RFjtfflRF1代替保留时间tpst和tRj信噪比(S/N)小的噪音峰会影响定最分析的精密度。信噪比计算公式如下：S/N=当nH表示组分的峰高，在参比溶液的色谱图中, 测星从信号峰的最高点到基线之间的距离。 该信号峰的峰宽至少大于半高峰宽的5倍(图 2.2.46-7 )oh表示色谱图中噪音峰的最高点到最低点之 间的距离系统重现性系统重复性表示至少连续进样三次后，所得 相村标准偏差的百分数。计算公式如下：

18、yi表示内部标准方法中的峰面积、峰高或若 而枳比的值y表示平均值n表示值的个数Figuie 2.2.46.SFiguiv 22.46.-7.相对保留因子T相对保留因子的计算公式如Rr =Vst+W鼠表示待测峰的保留时间表示参照峰的保留时间H表示滞留时间未调整相对保留因子K计算公式如卜.：七=关除北另有规定，相对保留因子和未调整的相 对保留因子的值基本一致系统适应性用于测试的成分应该明确，能满足系统性能 和含量测定的要求。系统适应性测试反映了色谱系统的性能，是 建立分析方法不可或缺的一部分。柱效、保 留因子、分离度、相对保留因子和对称因子 等参数用来描述柱子的性能。这些参数可能 从以下方而影响色

19、谱行为： 流动相的组成、离子强度、温度和pH 值- 流速、色谱柱尺寸、柱温和柱压- 固定相特性，包括填充剂类型、填充剂 粒径、孔径、比表面积反相材料类型或者对固定相表面进行 其它的结构修饰除非另有规定，还需满足以卜要求：- 在相关物质测定或含量测定中，用于定 园的参照色谱峰，其对称因子取值范围 必须在0 8到15之间- 如果某成分的纯度为100%,则可容许 的参比溶液的相对标准偏差最大值计 算公式如下：e （%）= KB 而Sy '/o' max【90%. n-1K是常数0 349,由公式K=?x瞽计算 V2 y6而来，裟表示当B = 1。时，六次进样后的相对标准偏差百分数B表

20、示方法中规定的含景上限减去100%n表示进样次数（3< n <6）戚加】表示双侧检验、置信度为90%、自由 度为n-1时的t值除TF另有规定，可允许的相对标准偏差最大 值不能超过下表（表2 2 46-1）的值，此规 定不透用于有关物质测试。表2 2.46-1重复性要求进样次数3456B (%)最大容许标准偏差200410.590.730.852 50520310921 06300 620 891 101 27测试有关物质时，定晨限度与此表相等或小 于表中数值测试员要根据些致变因素来选择合适的 方案验证色谱系统，以保证在测试过程中色 谱系统的适应性不受影响。色谱条件的调整为满足系统适

21、应性，在不对分析方法做根本 改变的情况下，可对色谱参数做适当调整。 在梯度洗脱时，改变洗脱条件会导致基线漂 移，不利于色谱峰的划分识别，甚至会出现 假峰和延长洗脱时间。因此要改变梯度洗脱 的条件时，需重新验证方法的有效性。 系统话应性是定性分析或含鼠测定结果的 有效保障。市竹液相色谱柱的固定相材料类 型多样，可满足不同色谱行为需要，为满足 系统适应性要求，可对色谱条件做适当调整。 但是在反相色谱系统中，调整色谱参数不能 总是达到既定要求，这时可选择替换色谱柱。 网站EDQM上有各种柱子的性能信息，可 根据分析需要选择合适的色谱柱。一般文件会明确规定一些重要参数以满足 系统适应性。薄层色谱和纸色

22、谱展开剂的组成：对其中较少的组分，调整范 围为相对差值±30%或绝对差值±泓，可选 其中较大的-种，但任何组分的绝对差值不 得超过±10%。例如含量为10%的组分，按 相对差值±3次计算其可调范困在7%-13%, 按绝甘专值±2%计算可调范围在 固诃按相对差值计算的范围来调整。假如- 组分含量为5%,按相对差值计算其可调范 围在3 5-6.5%,按绝对差值计算其可调范困 在3-7%,巧时可按绝对差值范围调整，但 是改变范围绝对不能超过10%。除非另有规定，流动相水相pH值可调范困 在±0 2个单位，非离子溶剂可调范围在±1

23、个单位。缓冲溶液中的盐浓度可调范围在±10%。点样体积：如果薄层板或层析纸的粒度良好 （2-10呻），点样体积可为规定的10-20%液相色谱：等度洗脱流动相组成：对其中较少的组分，调整范困 为相对差值±30%或绝对差值±泓，可选其 中较大的一种，但任何组分的绝对差值不得 超过±10%。除非另有规定，流动相水相pH值可调范闱 在±02个单位，非离子溶剂可调范围在±1 个单位。缓冲溶液中的盐浓度可调范围在±10%。流速：一般可在±50%范围内调整，如果改 用大尺寸的柱子，调整范围可适当加大。 色谱柱参数 固定相： 不能

24、改变固定相填料类型（例如不能用 C8柱替换C18柱）- 粒径：最多订将粒径减小到原来的50%,但是不能增加填料粒径色谱柱尺寸： 长度：可调范闱±5次 内径：可调范困±25%如果色谱柱尺寸改变，流速也需按以卜.公式 做适当调整：FT帝Fi：方法中规定的流速，单位ml/minF2：改变后的流速，单位ml/min h：方法中规定的柱长，单位mm b：改变后的柱长，单位mm di：方法中规定的柱内径，单位mm d2：改变后的柱内径，单位mm柱温：±10°C，除非另有说明，操作时的柱 温需明确规定检测波长：不能改变进样体枳：在满足检测限和重现性的情况下 可减少进样

25、体枳，但不能增加进样体积 液相色谱：梯度洗脱梯度洗脱不像等度洗脱，要改变洗脱条件的 话需要慎重考虑流动相：只有在满足卜列条件时才可对流动 相组成做微小调整： 满足系统诂应性要求主峰的洗脱时间改变范围不超过方法 中规定的±15% 改变后的流动相洗脱能力不能比方法 中规定的差如果改变条件不能满足系统适应性要求，则 需考虑滞留体积和换色谱柱滞留体枳：实验仪器的布屋能显著改变分离 度、保留时间和相对保留时间等。如有此情 况，可能是滞留体积过大。在开始梯度洗脱 程序之前，会有一段等度洗脱过程。考虑到 规定的方法与实际使用方法中的滞留体积 有差异，何在等度洗脱时调整开始梯度洗脱 的时间。测试员有

26、责任使等度洗脱时间话应 所用的分析仪器。如果方法中规定了滞留体 枳，梯度洗脱的开始时间可根据卜面公式换 成实际开始时间：L = t罕D：滞留体积，单位mlDo：实际滞留体积，单位mlF：流速，单位ml/min如果没有等度洗脱这个步骤也不影响数据的有效性，那么此步骤可以省略流动相pH,不能改变缓冲液盐浓度：不能改变流速：色谱柱尺寸改变时可改变流速（公式见前面）色谱柱参数固定相：- 不能改变填料类型- 不能改变粒径大小色诺柱尺寸：- 长度：可调范围±70% 内径:可调范围±25%如果色谱柱尺寸改变，流速也需按以卜公式做话当调整：F? = FiFi：方法中规定的流速，单位ml/m

27、inF2：改变后的流速，单位ml/min11：方法中规定的柱长，单位mm12：改变后的柱长，单位mm由：方法中规定的柱内径，单位mmdj：改变后的柱内径，单位mm柱温：±5°C,除非另有说明，操作时的柱温需明确规定检测波长：不能改变进样体枳：在满足检测限和重现性的情况卜可减少进样体积，但不能增加进样体积气相色谱色谱柱参数固定相：- 粒径：（填充柱）最多可减少50%,不能 增大粒径尺寸- 薄膜厚度：（毛细管柱）可调范围从-5 0%到 +100%色谱柱尺寸：- 长度：可调范W±7（M- 内径：可调范围±50%流速：±50%柱温：±10%进样体枳和分流体积：住满足检测限和市.现性的情况下可做适当调整超临界流体色谱流动相组成：填充色谱中，对其中较少的组 分，调整范围为相对差值±30%或