土壤中产淀粉酶菌株的分离纯化及鉴定

1、土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一实验目的1 掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。2 进一步掌握和熟练无菌操作技术。3 掌握分离纯化微生物的方法。4 学习和掌握高活力淀粉酶具菌株的筛选方法及原理。二实验原理在土壤中从在多种可产淀粉酶的菌种，并且芽抱杆菌是不错的菌种， 因此，采集土样，对土壤中的芽抱杆菌进行分离纯化，就可得到理想菌株。 在菌株的初选过程中采用涂布平板法，把配好的培养基灭菌后倒成平板， 再把稀释好的土样涂布到平板上， 置于适宜的条件下进行培养。24h后对其 进行鉴定，鉴定的方法是在培养好的菌株上滴加碘液，周围出现透明圈的 为产淀粉酶的菌株，并且透明圈与菌落

2、直径的比值越大，说明菌种越纯或 菌株的生产性能越高。然后再进行复选，复选时采用平板划线法或斜面划 线法，挑取的菌落为透明圈与菌落直径比值较大的，进行多步筛选就可得 到较纯的菌株。枯草芽抱杆菌能产生淀粉酶，因此昆仑生化公司淀粉酶生 产车间周围采集的土壤稀释，再用涂布平板法对菌株进行初步培养，在培 养出的菌落周围滴淀粉溶液，对周围出现透明圈的菌落在进行平板划线培 养，在地如淀粉溶液鉴定，对周围出现透明圈的菌落进行斜面划线培养， 就可得到较纯的产淀粉酶的菌株。三实验器材与材料3.1实验仪器：培养皿20个（8个做菌株的培养，其余的做筛选及分离纯化）、三角瓶（250ml 3 个，100ml 6个）、试管

3、14支（8支稀释时用，6支做斜面）、移液管14支（稀释样液）、 100ml量筒、吸耳球、涂布棒、玻璃棒、酒精灯、接种环、烧杯等。高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、无菌操作台、恒温水浴锅、摇床、电炉、天平等。3.2实验材料：1. 固体培养基配制：可溶性淀粉2%蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、琼脂条 20g、水 1000ml。2. 液体培养基配制：蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、水1000ml3.3 :其它棉花、棉绳、纱布等3.4 土壤采集：采土样地点选好后，用小铲子去除5厘米表土，取离地面5-15厘米的土样10-25g， 盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，并标注时间及地点土样采集时间：2012

4、年5月12日土样采集地点：甘肃省张掖市昆仑生化公司淀粉生产车间周围四实验步骤4.1 实验流程：配制培养基f 土样米集f制备菌悬液f菌株的初选（涂布平板）f鉴定f平板划线纯化f选育f筛选高产淀粉酶菌株4.2初选：4.2.1淀粉培 养基 的配制分别称取可溶性淀粉12g、蛋白胨6g、氯化钠3g、牛肉膏1.2g、琼脂条12g，放 入烧杯中，用自来水定容至 600ml，加热使之全部溶解（琼脂条用剪刀剪碎后加入） 后装入三角瓶中。4.2.2灭菌将准备好的8支试管（装有9ml自来水）、移液管、涂布棒、培养皿等包扎好，与 配制好的淀粉培养基一起放入灭菌锅中在120C高压下灭菌20min。4. 2.3倒平板将灭

5、完菌的培养基放置于无菌工作台（紫外灯照射 30min）上，待冷却到55C左 右后（不烫手即可），在酒精等下，倒入灭菌后的平板中，每个平板中约 15-20ml，之 后待冷却凝固。4. 2.4菌悬液的配制：将采集好的土样称取10.0g，装入盛有90.0ml无菌水，含有3至5粒玻璃珠的三 角瓶中，放在150转的摇床上20min后静置至上清液澄清，上清液进行下一步稀释。4. 2.5 菌悬液浓度的稀释：取1ml上清液加入装有9ml无菌水的试管中，摇匀，然后依次取 1ml加入下一个 试管中，依次稀释到10-8，待用。4. 2.6 涂布平板：用移液管分别在10-5、10-6、10-7、10-8浓度梯度下各取

6、0.2ml 土壤稀释液倒入已冷 却的平板中，用涂布器涂布均匀，在平板上标注土样的浓度。把标注好的培养皿倒置 放入37 °C的恒温培养箱中培养24 h 。4.3分离、纯化在无菌工作台上，向培养了 24小时的培养皿中加入碘液，观察菌落的形态，由于 产淀粉酶菌株菌落周围有明显的透明圈，所以可得到产淀粉酶菌株。用灭过菌的接种 针挑菌株周围出现透明圈的菌落于新的培养基上划线，标注。重复以上步骤3次，以得到较纯的菌株。4.4菌落的形态观察及革兰氏染色将纯化的菌株进行制片，在显微镜下观察菌落的形态并进行细菌的革兰氏染色， 判断菌体是革兰氏阳性菌还是阴性菌。4.5菌体及菌落直径测量将纯化好的菌株用接

7、种针进行点种，然后培养24h。再在无菌操作台上向点种的平板上加入碘液，观察，然后用毫米刻度尺测量菌体的直径以及菌落透明圈的直径， 并进行计算记录。4.6保存菌种在无菌工作台下，将纯化后的菌株用灭过菌的接种环挑去后在试管斜面上划线， 包扎。培养24小时候后放在4 C的冰箱中保存，以备下次实验使用。五高活力淀粉酶菌株的筛选5.1菌悬液的配制：取出保存菌株的试管，挑选生长较好的菌株，向里面加入无菌水5ml，用接种针轻轻挑取菌落，将液体倒入盛有无菌水的100ml三角瓶中（内装有玻璃珠），洗脱3次，定容至50ml。放置在摇床上震荡20min。5.2接种将菌悬液按5%的接种量接入装有 20ml的不加琼脂的

8、液体培养基中，培养2h。5.3计数取液体培养基中的菌液稀释，取稀释好的菌悬液 0.2ml制成片在显微镜下选择一 定区域数出总的细菌数。随机选择三片区域进行选择，分别数出这三片区域的细菌数。 5.5鉴定将配置好的质量分数为2%淀粉溶液中加入离心后的上清液 1ml,于37 C水浴10 min然后沸水浴5 min，终止反应，再加入,2ml碘液，沸水浴5 min后，迅速冷却观 察颜色。，同时也在2%淀粉溶液中加入2ml碘液作为对照，按上步奏反应。与对照 比较观察颜色变化较大的说明酶活力较高。反之亦然。六实验结果待做七实验评估在自然界的土壤中存在能产生淀粉酶的芽抱杆菌，通过土样稀释、加热土样悬 液、杀死

9、非芽抱细菌、平板分离可获得疑似芽胞杆菌的单菌落，将单菌落点接含有淀 粉的平板，具有产淀粉酶能力的芽抱杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀 粉平板上菌落周围也会出现水解圈，但肉眼不易分辨，用碘液染色法染色后显现出透 明圈，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。由此可将产淀粉酶能力的菌株分离。透明 圈与菌落直径比值的大小在一定程度上反映了菌落纯度和产淀粉酶的活力 菌株产生淀粉酶的能力：前者与后者的比值越大，表明分泌的淀粉酶越多，水解淀粉 的能力也就越强。在菌落的初选过程中可在培养基上长出大量各种各样的菌落，经过初步鉴定，可大致选出产淀粉酶的菌落，在平板划线时，把平板分四区，达到逐步稀释的效果，第

10、一区的菌落密度较稠，随着逐渐的稀释，在第四区可能会出现单菌落，经过再次鉴定 后，在线面划线挑取菌落时，尽可能的挑取透明圈直径与菌落直径比值较大的单菌落， 这样可以得到较纯的菌株。八注意事项1、在操作过程中，必须保证为无菌操作，避免造成污染。2、分离纯化时尽量选择单菌落进行纯化。3、鉴定中的冷却必须是迅速冷却，减少误差。九参考文献1 宋欣,微生物酶转化技术M.北京：化学工业出版社，2004: 13,17,158-159.2 王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学M.北京：高等教育出版社.2002.9(第三 版)：42-44.3 胡欣洁，邓斌，胡承.微生物a淀粉酶的研究进J.中国防伪2005.9:58-

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