分子生物学研究技术(理论)

1、分子生物学研究技术朱国辉一般认为一般认为1973年是基因工程诞生的元年。年是基因工程诞生的元年。上世纪上世纪40年代年代70年代初分子生物学领域年代初分子生物学领域理论理论上的三大发现上的三大发现和和技术上的三大发明技术上的三大发明对于基因工程对于基因工程的诞生起到了决定性的作的诞生起到了决定性的作。第一节第一节 基因工程的诞生基因工程的诞生1944年，年，Avery O.T.利用肺炎双球菌转化实验利用肺炎双球菌转化实验1、DNA是遗传物质被证实是遗传物质被证实理论上的三大发现理论上的三大发现40年代，证实年代，证实DNA是遗传物质是遗传物质 早在上世纪早在上世纪20年代，已经知道染色年代，已

2、经知道染色体由体由DNA和组蛋白构成，但组成蛋白和组蛋白构成，但组成蛋白的的氨基酸有氨基酸有20种种，而组成，而组成DNA的的核苷核苷酸只有酸只有4种种，什么是遗传物质？，什么是遗传物质？ 1928年，英国微生物学家年，英国微生物学家F. Griffith著名的肺炎双球菌感染小白鼠著名的肺炎双球菌感染小白鼠实验。实验。 （1）S型：注射小白鼠，死亡。型：注射小白鼠，死亡。 （2）S型，型，65 加热：注射小白加热：注射小白鼠，活。鼠，活。 （3）R型：注射小白鼠，活。型：注射小白鼠，活。 （4） 65 加热加热S型型+R型：注射小型：注射小白鼠，死亡。死鼠体内得到了白鼠，死亡。死鼠体内得到了S

3、型菌。型菌。 40年代，年代，DNA是遗传物质被证实是遗传物质被证实1944年，美国洛克菲勒研究所的年，美国洛克菲勒研究所的Oswald Avery等公等公开发表了改进的肺炎双球菌实验结果。开发表了改进的肺炎双球菌实验结果。 （1） S型菌无细胞提取物及其型菌无细胞提取物及其纯化的纯化的DNA都可都可使使R型菌转变成型菌转变成S型菌；型菌； （2）经）经DNase 处理的处理的S型菌无细胞提取物失去型菌无细胞提取物失去了转化作用。了转化作用。 （3）经）经胰蛋白酶胰蛋白酶处理的处理的S型菌无细胞提取物仍型菌无细胞提取物仍有转化作用。有转化作用。 不仅证实了不仅证实了DNA是遗传物质，而且证明了

4、是遗传物质，而且证明了DNA可以将一个细菌的性状转给另一个细菌，他的工作可以将一个细菌的性状转给另一个细菌，他的工作被称为是被称为是现代生物科学的革命性开端现代生物科学的革命性开端。Watson 和和Crick2、DNA双螺旋模型的提出双螺旋模型的提出50年代，年代，DNA的双螺旋模型的提出的双螺旋模型的提出和和DNA复制机理的阐明复制机理的阐明 DNA是遗传物质已被证实，但是是遗传物质已被证实，但是DNA是怎样携是怎样携带并传递遗传信息的？在细胞增殖过程中，带并传递遗传信息的？在细胞增殖过程中，DNA是是怎样复制的？因此，对于怎样复制的？因此，对于DNA结构的研究成为了当结构的研究成为了当时

5、生物学家研究的热点。时生物学家研究的热点。 1953年，年，Francis Crick和和James Watson搜集了搜集了力所能及的资料，提出了力所能及的资料，提出了DNA的双螺旋模型。的双螺旋模型。随后，随后，DNA的的半保留复制半保留复制和和半不连续半不连续复制机理也被阐明，复制机理也被阐明，为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础。为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础。 Nireberg等为代表的等为代表的一批科学家一批科学家3、“中心法则中心法则”的提出的提出60年代，确定了遗传信息的传递方式年代，确定了遗传信息的传递方式（中心法则）（中心法则） 既然，既然，DNA是遗传信息的载体，那

6、么它是如何传递遗传是遗传信息的载体，那么它是如何传递遗传信息的呢？遗传信息又是如何控制生物的表型性状的呢？信息的呢？遗传信息又是如何控制生物的表型性状的呢？以以Nireberg等为代表的一批科学家等为代表的一批科学家经过艰苦的努力，确定了经过艰苦的努力，确定了遗传信息以密码方式传递，每三个核苷酸组成一个密码子，遗传信息以密码方式传递，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸，到代表一个氨基酸，到1966年，全部破译了年，全部破译了64个密码子，个密码子，并提并提出了遗传信息传递的出了遗传信息传递的“中心法则中心法则”。 Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶等分离并纯化了限制性核酸内切酶H

7、ind II， 1972年，年，Boyer等相继发现了等相继发现了coR I 一类重要的限制性内切酶。一类重要的限制性内切酶。 1、限制性核酸内切酶的发现和应用、限制性核酸内切酶的发现和应用技术上的三大发明技术上的三大发明1967年，世界上又五个实验室几乎同时发现年，世界上又五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，特别是连接酶，特别是1970年年Khorana等发现的等发现的T4 DNA连接酶具有更高的连接活性。连接酶具有更高的连接活性。2、DNA连接酶的发现和应用连接酶的发现和应用1972年，美国年，美国Stanford大学的大学的P. Berg 等首次成功地实现了等首次成功地实现了DNA的体外

8、重组；的体外重组；3、载体的发现及其应用、载体的发现及其应用1973年，年，Stanford大学的大学的Cohen等成功地利用体外重组实等成功地利用体外重组实现了细菌间性状的转移。现了细菌间性状的转移。这一年被定为基因工程诞生的元年。这一年被定为基因工程诞生的元年。3、载体的发现及其应用、载体的发现及其应用CohenCohen等的重组实验示意图等的重组实验示意图TcrNerEco RIEco RI连接酶连接酶TcrNer双抗重组菌落双抗重组菌落基因工程发展史上首次实现了重组基因工程发展史上首次实现了重组DNA的细菌转化的细菌转化基因工程研究的基本步骤基因工程研究的基本步骤1 1、从生物体中分离

9、得到目的基因（或、从生物体中分离得到目的基因（或DNADNA片段）片段）2 2、在体外，将目的基因插入能自我复制的载体中得到、在体外，将目的基因插入能自我复制的载体中得到 重组重组DNADNA分子。分子。3 3、将重组、将重组DNADNA分子导入受体细胞中，并进行繁殖。分子导入受体细胞中，并进行繁殖。4 4、选择得到含有重组、选择得到含有重组DNADNA分子的细胞克隆，并进行大量分子的细胞克隆，并进行大量 繁殖，从而使得目的基因得到扩增。繁殖，从而使得目的基因得到扩增。5 5、进一步对获得的目的基因进行研究和利用。比如，、进一步对获得的目的基因进行研究和利用。比如， 序列分析、表达载体构建、原

10、核表达以及转基因研究序列分析、表达载体构建、原核表达以及转基因研究 和利用等。和利用等。基因工程的基本流程基因工程的基本流程基因分基因分离酶切离酶切载体酶切载体酶切基因和载基因和载体连接体连接导入细菌导入细菌重组质粒繁殖重组质粒繁殖重组克隆的选择重组克隆的选择序列分析和基序列分析和基因表达等研究因表达等研究导入导入植物植物细胞细胞第二章第二章 基因操作的工具酶基因操作的工具酶第一节第一节 限制性核酸内切酶及其应用限制性核酸内切酶及其应用第二节第二节 DNA连接酶及其应用连接酶及其应用第三节第三节 DNA聚合酶及其应用聚合酶及其应用Genetic engineering is largely a

11、n exercise in carefully controlled enzymology. A variety of enzymes form the basic toolkit of the genetic engineer. 1、限制性核酸内切酶的分类合命名、限制性核酸内切酶的分类合命名2、II型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性3、限制性核酸内切酶的消化反应、限制性核酸内切酶的消化反应第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的概念限制性核酸内切酶的概念已经从近已经从近300中微中微生物中分离出了生物中分离出了500余种限制性核酸内切酶。余种限制

12、性核酸内切酶。限制性核酸内切酶的分类限制性核酸内切酶的分类1. 限制修饰活性限制修饰活性2. 内切酶的蛋白内切酶的蛋白 质结构质结构3. 限制辅助因子限制辅助因子4. 切割位点切割位点5. 特异性切割特异性切割6. 基因克隆中基因克隆中 I 型型单一多功能的酶单一多功能的酶3种不同亚基种不同亚基ATP、Mg2+和和S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸距特异性位点距特异性位点1000bp不是不是无用无用 II 型型限制酶和修饰酶分开限制酶和修饰酶分开单一成分单一成分Mg2+特异性位点及其附近特异性位点及其附近是是非常有用非常有用 III 型型双功能酶双功能酶2种亚基种亚基ATP、Mg2+和和S-腺苷甲硫

13、氨酸腺苷甲硫氨酸特异性位点特异性位点3端端24-26bp处处是是有用有用限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体个斜体 字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichia coli 表示为表示为Eco , 流感嗜血菌流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示为表示为 Hin；2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind；3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，

14、则如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则 用罗马数字标出，比如用罗马数字标出，比如Eco R I、 Hind III。IIII型限制性核酸内切酶的型限制性核酸内切酶的3 3大特点大特点1、识别位点的特异性、识别位点的特异性 每种酶都有其特定的每种酶都有其特定的DNA识别识别 位点，通常是由位点，通常是由4、5、6或或7个核苷酸组成的特定序个核苷酸组成的特定序 列（靶序列）。列（靶序列）。2、识别序列的对称性、识别序列的对称性 靶序列通常具有双重旋转对称靶序列通常具有双重旋转对称 的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。3、切割位点的规范性、切割

15、位点的规范性 双链双链DNA被酶切后，分布在两被酶切后，分布在两 条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平 末端的末端的DNA分子）。分子）。与与II型核酸内切酶有关的几个概念型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端粘性末端 cohesive ends 因酶切位点在两条因酶切位点在两条DNADNA单单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很容易容易通过通过互补碱基的配对而重新互补碱基的配对而重新连接连接起来。起来。平平 末末 端端 B

16、lunt end Blunt end 因酶切位点在两条因酶切位点在两条DNADNA单链单链上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易不易重新重新连接连接起来。起来。几种几种IIII型限制性核酸内切酶的酶切位点型限制性核酸内切酶的酶切位点Pst IProvindencia stuartii 164 CTGCAGGACGTCHaemophilus influenzae Rd 一个酶单位一个酶单位（U）指：指：在理想的反应条件（适宜的在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为缓冲液和反应温度，通常为37）下，）下，50 L反应体系反应体系中完全

17、降解中完全降解1 g DNA所需要的酶量。所需要的酶量。影响酶活性的因素很多，最重要的有：影响酶活性的因素很多，最重要的有：A. DNA的纯度和甲基化程度的纯度和甲基化程度B. 甘油的含量（不超过甘油的含量（不超过5%）C. 反应体系中的离子强度反应体系中的离子强度D. 反应体系的反应体系的pH值值F. 反应的温度条件反应的温度条件 （通常为（通常为37 ）酶单位的定义和影响酶活性的因素酶单位的定义和影响酶活性的因素Buffer (10X) 2.0 LWater 16.5 LDNA 1.0 LEnzyme 0.5 LVolume 20.0 L 酶酶 切切 反反 应应 的的 基基 本本 步步 骤

18、骤电泳紫外分析37 1h加反应液CKMBuffer (10X) 2.0 LWater 16.5 LDNA 1.0 LEnzyme 0.5 LVolume 20.0 L 1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT1、DNA连接酶作用的特点连接酶作用的特点2、DNA连接酶的反应条件连接酶的反应条件第二节第二节 DNA连接酶及其应用连接酶及其应用DNA连接酶作用的特点连接酶作用的特点A. A. 连接的两条链必须分别具有连接的两条链必须分别具有 33端自由羟基（端自由羟基（-OH-OH） 和和5 5 端磷酸基团（端磷酸基团（-P-P），），而且只有这两个基团彼而且只有这两个基团彼 此

19、相邻时才能进行连接反应；此相邻时才能进行连接反应；B. B. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过 程，因此连接反应必须有能量分子的参与，通常有程，因此连接反应必须有能量分子的参与，通常有 两种能量分子，即两种能量分子，即ATPATP和和NAD+NAD+。OKNODNA连接反应的条件连接反应的条件 连接反应最佳温度为连接反应最佳温度为3737，但是此时粘性末端间氢键结合不，但是此时粘性末端间氢键结合不够稳定，而且酶活性也会迅速降低够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如，比如，EcoRIEcoRI 粘性末端连接粘性末端连接部位只有部位只有4 4个

20、碱基对，很容易断开。所以个碱基对，很容易断开。所以通常在通常在4-164-16连接。连接。影响连接效率的因素有：影响连接效率的因素有：A. A. 温度（最主要的因素）温度（最主要的因素）B. ATPB. ATP的浓度的浓度( 10 M - 1 M )C. C. 连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）D. D. 反应时间（通常连接过夜）反应时间（通常连接过夜）E. E. 插入片段和载体片段插入片段和载体片段 的摩尔比的摩尔比转化4 过夜加反应液CK-重组菌落重组菌落CK+粘性末端粘性末端DNA片段的连接片段的连接NickNick1、大肠杆菌、大肠杆菌DNA聚合酶

21、聚合酶I2、Klenow片段片段第第三节三节 DNA聚合酶及其应用聚合酶及其应用 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I （E。Coli DNA pol I）是）是Kornberg A. 1956年首先从大肠杆菌年首先从大肠杆菌E。Coli 细胞中分离出来的。它是一细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括种多功能性的酶，包括 3 3种不同的酶活力：种不同的酶活力：A. 5- 3聚合酶活性聚合酶活性 以双链以双链DNA为模板，催化单核苷酸结合到引为模板，催化单核苷酸结合到引物的物的3末端，并不断延伸。末端，并不断延伸。B. 5- 3外切酶活性外切酶活性 将双链将双链DNA中中游离的游离的5末端

22、逐个切去。末端逐个切去。C. 3 - 5外切酶活性外切酶活性 将游离的双链或单链将游离的双链或单链DNA的的3端降解。不过端降解。不过对于双链的降解可被对于双链的降解可被5-3的多聚活性所抑制。的多聚活性所抑制。CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPol I + Mg2+ATAGCCTCCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTACCGATAGCCTGGCTATCGGAPol I + Mg2+CCGATAGCCTGGCTAPol I + Mg2+T1、大肠杆菌、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I2、Klenow片段片段第第三节三节 DNA聚合酶及其应用聚合酶及

23、其应用 Klenow片段的主要用途片段的主要用途KlenowKlenow片段片段大肠杆菌聚合酶大肠杆菌聚合酶 I I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，它仍然有的大片段酶分子，它仍然有5353的聚合酶活性和的聚合酶活性和3 3 5 5 的核的核酸外切酶活性，但失去了酸外切酶活性，但失去了5353的外切酶活性。的外切酶活性。KlenowKlenow片段的主要用途片段的主要用途A.A. 修补限制性酶消化修补限制性酶消化DNADNA形成的形成的33隐蔽末端隐蔽末端B.B. 标记标记DNADNA片段的末端片段的末端C.C. cDNAcDNA克隆中第二链克隆中第

24、二链cDNAcDNA的合成的合成D.D. DNADNA序列的测定序列的测定GAACTTAA第三章第三章 基因克隆的载体基因克隆的载体引引 言（言（introduction）第一节第一节 质粒载体（质粒载体（plasimid vectors）第二节第二节 噬菌体载体（噬菌体载体（phage vectors）第三节第三节 柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（cosmid vectors） 第四节第四节 人工染色体载体（人工染色体载体（B/Y/HAC）引引 言言基因克隆的本质基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到是使目的基因在特定的条件下得到扩扩增和表达增和表达，而目的基因本身无法进行复制，所以，而目

25、的基因本身无法进行复制，所以就必须借助于就必须借助于“载体载体”及其及其“寄主细胞寄主细胞”来实现。来实现。作为基因克隆的载体必须具备以下特性：作为基因克隆的载体必须具备以下特性：A. 能在寄主细胞中进行独立的复制和表达；能在寄主细胞中进行独立的复制和表达；B. 具有具有1-2个选择标记基因，如对抗生素的抗性基因等；个选择标记基因，如对抗生素的抗性基因等；C. 具备多克隆位点（具备多克隆位点（MCS），），而且可携带外源而且可携带外源DNA片段的长片段的长度范围较宽。度范围较宽。D. 自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易于操作和自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易于操作和DNA的制

26、备。的制备。Characteristics of vectors for gene Characteristics of vectors for gene cloningcloningMCSMarkerForeign gene第三章第三章 基因克隆的载体基因克隆的载体引引 言（言（introduction）第一节第一节 质粒载体（质粒载体（plasimid vectors）第二节第二节 噬菌体载体（噬菌体载体（phage vectors）第三节第三节 柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（cosmid vectors） 第四节第四节 人工染色体载体（人工染色体载体（B/Y/HAC）第一节第一节 质粒载体

27、质粒载体（plasimid vectors）1、质粒载体的生物学特性、质粒载体的生物学特性2、质粒载体相关知识介绍、质粒载体相关知识介绍1.1.质粒载体的生物学特性质粒载体的生物学特性（1）质粒质粒是是一种广泛从在于细菌细胞中一种广泛从在于细菌细胞中染色体以染色体以 外外的能的能自主的复制自主的复制的裸露的的裸露的环状双链环状双链DNADNA分子，比病毒更分子，比病毒更简单。在霉菌、蓝简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动藻、酵母和一些动植物细胞中也发现植物细胞中也发现了质粒，目前对细了质粒，目前对细菌的质粒研究得比菌的质粒研究得比较深入，特别是大较深入，特别是大肠杆菌的质粒。肠杆菌的质粒。1.1.

28、质粒载体的生物学特性质粒载体的生物学特性（2）质粒的大小质粒的大小差异很大差异很大，最小的只有，最小的只有1kb,1kb,只能只能 编码中等大小的编码中等大小的2-32-3种蛋白质分子，最大的达到种蛋白质分子，最大的达到 200kb200kb。（3）质粒的生存质粒的生存在寄主细胞中在寄主细胞中“友好友好”地地“借借居居”，离开了寄主它本身无法复制，它可以赋，离开了寄主它本身无法复制，它可以赋予予 寄主一些非染色体控制的遗传性状，以寄主一些非染色体控制的遗传性状，以利于寄利于寄 主的生存。比如，对抗菌素的抗性，对重金属主的生存。比如，对抗菌素的抗性，对重金属 的抗性等。的抗性等。1.1.质粒载体

29、的生物学特性质粒载体的生物学特性（4）质粒的复制类型质粒的复制类型一种质粒在宿主细胞中存一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的在的数目称为该质粒的拷贝数拷贝数。据拷贝数将质粒分为。据拷贝数将质粒分为两种复制型：两种复制型：“严紧型严紧型”质粒质粒（stigentstigent plasmid plasmid）, ,拷贝数为拷贝数为1-31-3；“松弛型松弛型”质粒（质粒（relaxed plasmidrelaxed plasmid）, ,拷贝数为拷贝数为10-6010-60。不过，即使是同一质粒，其拷贝数在。不过，即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间也可能有很大的变化。不同的寄主细胞

30、间也可能有很大的变化。（5）质粒的不亲和性质粒的不亲和性两种亲缘关系密切的不同两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。1.1.质粒载体的生物学特性质粒载体的生物学特性（6）质粒的存在形式质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种，线状双螺旋三种，双螺旋共价闭合双螺旋共价闭合环（超螺旋）环（超螺旋）开环双螺旋开环双螺旋（一个裂口）（一个裂口）线状双螺旋线状双螺旋（两个裂口）（两个裂口）第一节第一节 质粒载体质粒载体（plasimid vectors）1、质粒载体的生物学特性、质粒载体的生物学特性2、质粒载体相关知识介

31、绍、质粒载体相关知识介绍质粒：质粒：是一种裸露的双链闭环是一种裸露的双链闭环DNA分子，它们在寄主细胞中分子，它们在寄主细胞中能够独立地自我复制从而得到不断的繁殖。作为基因工程载体，能够独立地自我复制从而得到不断的繁殖。作为基因工程载体，质粒至少应该具备质粒至少应该具备复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点点等部分。等部分。多克隆位点多克隆位点：克隆载体中的一段用于插入外源克隆载体中的一段用于插入外源DNA片段的片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点应该在整

32、个载体中是唯一的。且每个限制性内切酶位点应该在整个载体中是唯一的。选择标记基因：选择标记基因：在基在基因工程中的一类用于选择因工程中的一类用于选择转化细胞（菌）的抗性基转化细胞（菌）的抗性基因，通常是一些抗生素抗因，通常是一些抗生素抗性基因，比如对氨苄青霉性基因，比如对氨苄青霉素、四环素、氯霉素、卡素、四环素、氯霉素、卡那霉素以及潮霉素等具有那霉素以及潮霉素等具有抗性的基因。这样，通过抗性的基因。这样，通过在培养基中加入特定的抗在培养基中加入特定的抗生素就可以选自得到转化生素就可以选自得到转化的细胞（菌）。的细胞（菌）。（1） -互补互补 (alpha-complementation) 大肠杆

33、菌大肠杆菌 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 可以和其底物可以和其底物X-Gal 相互作相互作用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的 -片段片段和和 -片片段段分开时就失去了这种显色的功能。通常将编码该酶分开时就失去了这种显色的功能。通常将编码该酶 -片段片段的的LacZ 基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中，而在一些人工构建的大肠杆菌株系中却只能编列中，而在一些人工构建的大肠杆菌株系中却只能编码产生该酶的码产生该酶的 片段片段。这样一来，含有功能性完整的。这样一来，含有功能性完整的LacZ 基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码基因

34、的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的的 -片段片段就能和寄主编码的就能和寄主编码的 片段片段发生互补并具有了发生互补并具有了对底物对底物X-gal的作用功能（发生显色反应），这种现象的作用功能（发生显色反应），这种现象被成为是被成为是 alpha-complementation.2. 质粒载体相关知识介绍质粒载体相关知识介绍 所以含有这类载体的菌落就很容易在含有底物所以含有这类载体的菌落就很容易在含有底物X-Gal和诱导物和诱导物IPTG的平板上分辨出来。因为这类菌落中的平板上分辨出来。因为这类菌落中释 放 出 的释 放 出 的 蓝蓝色 物 质 可 以色 物 质 可 以将 整 个 菌 落将

35、 整 个 菌 落染 成 蓝 色 ，染 成 蓝 色 ，非 常 容 易 辨非 常 容 易 辨别。别。2. 质粒载体相关知识介绍质粒载体相关知识介绍（2）PBR322 This is one of the earliest general purpose cloning vectors to be developed. It is a 4363 bp plasmid with two antibiotic resistance genes, for ampicillin and tetracycline. There are several unique restriction sites. pBR

36、322 generally does not give such a high yield of plasmid DNA as modern vectors such as pUC, pGEM and pBluescript2. 质粒载体相关知识介绍质粒载体相关知识介绍pBR3224363连接加反应液Tet or AmpTet + AmpCK+2. 质粒载体相关知识介绍质粒载体相关知识介绍思考题1.什么是限制性核酸内切酶，它们是怎样命名什么是限制性核酸内切酶，它们是怎样命名的？的？2.II型限制性核酸内切酶的基本特性有哪些？型限制性核酸内切酶的基本特性有哪些？3.什么是粘性末端、平末端？什么是粘性末端、平末端？4.酶的单位是怎样定义的，影响酶活性的因素酶的单位是怎样定义的，影响酶活性的因素有哪些？有哪些？5.DNA连接酶的作用特点有哪些？连接酶的作用特点有哪些？6.大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I 有哪些不同的酶活力有哪些不同的酶活力特性，各有何利用价值。特性，各有何利用价值。7.Klenow片段和大肠杆菌片段和大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I有何异有何异同？同？8.基因克隆的载体必须具备哪些特性？基因克隆的载体必须具备哪些特性？9.质粒载体的生物学特性有哪些？质粒载体的生物学特性有哪些？PCR技