基因工程的基本操作步骤PPT学习教案

1、会计学1基因工程的基本操作步骤基因工程的基本操作步骤基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定第1页/共41页一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因也有一些具有调控作用的因子也有一些具有调控作用的因子2 2、获取目的基因的方法、获取目的基因的方法（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPC

2、R技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成_第2页/共41页( (一一) )从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因 将含有将含有某种生物不同基因某种生物不同基因的许多的许多DNADNA片断，片断，导入到导入到受体菌的群体受体菌的群体中，各个受体菌分别含中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库有这种生物的不同基因，称为基因文库。2.2.基因文库的分类基因文库的分类: :种种类类基因组文库：基因组文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基基因因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，如：基因，如：cDNAcDNA文库文库第3页/共

3、41页限制酶限制酶拼接到载体上拼接到载体上导入受体细胞扩增导入受体细胞扩增 基因组文库基因组文库3 3. .基因文库的构建方法基因文库的构建方法第4页/共41页提取生物某发育时期的提取生物某发育时期的mRNAmRNA单单 链链DNADNA逆转录酶逆转录酶DNADNA聚合酶聚合酶双链双链C CDNADNA( (只含该生物部分基因只含该生物部分基因) )与载体连接导入到受体菌群储存与载体连接导入到受体菌群储存 cDNAcDNA文库文库第5页/共41页基因组文库和基因组文库和cDNAcDNA文库比较文库比较第6页/共41页原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构( (补充内容）补充内容）非编码区非编码区

4、非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子不编码蛋白质。不编码蛋白质。：编码蛋白质：编码蛋白质 , ,连续不间断连续不间断编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构调控遗传信息表达调控遗传信息表达, ,上上 游有启动子，下游有终止子游有启动子，下游有终止子第7页/共41页真核细胞的基因结构（补充内容）真核细胞的基因结构（补充内容）编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区

5、上游编码区上游 编码区下游编码区下游 真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用有调控作用, ,上游有启动子，下上游有启动子，下游有终止子游有终止子非编码序列：非编码序列： 包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子第8页/共41页原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区

6、编码区非编码非编码第9页/共41页第10页/共41页基因组文库和基因组文库和cDNAcDNA文库比较文库比较第11页/共41页依据：目的基因的有关信息依据：目的基因的有关信息如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻译产物蛋白质等特性基因翻译产物蛋白质等特性4.4.从基因文库中得到目的基因的方法从基因文库中得到目的基因的方法第12页/共41页概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、_、_

7、 _ 、 _ _ 、_ 原理：原理：_聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制模板模板DNA DNA 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸DNADNA引物引物热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶（二）（二）利用利用PCRPCR扩增目的基因扩增目的基因方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增为扩增循循 环的次数）环的次数）结果：结果：_指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内使目的基因的片段在短时间内大量大量扩增扩增第13页/共41页过程过程a a、变性、变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作

8、用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、复性、复性（复性复性55-6055-60）：系统温度降低，）：系统温度降低，引引 物与物与DNADNA模板结合模板结合，形成局部，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下，合成与模板互补的合成与模板互补的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链前提前提_ 有有一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列第14页/共41页蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序结构基因的核苷酸序列列推测推测推测推测目的基因目的基因化

9、学合成化学合成（DNADNA合成仪）合成仪）（三）人工合成（三）人工合成若基因若基因_，核苷酸序列，核苷酸序列_ _ ，可用此法。，可用此法。较小较小已知已知（化学合成法）（化学合成法）第15页/共41页mRNAmRNAcDcDNANA单链单链cDNAcDNA分子分子逆转录酶逆转录酶DNADNA聚合酶聚合酶（三）人工合成（三）人工合成（反转录法）（反转录法） 与直接提取的与直接提取的DNADNA相比相比cDNAcDNA不含有不含有_ 和和_等结构。等结构。第16页/共41页第17页/共41页a a、使目的基因在受体细胞中稳定存在、使目的基因在受体细胞中稳定存在 并遗传给子代并遗传给子代b b、

10、同时使目的基因能表达和发挥作用、同时使目的基因能表达和发挥作用1 1、基因表达载体的、基因表达载体的构建目的构建目的二二、表达载体的构表达载体的构建建第18页/共41页2 2、基因表达载体的组成：、基因表达载体的组成： 目的基因目的基因 标记基因标记基因 启动子启动子 终止子终止子第19页/共41页启动子：启动子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶识别和结合的部聚合酶识别和结合的部位，有了它才能位，有了它才能驱动基因转驱动基因转录出录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的位于基因的尾

11、端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，片断，能终能终止止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因的作用是的作用是为了为了鉴别鉴别受体细胞中是否含有目的基受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细因，从而将有目的基因的细胞筛选出来胞筛选出来第20页/共41页用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。3 3、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 D

12、NADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同 ( (插入式插入式) )第21页/共41页用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口

13、切口DNADNA连接酶连接酶相同相同用同种限制酶分别切割质粒和目的基因，使之用同种限制酶分别切割质粒和目的基因，使之露出相同的露出相同的黏性末端黏性末端，在加入，在加入DNADNA连接酶。连接酶。第22页/共41页三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法CaCa+ +处理法处理法第23页/共41页1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：

14、易感染双子叶植物和裸子植物，对大易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力多数单子叶植物没有感染能力原理：原理：农杆菌特点：农杆菌特点：（1）农杆菌转化法）农杆菌转化法TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可以转移到受体细胞可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的，并整合到受体细胞染色体的DNADNA上。上。第24页/共41页过程：过程：1、将目的基因插入到、将目的基因插入到Ti质粒的质粒的T-DNA上上2、将重组、将重组Ti质粒导入农杆菌质粒导入农杆菌3、用农杆菌感染植物体细胞、用农杆菌感染植物体细胞第25页/共41页（2 2）基因枪法）基因枪法第26页/共41页第

15、27页/共41页方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序：取卵取卵显微注射显微注射受精卵受精卵早期胚胎培养早期胚胎培养胚胎移植胚胎移植第28页/共41页3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞用用CaCa2+2+处理细处理细胞胞 原核生物特点：原核生物特点： 繁殖快、单细胞、遗传物质少繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：方法：表达载体与感受态细胞混合表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA分子分子感受态细胞感受态细胞第29页/共41页四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定大肠杆菌大肠杆菌第30页/共41页四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定个体水平的鉴定个体水平的鉴定第31页/共41页四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定个体水平的鉴定个体水平的鉴定（受体是否表现出相应性状）（受体是否表现出相应性状）第32页/共41页 含有目的基因含有目的基因 单链单链 标记标记放射性同位素或荧光放射性同位素或荧光第33页/共41页第34页/共41页第35页/共41页第36页/共41页第37页/共41页 第38页/共41页蛋白质工程是指以蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其蛋白质分子的结构规律及其与生物