蛋白质的分离纯化剖析

1、会计学1蛋白质的分离纯化剖析蛋白质的分离纯化剖析 主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。蛋白质，但分辨率低。1 1、粗分级分离、粗分级分离l 不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不化

2、层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如：不同的蛋白质分别沉淀。如：血清血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白( (NHNH4 4) )2 2SOSO4 450%50%饱和度饱和度100%100%饱和饱和析出析出析出析出分段盐析分段盐析第五节第五节 蛋白质的层析分离蛋白质的层析分离n应用广泛。特征：有一个固定相和一个流动相应用广泛。特征：有一个固定相和一个流动相。由于待分离的各种物质在这两个相分配系数。由于待分离的各种物质在这两个相分配系数不同，当两个相作相对运动时，这些物质在两不同，当两个相作相对运动时，这

3、些物质在两相间反复多次分配，结果使其相互分开。相间反复多次分配，结果使其相互分开。n根据两相的状态，层析法可分为：气相层析和根据两相的状态，层析法可分为：气相层析和液相层析；按层析原理可分为：吸附层析、分液相层析；按层析原理可分为：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。按操作形式分为：柱层析、薄层层析层析等。按操作形式分为：柱层析、薄层层析、纸层析等。、纸层析等。n 分配系数分配系数: k=C: k=Cs s/C/Cm m , ,物质在固定相与流动相浓度之物质在固定相与流动相浓度之比。质量分配系数：比。质量分配系数：D=kD=kVs

4、 / Vm , Vs , Vm 为固定为固定相和流动相的体积。相和流动相的体积。一、层析的一般原理一、层析的一般原理 3216168816812412412228 如果柱顶加入如果柱顶加入32mg32mg样品，样品的质量分样品，样品的质量分配系数配系数D D为为1 1，即样品在两相中是等量分配。，即样品在两相中是等量分配。经过经过5 5层的平衡分配后，样品在柱的分配情况层的平衡分配后，样品在柱的分配情况见图。样品集中在中间。如果见图。样品集中在中间。如果D1D1D1，样品集中在中间偏，样品集中在中间偏下。下。 离子交换层析离子交换层析( (IEX)IEX)是根据电荷来分离分子的。是根据电荷来分

5、离分子的。 离子交换剂是通过化学反应将解离基团引入到惰性支持物上形成的。分为：离子交换剂是通过化学反应将解离基团引入到惰性支持物上形成的。分为： 阳离子交换剂阳离子交换剂: 解离基团带负电解离基团带负电, 结合阳离子结合阳离子; 阴离子交换剂阴离子交换剂: 解离基团带正电解离基团带正电, 结合阴离。结合阴离。 蛋白质分子是两性物质。当蛋白质分子是两性物质。当pHpHpIpI，分子带负电，可结合阴离子交换剂；当分子带负电，可结合阴离子交换剂；当pHpIpHpI，分子带正电，可结合阳离子交换剂。如阳离子交换剂与带正电蛋白质分子，分子带正电，可结合阳离子交换剂。如阳离子交换剂与带正电蛋白质分子之间有

6、如下平衡：之间有如下平衡： 二、离子交换层析二、离子交换层析（一）基本原理（一）基本原理 带电蛋白质分子与交换剂的结合是可逆的。带电蛋白质分子与交换剂的结合是可逆的。 由于由于pHpH可改变蛋白质的带电性质和带电量，盐离子会影响可改变蛋白质的带电性质和带电量，盐离子会影响蛋白质在交换剂上吸附。所以用蛋白质在交换剂上吸附。所以用一定浓度的盐溶液或一一定浓度的盐溶液或一定定pH 的缓冲液的缓冲液就可把蛋白质就可把蛋白质从离子交换剂上从离子交换剂上洗脱下来洗脱下来。对多组分混合物，每种分子所带的电荷不同，因此，。对多组分混合物，每种分子所带的电荷不同，因此，可用不同的离子强度可用不同的离子强度 或不

7、同的或不同的pHpH溶液将蛋白质从交换溶液将蛋白质从交换剂上一一剂上一一洗脱下来。洗脱下来。 （二）离子交换剂的基本类型（二）离子交换剂的基本类型 根据可供交换的离子的性质，离子交换剂可被分为根据可供交换的离子的性质，离子交换剂可被分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。若按酸碱性的强弱，又阳离子交换剂和阴离子交换剂。若按酸碱性的强弱，又可分为强酸、强碱、弱酸、弱碱几种类型的离子交换剂可分为强酸、强碱、弱酸、弱碱几种类型的离子交换剂。 强酸和强碱型交换剂能在较广泛的强酸和强碱型交换剂能在较广泛的pH范围内（范围内（pH212）完全解离。弱酸型交换剂在低于完全解离。弱酸型交换剂在低于pH4、弱碱、弱碱型

8、交换剂在高于型交换剂在高于pH9就难于解离，因而失去交换能力。就难于解离，因而失去交换能力。因为一般蛋白质在因为一般蛋白质在pH68之间稳定，所以常用弱酸或之间稳定，所以常用弱酸或弱碱型交换剂。弱碱型交换剂。离子交换基团的结构和性质离子交换基团的结构和性质类型类型名称名称结构式结构式性质性质DEAE二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基(diethylaminoethyl)-O-CH2-CH2-N+-(C2H5)2弱碱性弱碱性QAE季胺乙基季胺乙基(quaternary aminoethyl)-O-CH2-CH2-N+-(C2H5)3强碱性强碱性Q季胺季胺(quaternary amine)-CH2-N

9、+-(CH3)3 强碱性强碱性CM羧甲基羧甲基(carboxymehyl)-O-CH2-COO -弱酸性弱酸性SE磺乙基磺乙基(sulfoethyl)-O-CH2CH2-SO3-强酸性强酸性SP磺丙基磺丙基(sulfopropyl)-O-CH2-CH2-CH2-SO3-强酸性强酸性P磷酸基磷酸基(phosphate)-O-PO3-中酸性中酸性S磺酸基磺酸基(sulfonate)-CH2-SO3-强酸性强酸性 可用来作为交换剂支持物的物质种类较多。早期用于分离氨基酸、小肽和其它可用来作为交换剂支持物的物质种类较多。早期用于分离氨基酸、小肽和其它小分子物质的离子交换树脂的支持物是小分子物质的离子交

10、换树脂的支持物是聚苯乙烯类聚苯乙烯类。 分离蛋白质的常用的亲水性支持物。有三大类：纤维素、葡聚糖凝胶分离蛋白质的常用的亲水性支持物。有三大类：纤维素、葡聚糖凝胶(sephadex)、琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶(sepharose)和合成凝胶和合成凝胶(Trisacryl和和Fractogel)。1、离子交换纤维素、离子交换纤维素 离子交换纤维素是以纤维素做支持介质的。具有松散的亲水性网络，较大的表离子交换纤维素是以纤维素做支持介质的。具有松散的亲水性网络，较大的表面积，吸附容量大，通透性好。根据离子交换纤维素所含离子交换基团的性质可分面积，吸附容量大，通透性好。根据离子交换纤维素所含离子交换基团的性

11、质可分为强酸、强碱型和弱酸、弱碱型。现将常用的离子交换纤维素列于下表中。为强酸、强碱型和弱酸、弱碱型。现将常用的离子交换纤维素列于下表中。常用的离子交换纤维素常用的离子交换纤维素离子类型 解 离 基 团特 点DEAE-OCH2CH2N+(C2H5) 在 pH8.6 应用 阴离子阴离子解离基团解离基团交换交换摩尔摩尔(m mol/g) 特点特点DEAEOCH2CH2N(C2H5)0.11.1 在在pH4应用应用POPO3H20.77.4酸性较强酸性较强SEOCH2CH2SO3H0.20.3强酸性强酸性 在在Sephadex上接上某种离子交换基团。这种上接上某种离子交换基团。这种凝胶既有离子交换剂

12、的性质，又有分子筛效应凝胶既有离子交换剂的性质，又有分子筛效应。因此，其分离能力比单纯的层析凝胶或离子。因此，其分离能力比单纯的层析凝胶或离子交换剂好。葡聚糖凝胶离子交换剂的交换量比交换剂好。葡聚糖凝胶离子交换剂的交换量比相应的纤维素离子交换剂大，如相应的纤维素离子交换剂大，如DEAESephadex的交换量大约是的交换量大约是DEAE纤维素的纤维素的3.55.0倍。倍。2、离子交换葡聚糖凝胶（、离子交换葡聚糖凝胶（Sephadex）葡聚糖凝胶离子交换剂的性质葡聚糖凝胶离子交换剂的性质 类别类别离子交换基团离子交换基团床体床体积积ml/g分离范围分离范围(Mr)交换量交换量总交换容量总交换容量

13、(m mol/g) 强阳离子交强阳离子交换剂换剂SESephadex C25 C50-CH2CH2SO3H5932383104- 21053104-21052.02-52.02-5 SPSephadex C25 C50-CH2CH2CH2SO3H 2.30.3 弱阳离子交弱阳离子交换剂换剂CMSephadex C25 C50-O-CH2COOH61032403104-21053104-2105 4.50.5 强阴离子交换剂强阴离子交换剂QAESephadex A25 A505830403104-21053104-2105 3.04.0 弱阴离子交换剂弱阴离子交换剂DEAESephadex A2

14、5 A50-C2H4N+(C2H5)2H592583 3104-21053104-21053.54.5 类别类别离子交换基团离子交换基团床体积床体积ml/g分离范围分离范围(Mr)交换量交换量总交换容量总交换容量(m mol/g) -O-C2H4N+(C2H5)2 将各种离子基团引入到交联琼脂糖将各种离子基团引入到交联琼脂糖(Speharose CL)和大孔合成凝胶和大孔合成凝胶(Trisacryl或或Fractogel)上，则上，则形成一系列离子交换剂。这类交换剂即坚硬、吸附形成一系列离子交换剂。这类交换剂即坚硬、吸附容量大，形状球形，能维持较好的流速及分辨率。容量大，形状球形，能维持较好的

15、流速及分辨率。3、交联凝胶离子交换剂、交联凝胶离子交换剂（三）层析条件的选择（三）层析条件的选择1、离子交换剂的选择、离子交换剂的选择 选择离子交换剂之前要了解样品的性质：热稳选择离子交换剂之前要了解样品的性质：热稳定性、带电情况、定性、带电情况、pH和盐浓度对其活性和溶解度的和盐浓度对其活性和溶解度的影响。一般情况下，带负电的物质用阴离子交换剂影响。一般情况下，带负电的物质用阴离子交换剂，反之，则用阳离子交换剂。实验室中最广泛使用，反之，则用阳离子交换剂。实验室中最广泛使用的是的是DEAE和和CM 交换剂。交换剂。 2、交换颗粒大小的选择、交换颗粒大小的选择 粒子大小主要影响分辨率和流速。粗

16、粒粒子大小主要影响分辨率和流速。粗粒子：交换容量小、间隙大、分辨率底、流速较子：交换容量小、间隙大、分辨率底、流速较快。细粒子：分辨力高、交换容量大但是流快。细粒子：分辨力高、交换容量大但是流速慢。速慢。3、层析缓冲液的选择、层析缓冲液的选择 选择正确的缓冲液可获得较好的层析效果。因为选择正确的缓冲液可获得较好的层析效果。因为离子相互作用取决于离子相互作用取决于pH，而维持介质的，而维持介质的pH，通常是由，通常是由缓冲液来实现的。所用缓冲液的种类、缓冲液来实现的。所用缓冲液的种类、pH大小，决定大小，决定 待分离组分的稳定性和溶解度。待分离组分的稳定性和溶解度。 为避免缓冲液的离子参与离子交

17、换过程，采用缓冲为避免缓冲液的离子参与离子交换过程，采用缓冲液所带的电荷应与离子交换剂所带电荷相同。使用阳液所带的电荷应与离子交换剂所带电荷相同。使用阳离子交换剂时，要用阴离子型缓冲液（磷酸、醋酸等离子交换剂时，要用阴离子型缓冲液（磷酸、醋酸等）；使用阴离子交换剂时要用阳离子型缓冲液（）；使用阴离子交换剂时要用阳离子型缓冲液（Tris、胺盐、吡啶等）。胺盐、吡啶等）。 要得到好的分离效果，层析时要注意层析柱的高度和要得到好的分离效果，层析时要注意层析柱的高度和体积；上样量的大小；洗脱液体积；洗脱速度；分级体积；上样量的大小；洗脱液体积；洗脱速度；分级物的收集量。物的收集量。1、柱床体积：至少要

18、比结合所有样品所需要的要大、柱床体积：至少要比结合所有样品所需要的要大25倍。离子交换层析所用的柱不用太长，以便缩短操作倍。离子交换层析所用的柱不用太长，以便缩短操作时间。时间。2、样品、样品pH 和离子强度：与起始缓冲液具有相同的和离子强度：与起始缓冲液具有相同的pH和和离子强度。离子强度。3、洗脱液体积和洗脱梯度的形状：对柱的分辨率影响很、洗脱液体积和洗脱梯度的形状：对柱的分辨率影响很大。洗脱可用恒定组成的缓冲液来完成（简单洗脱）大。洗脱可用恒定组成的缓冲液来完成（简单洗脱）也可用改变也可用改变pH或盐浓度，或二者均改变的洗脱液来完或盐浓度，或二者均改变的洗脱液来完成。成。pH和盐浓度的改

19、变又分为连续改变（梯度洗脱）和盐浓度的改变又分为连续改变（梯度洗脱）和不连续改变（阶段洗脱）和不连续改变（阶段洗脱）。（四）柱层析技术（四）柱层析技术 交换剂的处理就是将交换剂转变为适合分离目的的离交换剂的处理就是将交换剂转变为适合分离目的的离子类型。一般包括除杂质、溶胀，除细粒和改型。改型就子类型。一般包括除杂质、溶胀，除细粒和改型。改型就是用适当的离子平衡，使交换剂带上希望的离子。阳离子是用适当的离子平衡，使交换剂带上希望的离子。阳离子和阴离子交换剂最后分别为和阴离子交换剂最后分别为Na和和Cl型是最稳定形式。型是最稳定形式。4、洗脱速度：太快或太慢都会降低柱的分辨率。、洗脱速度：太快或太

20、慢都会降低柱的分辨率。5、分级物收集量：关系到能否充分代表层析柱的分辨、分级物收集量：关系到能否充分代表层析柱的分辨率。一般总洗脱体积在率。一般总洗脱体积在5002000ml时，每管收集时，每管收集510ml（五）离子交换剂的处理和再生（五）离子交换剂的处理和再生 离子交换剂价格较贵，用后再经过再生处理，可反离子交换剂价格较贵，用后再经过再生处理，可反复多次使用。处理时避免用强酸或强碱长时间浸泡，复多次使用。处理时避免用强酸或强碱长时间浸泡，以防载体的糖链结构遭水解破坏。以防载体的糖链结构遭水解破坏。 剂型剂型处理用的酸或碱浓度处理用的酸或碱浓度浸泡时间浸泡时间纤维素纤维素 SephadexS

21、epharose合成凝胶合成凝胶0.5M HCl或或NaOH(含含0.5M NaCl)0.1M HCl或或NaOH(含含1M NaCl)1M NaAc (pH3.0)或或0.1M NaOH(含含1M NaCl)0.51.0M HCl或或NaOH(含含1M NaCl)34h0.5h可在柱中再生可在柱中再生长时间浸泡无影响长时间浸泡无影响各类离子交换剂的再生条件各类离子交换剂的再生条件 血清蛋白常用离子交换层析分离。血清蛋白常用离子交换层析分离。IgG可用可用QAESephadex A50或或DEAESephadex A50分离。现在临床上有重要用途的许多血清蛋白，分离。现在临床上有重要用途的许多

22、血清蛋白，如白蛋白，如白蛋白，factor IX复合物和专一性免疫球蛋白已复合物和专一性免疫球蛋白已用离子交换层析大规模生产。用离子交换层析大规模生产。（六）离子交换层系的应用实例（六）离子交换层系的应用实例 凝胶层析又称凝胶渗透层析、排阻层析，分子筛凝胶层析又称凝胶渗透层析、排阻层析，分子筛层析等。它主要用于分离分子大小不同的生物大分子层析等。它主要用于分离分子大小不同的生物大分子及测定其分子量。凝胶层析设备简单，操作简便，每及测定其分子量。凝胶层析设备简单，操作简便，每次层析后无需再生处理，因此，在生化研究中应用及次层析后无需再生处理，因此，在生化研究中应用及其广泛。其广泛。三、凝胶过滤层

23、析三、凝胶过滤层析 凝胶层析载体是多孔凝胶。当溶质通过层析柱时，溶凝胶层析载体是多孔凝胶。当溶质通过层析柱时，溶质分子不仅是向下运动，而且还在做无定向扩散运动。质分子不仅是向下运动，而且还在做无定向扩散运动。分子直径比凝胶孔径大的分子，不能进入凝胶颗粒的微分子直径比凝胶孔径大的分子，不能进入凝胶颗粒的微孔里，只能经过凝胶颗粒之间的孔隙。这样的分子是随孔里，只能经过凝胶颗粒之间的孔隙。这样的分子是随溶剂一起移动的，因而最先流出柱外；而分子直径比凝溶剂一起移动的，因而最先流出柱外；而分子直径比凝胶孔径小的分子，则能够自由进入凝胶颗粒的微孔之中胶孔径小的分子，则能够自由进入凝胶颗粒的微孔之中，即进入

24、凝胶相内。小分子向下移动的速度必然要落后，即进入凝胶相内。小分子向下移动的速度必然要落后于大分子。凝胶颗粒是固定相，洗脱液是流动相。于大分子。凝胶颗粒是固定相，洗脱液是流动相。 (一一) 基本原理基本原理 溶质分子在柱上移动的速度（即被凝胶颗粒阻滞的程溶质分子在柱上移动的速度（即被凝胶颗粒阻滞的程度）决定于该分子在两相间的分配常数度）决定于该分子在两相间的分配常数 Kd。Kd由下式计由下式计算：算： Kd=(Ve-Vo)/Vp 式中式中Ve为某种物质从柱内完全洗脱出来时洗脱液的体为某种物质从柱内完全洗脱出来时洗脱液的体积；积；Vo为胶粒之间空隙的总容积，也称外水体积；为胶粒之间空隙的总容积，也

25、称外水体积；Vp为为胶粒内部孔隙的总容积，称内水体积。若分子大，完全不胶粒内部孔隙的总容积，称内水体积。若分子大，完全不能进入胶粒微孔，则最先流出柱，此时能进入胶粒微孔，则最先流出柱，此时Kd=0；若分子小；若分子小，能完全进入胶粒微孔，则最，能完全进入胶粒微孔，则最 后流出柱，此时后流出柱，此时Kd=1对中对中等大小的分子，只能部分进入胶粒微孔，所以等大小的分子，只能部分进入胶粒微孔，所以Kd值在值在01之间。不同溶质是按之间。不同溶质是按Kd由小到大的顺序流出柱。由小到大的顺序流出柱。 凝胶过滤法的分辨率是凝胶层析中的另一个重要的特凝胶过滤法的分辨率是凝胶层析中的另一个重要的特征性常数。从

26、数学概念上考虑，分离分辨率可以表示为：征性常数。从数学概念上考虑，分离分辨率可以表示为： V1、V2是两种物质的洗脱体积，可以从加样品开始是两种物质的洗脱体积，可以从加样品开始到洗脱峰的最高点为止的洗脱体积计算。到洗脱峰的最高点为止的洗脱体积计算。W1、W2分别为两个物质的洗脱峰的宽度，可以由通过分别为两个物质的洗脱峰的宽度，可以由通过峰边拐点的两条切线与基线交点间的距离来计算。两峰边拐点的两条切线与基线交点间的距离来计算。两个物质要完全分离，个物质要完全分离，必须大于或等于必须大于或等于1。影响分辨率。影响分辨率的因素很多，如凝胶粒度、上样量、流速、温度、的因素很多，如凝胶粒度、上样量、流速、温度、凝胶凝胶类型及层析柱的形状等。类型及层析柱的形状等。=2（V2-V1)W1+W2（二）离子交换剂的基本类型（二）离子交换剂的基本类型 根据可供交换的离子的性质，离子交换剂可被分为根据可供交换的离子的性质，离子交换剂可被分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。若按酸碱性的强弱，又阳离子交换剂和阴离子交换剂。若按酸碱性的强弱，又可分为强酸、强碱、弱酸、弱碱几种类型的离子交换剂可分为强酸、强碱、弱酸、弱碱几种类型的离子交换剂。 强酸和强碱型交换剂能在较广泛的强酸和强碱型交换剂能在较广泛的pH范围内（范围内（pH212）完全解