淋巴瘤基因克隆性重排检测

1、专注分子诊断 | 引领精准医学.Focus On Molecular Diagnosis | Leading Precision Medicine.形态学形态学 （Morphology） 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳(CE) 荧光实时定量荧光实时定量PCR(RTQT-PCR) 一代测序一代测序(Sanger) 二代测序二代测序(NGS)分子生物学分子生物学 （Molecular） 免疫组化（IHC） 流式细胞术（流式细胞术（FCM）免疫学免疫学 （Immunology） 荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISH）细胞遗传学（细胞遗传学（Cytoge

2、netics）辅助诊断辅助诊断预后分析预后分析指导用药指导用药MRD检测检测血液肿瘤（常规肿瘤）检测方案血液肿瘤（常规肿瘤）检测方案-MICM综合分子检测综合分子检测(旌准方案旌准方案)专注分子诊断 | 引领精准医学.分子检测检测基因方法IG/TCR基因重排基因重排IGH，IGK，IGL，TRB，TRD，TRGGEL (PAGE)ABI (CE)NGSIGHV超突变超突变IGHGEL (PAGE)ABI (CE)NGS基因突变基因突变EZH2, DNMT3A, IDH2SangerNGSMoffitt, A. B. and S. S. Dave (2017). J Clin Oncol 35(

3、9): 955-962.分子检测分子检测-淋巴瘤淋巴瘤Focus On Molecular Diagnosis | Leading Precision Medicine.淋巴细胞克隆性基因重排检测产品特点淋巴细胞克隆性基因重排检测产品特点专注分子诊断 | 引领精准医学.B-Cell Receptors (BCR) /Immunoglobulins (Ig) T-Cell Receptor (TCR)蛋白基因染色体定位Ig重链IGH14q32Ig轻链 IGK2p12Ig轻链IGL22q11蛋白基因染色体定位TCRTCRTRA14q11TCRTCRTRB7q32TCRTCRTRG7p15 TCRT

4、CRTRD14q11.2淋巴细胞克隆性基因重排检测的目标分子淋巴细胞克隆性基因重排检测的目标分子Ig和和TCR-单一单一基因重排，即恶性淋巴细胞基因重排，即恶性淋巴细胞专注分子诊断 | 引领精准医学.IGH, TRB & TRD: V, D, and J IGK, IGL, and TRG: V and J regions 正常正常淋巴细胞成熟过程/良性病变多多克隆性多种多种形式的基因重排恶性恶性淋巴瘤发生的过程单单克隆性突出单一单一形式的基因重排多样性与克隆性多样性与克隆性专注分子诊断 | 引领精准医学.鉴别诊断：明确是淋巴组织反应性还是淋巴细胞恶性增殖鉴别诊断：明确是淋巴组织反应性

5、还是淋巴细胞恶性增殖辅助诊断：少见类型淋巴瘤，如肝脾辅助诊断：少见类型淋巴瘤，如肝脾T T细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤亚类分析：明确是亚类分析：明确是B B淋巴恶性增殖还是淋巴恶性增殖还是T T细胞恶性增殖细胞恶性增殖区分同一患者两种淋巴细胞恶性肿瘤，包括复发与继发淋巴瘤区分同一患者两种淋巴细胞恶性肿瘤，包括复发与继发淋巴瘤微小残留病灶监测，评估治疗效果或复发风险（微小残留病灶监测，评估治疗效果或复发风险（NGSNGS方法）方法）细胞免疫治疗监测，监测回输细胞免疫治疗监测，监测回输T T细胞增殖状况和淋巴组织来源肿瘤细胞清除效果（细胞增殖状况和淋巴组织来源肿瘤细胞清除效果（NGSNGS）5%15%的病

6、例表现复杂，即使做了大量的免疫标志也可能难以鉴别其良恶性，需要进一步的手段区分。的病例表现复杂，即使做了大量的免疫标志也可能难以鉴别其良恶性，需要进一步的手段区分。利用分子生物学手段分析利用分子生物学手段分析Ig和和TCR基因的克隆性重排被基因的克隆性重排被WHO公认为该疾病诊断手段的重要补充。公认为该疾病诊断手段的重要补充。淋巴细胞克隆性基因重排检测的临床意义淋巴细胞克隆性基因重排检测的临床意义专注分子诊断 | 引领精准医学.基于PCR检测技术，简便、快速、成本较低，所需DNA量少，对DNA质量要求不高。灵敏度高于10%，需配制胶，安全清洁性较差。基于PCR-毛细管电泳检测技术，敏感性高，检

7、测周期较长，结果更加直观可靠目前市场最被接受的检测方法。灵敏度无法满足MRD要求要求，难以定量和得到序列。新兴技术，更高灵敏度（10-6），更高分辨率，更高的通量，更广泛的应用。但成本高，仪器贵，操作复杂，时间长。（IGH, IGK,）（）（IGL）（）（TRB ,TRD,）（）（ TRG）BIOMED-2方方案，唯一授权案，唯一授权）IGHV（依据（依据ERIC指南）指南）IGH, IGK, TRB , TRGIGHV基于不同方法的产品系列基于不同方法的产品系列-Invivoscribe公司公司专注分子诊断 | 引领精准医学.Invivoscribe公司的IdentiCloneTM系列产品是

8、基于PCR的克隆性检测产品，是BIOMED-2唯一授权唯一授权的商品化试剂，获得CE认证，以其高度的灵敏性和特异性，成为可疑淋巴组织增生性疾病克隆性分析的“金标准”。IdentiCloneTM系列产品具有精心优化的标准化试剂组成，具有最丰富的阳性对照，涵盖各种TB细胞重排类型，经过了超过400例的临床样本验证，按照临床产品的标准进行质检和质控，反应体系稳定，结果可靠。从从Biomed-2到到Invivoscribe-唯一授权唯一授权专注分子诊断 | 引领精准医学.Biomed-2研究项目研究项目专注分子诊断 | 引领精准医学.Biomed-2研究项目（研究项目（IGH为例）为例）van Don

9、gen, J. J. M., et al. (2003). Leukemia 1717: 2257.专注分子诊断 | 引领精准医学.Biomed-2研究项目（研究项目（IGH为例）为例）van Dongen, J. J. M., et al. (2003). Leukemia 1717: 2257.专注分子诊断 | 引领精准医学.结果分析结果分析（单）克隆性（单）克隆性：扩增产物电泳在：扩增产物电泳在预期大小范围内一或双条带（峰）预期大小范围内一或双条带（峰）送检组织中，淋巴细胞抗原受体基因的送检组织中，淋巴细胞抗原受体基因的重排方式为单一性重排方式为单一性。表明组织中存在。表明组织中存在单克

10、隆性增生单克隆性增生的细胞群。的细胞群。多克隆性多克隆性：扩增产物电泳呈：扩增产物电泳呈弥散涂抹状弥散涂抹状(smear)或阶梯状或阶梯状(高斯分布）高斯分布） 送检组织中，淋巴细胞抗原受体基因的送检组织中，淋巴细胞抗原受体基因的重排方式为多样性重排方式为多样性。表明组织中。表明组织中不存在单克隆性增生不存在单克隆性增生的细胞群。的细胞群。 无扩增产物无扩增产物：PCRPCR扩增后电泳扩增后电泳未见未见产物产物送检组织中的细胞，抗原受体基因送检组织中的细胞，抗原受体基因无重排（无重排（NK，非淋巴细胞）或，非淋巴细胞）或DNA质量过差质量过差。Products are heterodulex-

11、treated followed by PAGE on 6% gel250bp-300bp-400bp-IGH B(250-295bp)200bp-500bp-175bp-150bp-markermarkerP PMMH H2 2OOS1S1S1S1S2S2S2S2专注分子诊断 | 引领精准医学.淋巴瘤应用基因重排检测进行辅助淋巴瘤应用基因重排检测进行辅助/鉴别诊断的方案鉴别诊断的方案专注分子诊断 | 引领精准医学. 检测到克隆性重排未必一定发生恶性病变检测到克隆性重排未必一定发生恶性病变某些良性增生也可呈克隆性重排，如CD8+T细胞淋巴增生性病变、良性单克隆性丙种球蛋白病、皮肤淋巴瘤样丘疹病

12、、免疫缺陷患者严重的EB病毒感染等； 检测不到克隆性重排也不能排除恶性病变检测不到克隆性重排也不能排除恶性病变某些明确恶性病变的免疫缺陷患者中偶尔检测不到克隆性重排，NK/T细胞淋巴瘤中IG和TCR基因呈胚系结构，即也无克隆性重排。 IG或或TCR基因的重排不一定是谱系的标志基因的重排不一定是谱系的标志特别是大多数前驱淋巴细胞性肿瘤中存在谱系交叉，如血管免疫母细胞学淋巴瘤（AITL）。单一发生可反映谱系，同时阳性只表示克隆性增生，不能判断谱系来源。 假阳性和假阴性假阳性和假阴性技术，引物，反应条件 分子克隆性结果分析，应结合临床、形态学和免疫表型特征，方可做出淋巴瘤的最终诊断和分类。分子克隆性

13、结果分析，应结合临床、形态学和免疫表型特征，方可做出淋巴瘤的最终诊断和分类。注意事项注意事项专注分子诊断 | 引领精准医学.对以下疾病提供重要预后信息对以下疾病提供重要预后信息:慢性淋巴细胞白血病(CLL)前提：前提：IGH克隆性重排为单克隆例外：例外： V3-21重排区表达与预后不良相关，与IGHV突变状态无关。SHM 判断标准：判断标准：IGHV突变比例2% 2%SHM状态为突变突变PFS1-5年9.2-18.9年OS3.2-10年17.9-25.8年预后不良良好IGH V区的区的SHM状态检测被推荐为新诊断状态检测被推荐为新诊断CLL患者预后分析的生物标志物。患者预后分析的生物标志物。P

14、FS：无进展生存期（Progression free survival）OS：总生存期（Overall survival）中国CLL/SLL的诊断与治疗指南（2018版）IGH V区体细胞超突变检测的临床意义区体细胞超突变检测的临床意义专注分子诊断 | 引领精准医学.基于PCR检测技术，简便、快速、成本较低，所需DNA量少，对DNA质量要求不高。灵敏度高于10%，需配制胶，安全清洁性较差。基于PCR-毛细管电泳检测技术，敏感性高，检测周期较长，结果更加直观可靠目前市场最被接受的检测方法。灵敏度无法满足MRD要求，难以定量和得到序列。新兴技术，更高灵敏度（10-6），更高分辨率，更高的通量，更广

15、泛的应用。但成本高，仪器贵，操作复杂，时间长。IGH, IGK, IGL, TRB ,TRD, TRG（BIOMED-2方案，唯一授权方案，唯一授权）IGHV（依据（依据ERIC指南）指南）IGH, IGK, TRB , TRGIGHV基于不同方法的产品系列基于不同方法的产品系列-Invivoscribe专注分子诊断 | 引领精准医学.结合 Leader 和 FR1 区域的引物在 5端连接有通用的测序片段，这种设计，配合 JH 反向测序引物，能够实现 PCR 扩增产物的双向测序。目前，欧洲慢性淋巴细胞性白血病研究机构（欧洲慢性淋巴细胞性白血病研究机构（European Research Initiative on CLL，ERIC）的指南）的指南即使用双向测序判断 IGH V区体细胞