液相色谱仪的使用2

1、1实验十二液相色谱仪的使用实验时间：2004年12月25日第三组：周炜学号：02321013一、实验目的（一）掌握Waters HPLC的基本结构及工作原理；（二）了解Waters HPLC的性能特点及应用范围；（三）熟悉Waters HPLC的操作步骤。二、基本结构及工作原理高效液相色谱法（HPL。是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。高效液相色谱法包括四种基本类型：分配色谱（ PQ、吸附色谱（AQ又称液固色谱（LSC）、 离子交换色谱（IEC）、尺寸排斥色谱（SEC又称凝胶色谱（GC 。（一）基本结

2、构及工作流程高效液相色谱仪可分为 4个主要部分：高压输液系统；进样系统；分离系统；检测系统。此外还配有辅助装置：梯度淋洗装置；自动进样装置；数据处理器等。其结构示意图如 下。首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。 当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离， 然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱 图。（二）分配色谱法的基本原理分配色谱法是四种高效液相色谱法中应用最广的一种，它的原理类似于溶剂萃取。一般将分配色谱分为液液分配色谱（LLP。和化学键合相分配色谱（CBP。两类。本实验采用化学

3、键合相分配色谱法。1. 液液分配色谱法在液-液色谱中，流动相和固定相都是液体，它能适用于各种样品类型的分离和分析，无 论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，还是离子型的和非离子型的化合物。液液 分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解 度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种 分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种 复杂组分。2. 化学键和相分配色谱法化学键合固定相是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。它代 替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起

4、着重大作用，可以认为 它的出现是液相色谱法的一个重大突破。它是目前应用最广泛的一种固定相。据统计， 约有3/4以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。采用化学键合相的液相色谱称 为化学键合相色谱法，简称键合相色谱。由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失， 适用于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品。由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，因此它适用于种类繁多样品的分离。三、性能特点及应用范围（一）高效液相色谱仪的特点及应用范围高效液相色谱仪是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高 压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作

5、自动 化的特点。1. 分离效率高：使用新型填充物 ，粒度可小于50微米，每米色谱柱的塔板数达 5000以上。2. 分离速度快：采用高压输液泵，流动相压力高达300千克力/厘米2以上，流速远比经典液 相色谱法为快，分离速度可与气相色谱法相比。3. 灵敏度高：流出液流经紫外或荧光等检测器，可直接检出低至10-1310-10克的物质。4. 应用范围广：可以测定高沸点、热不稳定等不宜于用气相色谱法测定的大分子量的化 合物。环境中的一些致癌物质如黄曲霉毒素、多环芳烧以及除莠剂、杀虫剂等都可以用 高效液相色谱法进行快速、灵敏的分析测定。大气飘尘的多环芳烧从两环的荼至五环的 苯并（a）葩等10多种化合物，在

6、半小时内便可分离测定。应用紫外检测器可以检知含量 为纤克/米3级的多环芳烧。正是因为高效液相色谱法具有如此多的优点，所以又被称为现代液相色谱法、高雅液相 色谱法、高速液相色谱法。作者： 化学小朋友 通 512005-4-8 13:24回复此发言2实验十二液相色谱仪的使用（二）Waters HPLC各部件的性能特点Waters Breeze HPLC 系统是一套在简洁、高性能、可靠性和价位平实之间取得平衡的，能广泛适用同时易用的 HPLC系统。此外，本系统是非常灵活的，可以定制部件来适应用户的应用需求。Breeze系统的部件列表如下。最低计算机需求 ？ Intel 赛扬600MHz或更高，256

7、MB内存，有PCI插槽和足够空间以便插入Bus LAC/E ?卡?微软 Windows XP专业版，8 GB硬盘，sVGA显示器，4x CD-ROM动器? 1.44 MB软驱，3.5英寸?支持微软 Windows XP专业版的打印机仪器控制？适用于单系统? 1500系列HPLC泵? 2487双波长紫外/可见检测器? 2414示差折光检测器? 717plus自动进样器? 1500系列柱温箱? Bus SAT/IN ?（采集 Waters检测器的数据）采集？最多五个检测器通道数据能力？处理（LC&GPC ,报告和存储数据结果数据输出格式 ？ PDF, EMF, AIA, ASCII, e-

8、mail1. Breeze 软件适用于无需二极管阵列检测器的用户；集泵、检测器、进样器的实用功能于一身；易用的 界面，方便的仪器控制，最低的培训要求，提高使用效率。2.1500系列色谱泵Waters 1500 HPLC系列包括等度和高压梯度色谱系统，其中梯度系统包括三种规格：1525分析型，1525 低流量型和1525EF分析兼半制备型。整体式HPLC系统，使用灵活方便；专利非圆齿轮技术，具有极佳的耐用性和输液稳定性；汲取 Waters技术精华，具有高流 速精度。3.717plus自动进样器全电子设计的自动进样器，高精度、高可靠性； 进样针内、外清洗设计，最大程度降低交叉污染； 样品室温度控制

9、选件，保证热不稳定样品之完整性。4.2475双扫描荧光检测器全新设计，优化信号强度，降低散射光，减少池体扩散，大大提高检测灵敏度； 激发和发射波长均可扫描，允许自动增益优化；波长编程功能设计，允许不同保留时间的化合物使用不同波长检测，优化各个被测物的检测灵敏度；在线波长准度确认及增强安全性设计，符合严格的法规要求。5.6. XTerra 色谱柱XTerra色谱柱使用的杂化颗粒技术突破了化学的极限。广泛适用于分析、制备领域。杂 化颗粒技术利用有机/无机杂化颗粒来发挥硅胶和聚合物基质填料的优势，克服了传统填 料的弱点，为研究者优化分离速度、分离度、pH选择性、色谱柱寿命及上样量提供了强有力的工具。

10、杂化颗粒填料具有分离效率高、峰形优异、稳定性好、PH范围宽(1-12)及规格齐全等特点。XTerra色谱柱提供了 HPLC分离速度与分离度的最佳组合，为研究者 提供最宽范围的分离键合相、色谱柱规格以及颗粒度。XTerra填料目前提供2.5 m 3.5 m 5 m和10 m四种粒径及 MSC18 MSC8 RPC18 RPC8苯基五种键合相。四、实验内容及操作步骤(一) 仪器、试剂及色谱条件1. 仪器：Waters HPLC、荧光检测器、25 L微量进样器。2. 试剂：荼标液(国家标准物质中心；200mg/L)、甲醇(分析纯)。3. 色谱条件(1) C18色谱柱：长15cn 内径4.6mn 填料

11、粒径5 m；(2) 流动相(甲醇)：1mL/min;(3) 荧光检测器：280/334nm。(二) 参数设置及操作步骤1. 准备工作(1) 流动相：过滤(0.45 m滤膜)、按比例混合、超声 510min除气泡；(2) 使用前(后)冲洗：进样口( load、inject )、泵、柱、检测器；(3) 标样、样品：都需要过滤。2. 开机及测试样品(1) 先打开色谱仪、检测器；后打开电脑及软件；(2) 选 project、use name;(3) manage breeze 看 system , 连接情况；(4) view method设参数：如波长、流速(1.0 )、溶剂(甲醇：水)等；保存；(5

12、) 检查：流动相放好、使用A泵或B泵；(6) 灌注、冲洗：用流动相充分浸润泵，排除气泡；(7) 平衡系统：equilibrate选择方法、平衡 20min左右；作者： 化学小朋友 底' 囹2005-4-8 13:24回复此发言3实验十二液相色谱仪的使用(8) 进样：make single injection 、next、取样、出现对话框后、在 load注入、马上 移到inject、拔出进样器；2min后将inject拨回load ;停止按stop。3. 数据处理(1) 设定 process parameter : find data 在 channel 中选一个数据、点 review、

13、点 guide、选start 、选峰的范围(用鼠标拉)、 next、next、在peak1命名、next、next、选external给process parameter 起名（可以是仪器参数的方法名或重新起名）、finish 、保存；（2） 设标准曲线横坐标：find data中选所有要做标准曲线的点、右键 alter sample 、 才巴 unknown 改为 standard、点 edit 中 component、，点 edit 中 copy > 选过程方法、 填 写每个点的浓度、OK保存；（3） 做标准曲线：find data 中选所有要做标准曲线的点、右键 process 、

14、选过程方 法、选clear 、OK右键view as中result、选所有要做标准曲线的点（看时间、是 刚刚生成的）、右键 review、点校正曲线、查看信息；（4） 定量分析：find data中选样品点、右键 process、选过程方法、选 use-luo、OK 右键view as中result、选数据点（看时间、是刚刚生成的）、右键 review 。（三）注意事项1. 流动相过滤、配比、超声除气须严格按操作规程；2. 打开、关闭泵时，要控制流动相的流量以多次小幅度增减，以保护色谱柱；3. 做完实验后，要用甲醇（水）交替冲洗整个流路（包括进样口）五、实验记录及数据分析表一：标准曲线：浓度（

15、mg/L）峰面积0.64 921591.6 2303616.4 981788表二：未知样测定：未知样浓度（mg/L）峰面积第一次 3.467 525835第二次 3.002 453696第三次 3.691 560635平均值 3.387 513389六、实验讨论（一）高效液相色谱法与经典液相色谱法及气相色谱法的比较高效液相色谱法（HPL。是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技 术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是 在经典液相色谱基础上，弓I入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相 和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、

16、灵敏度高、操作自动化的特点。高效液相色谱法与经典液相色谱法比较：高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达103cm?min-1。例如分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约 170cm,柱径0.9cm，流动相速度为 30cm3?h-1，需用20多小时才能分离出 20种氨基酸； 而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。又如用25cmx 0.46cm的Lichrosorb ODS（5 a

17、 ）的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分。高效液相色谱法与气相色谱法比较：(1) 气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20%。对于占有机物总数近 80%的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前 主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。(2) 气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅 起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组 分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很 大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了 极大方便。(3) 气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工 作。总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改 进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上 有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、 染料及药物等物质的分离和分析。高效液相色谱法的仪器设备费用