测序结果分析

1、测序结果的判读测序结果为.abi格式，可用软件chrosmas打开，一种颜色的峰代表一个碱基，峰的高低表 信号的强弱。一个正常的N表示机器没法判读是哪种碱基，原因是：杂峰的信号高于机器默认的值，机器会认为该处有两个峰，因此不能判断确定是哪个峰，需要人工判读。以下三 种情况会出现N：有杂合子，有杂峰，反应已结束。31V，加|370> 内 G ftT A C C ft SGCG-TTTCCCCC TGGAifcGCTCCCTCGTGCGC TCTCCTfrTTCC G C 7 C T 5 C C G C *7 r质粒污染(Two plasmid)iCTBTlFTTOliTCC" T

2、imCCOCCTT TCTTCOFCR：间 1TMC TUEMFWHHIIHfiT ffl I HfflFM： ITITCIME706040100110120 1SD 140 ISOPCR杂带钉子峰产生的原因是样品或毛细管内有灰尘等固体小颗粒序列凌乱-1-11 11i JfLLI111J1|i11彳|!1队114It3 rj ha11Hl"1I jy1f' 1 l'1 k 1 1-4-rlMWill原因：测序反应失败。解决办法：改进条件，重做反应。注意两个关键因素：引物与模板之间的比例：3.2 pmol:200 ng。模板 DNA的纯度和用量：1.6 2.0T峰特别弱

3、原因：残余的 Dye太多，纯化不够。有测序反应，但效率低下信号太弱解决办法：纯化充分。避开引物峰，确定新的分析起点1、PCR产物测序时出现重叠峰问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码）a c c > t a t c g t acacTT .ciiTTTTNaaNaa c c t to a <解决方法：将 PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将 PCR产物进行PAGE 纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。问题图2（PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一）解决方法：主要原因是PCR产

4、物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段,将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。|可题图3（测序引物有碱基缺失）CT7 CC TtTW； C TC N 1 TTG CTTC CCG775KG !T CM TC测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的碱基缺失即图 1有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。解决方法：重新合成引物，或将引物进行PAGE纯化2、克隆测序时出现峰形重叠原因：所挑选的重组子不是

5、单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；或是是送测序的菌液污染解决方法：重新挑单克隆的菌落 （划线分离单菌落），提质粒或送菌液再次测序。3、样品有杂合/突变位点A G O C T -C T -C C TT G HaTOTGTG模板中有杂合型突变， 也就说模板本身在这个位点出现突变；或者是从基因组中扩增出来的杂合位点。如果模板有杂合（突变或缺失）,那么测序图形中其他的位黑占一般都是罩一的峰形，然后突然在某一彳固位黑占出现重叠峰（如图中箭所示）。解决方法：建议将 DNA片段克隆到载体再测序。4、polyA/T 和C/Gcluster 导致的套峰和测序信号衰减TTTTTTTTTTTTTTTCT<JTTTTTTTT(JTT-gT<jawww.blTTTTTTMCCCi XM ： C C MRACE测序时经常遇到图 4-1和图4-4的情形，解决方法：从另一端测序；或者构建载体 进行测序。5、基因中含有重复序列Ct7 7CC7 CCC!枕。：Ct C t - CCC：CCCft CCCT :CC T ' XCJ CtC： H CCCT :CC： OCC：可能的原因：样品中含有重彳复序列导致的测序结果和PolyA/T的结果一样，会导致 Frame滑动，较短的重彳复