枯草芽孢杆菌

1、芽弛杆菌属的一种。单个细胞0.70.8 >23微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽跑 0.60.9 X.01.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽跑形 成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱酸。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成呵噪。有的菌株是a-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核昔酸的酶系，故常作选育核昔生产菌的亲株或制取 5'-核昔酸酶的菌种。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的喋吟核昔酸的合 成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖

2、，故名。 常用培养基配方：1L蒸储水+10g蛋白腺+3g牛肉膏+15-20g琼脂 能耐氧化；耐挤压；耐在快速繁殖过程中，产生大量多种维生素、有机酸、氨基酸、蛋白酶(特别是碱性蛋白酶)、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，高温，能长期耐60°C高温，在120° C温度下能存活20分钟芽抱染色法是利用细菌的芽弛和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色， 使芽跑和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孑包壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此， 当先用一弱碱性染料，如孔雀绿( malachite green)或碱性品红(basicfuchsin)在加热条件 下进行染色时，此染料不仅可以进入

3、菌体，而且也可以进入芽孑包 进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽跑的染料则难以透出，若再用复染液(如番红液)或衬托溶液(如黑色素溶 液)处理，则菌体和芽弛易于区分。(1) 将培养24小时左右的枯草芽弛杆菌或其他芽弛杆菌，作涂片、干燥、固定。(2) 滴加3-5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。(3) 用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。 加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约4-5分钟。这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液(约7. 6%)染10分钟。(4) 倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。(5) 用番红水溶液复染 1分钟，水洗。(6

4、) 待干燥后，置油镜观察，芽弛呈绿色，菌体呈红色。在pH为5.58.5时生长良好，最适生长温度为370一、目的要求1、学习分离、纯化噬菌体的基本原理和方法。2、学习噬菌体效价测定的基本方法。二、基本原理因为噬菌体是专性寄生物，所以自然界中凡有细菌分布的地方，均可发现奇特异的噬菌体的存在，亦即噬菌体是伴随着宿主细菌的分布而分布的，例如粪便与阴沟污水中含有大量大肠杆菌，故也能很容易的分离到大肠杆菌噬菌体；乳牛场有较多的乳酸杆菌，也容易分离到乳酸杆菌噬菌体等。由于噬菌体侵入细菌细胞后进行复制而导致细胞裂解，噬菌体即从中释放出来，所以，（a）在液体培养基内可使混浊菌悬液变为澄清，此现象可指示有噬菌体存

5、在；也可利用这一特性，在样品中加入敏感菌株与液体培养基，进行培养，使噬菌体增殖、释放，从而可分离到特异的噬菌体；（b）在宿主细菌生长的固体琼脂平板上，噬菌体可裂解细菌 而形成透明的空斑，称噬菌体斑（图1）, 一个噬菌体产生一个噬菌斑，利用这一现象可将分离到的噬菌体进行纯化与测定噬菌体的效价。本实验是从阴沟污水中分离大肠杆菌噬菌体，刚分离出的噬菌体常不纯，如表现噬菌斑的形态、大小不一致等，然后再进一步纯化。噬菌体的效价就是1毫升培养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法，一般应用双层 琼脂平板法。由于含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌体斑，因此， 能进行噬菌体的计数。二、器材3

6、7 C培养18小时的大肠杆菌斜面，阴沟污水；本实验均用普通肉膏蛋白月东培养基500毫升三角瓶内装三倍浓缩的液体培养基100毫升，试管液体培养基，琼脂平板，上层琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，没管 4毫升），底层琼脂平板（含培养基10毫升，琼脂2% ）大肠杆菌18小时培养液，大肠杆菌噬菌体10-2 稀释液（用肉膏蛋白腺液体培养基稀释）含0.9毫升液体培养基的小试管4支，肉膏蛋白腺琼脂平板（10毫升培养基，2 %琼脂，作底层平板用），含 4毫升琼脂培养基的试管（0.7 %琼脂，作上层培养基用）5管，火菌小试管 5支，火菌1毫升吸管10支，48 C水浴箱等。灭菌吸管，灭菌玻璃途布器，灭菌蔡氏细

7、菌滤器，灭菌 抽滤器，恒温水浴箱，真空泵等。1、噬菌体的分离（1 ）制备菌悬液 取大肠杆菌斜面一支，加 4ml无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。(2 )增殖培养 于100ml三倍浓缩的肉膏蛋白月东液体培养基的三角烧瓶中，加入污水样品200ml与大肠杆菌悬液 2ml, 37 C培养1224小时。(3)制备裂解液将以上混合培养液 2500r/min 离心15分钟。将以灭菌的蔡氏过滤器用无菌操作安装于灭菌抽滤瓶上，用橡皮管连接抽滤瓶与安全瓶，安全瓶再连接于真空泵(如图2)。图上的真空表接或不接均可。将离心上清夜倒入滤器，开动真空泵，过滤除菌。所得滤液倒入灭菌三角瓶内，37 C培养过夜，以作无菌检查。(4

8、)确证试验经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在。(a)于肉膏蛋白月东琼脂平板上加一滴大肠杆菌悬液，再用灭菌玻璃涂布器将菌液涂布成均匀的一薄层。(b)待平板菌液干后，分散滴加数小滴滤液于平板菌层上面，里 37 C培养过夜。如果在滴加滤液处形成无菌生长的透明噬菌斑，便证明滤液中有大肠杆菌噬菌体。2 、噬菌体的纯化(1) 如果已证明确有噬菌体的存在，便用接种环取菌液一环接种于液体培养基内，再加人0.1毫升大肠杆菌悬液，使混合均匀。(2 )取上层琼脂培养基， 溶化并冷至48 C (可预先溶化、冷却，放48 C水溶箱内备用)加入以上噬菌体与细菌的混合液0.2毫升，立即混匀。(3 )并立即

9、倒人底层培养基上，混匀。置 37 C培养12小时。(4 )此时长出的分离的单个噬菌斑，其形态、大小常不一致，再用接种针在单个噬菌斑中刺一下，小心采取噬菌体，接入含有大肠杆菌的液体培养基内。于37 C培养。(5)等待管内菌液完全溶解后，过滤除菌，即得到纯化的噬菌体。(以上(1 ) ( 2 ) ( 3)三步骤，目的是在平板上得到单个噬菌斑，能否达到目的，决定于所分离得到的噬菌体滤液的浓度和所加滤液的量,最好在做无菌实验的同时，由教师先做顶备试脸，若平板上的噬菌体连成一片，则需减少接种量(少于一环)或增加液体培养基的量；若噬菌斑太少，则增加接种量。以免全班同学重做)。3、高效价噬菌体的制备刚分离纯化

10、所得到的噬菌体往往效价不高，需要进行增殖。将纯化了的噬菌体滤液与液体培养基按l : 10的比例混合，再加入大肠杆菌悬液适量 (可与噬菌体滤液等量或1/2的量)，培养，使增殖，如此重复移种数次，最后过滤，可得到高效价的噬菌体制品。4、噬菌体是效价测定(1 )稀释噬菌体(a)将4管含有0.9毫升液体培养基的试管分别标写10-3 , 10-4, 10-5和10-6。(b)用1毫升无菌吸管吸0.1毫升10-2大肠杆菌噬菌体，注入10-3的试管中，旋摇试管， 使混匀。(C)用另一支无菌吸管从吸 0.1毫升10 °大肠杆菌噬菌体，注入 10 *的试管中，旋摇试管，使混匀。余类推，稀释到 10-6

11、管中，混匀，如图所示。,D*LIU拜了的 I：ft S7tJ«»«V«(2) 噬菌体与菌液的混合(a)将5支灭菌空试管分别标写10-4 , 10-5,10-6 , 10-7和对照(b )用吸管从10 -3噬菌体稀释管吸0.1毫升加人10-4的空试管内，用另一支吸管从 10-4稀释管内吸0.1毫升 时加人10-5空试管内，如图 1直至10-7管。(C )将大肠杆菌培养液摇匀，用吸管取菌液0.9毫升加人对照试管内，再吸 0.9毫升假如10-7试管，如此从最后一管加起，直至10-4管，各管均加0.9毫升大肠杆菌培养液。(D)将以上试管旋摇混匀。(1)将5管上层培养基融化，标写10-4, 10-5 , 10-6 ,10-7和对照，使冷却至 48 C,并放入48 C水浴箱内。(2 )分别将4管混合液和对照管对号加入上层培养基试管内。每一管加入混合液后，立 即旋摇混匀。(3) 混合液加入上层培养基中(4) 接种了的上层培养基倒入底层平板上(a )将旋摇均匀的上层培养基迅速对号倒入底层平板上，放在台面上摇匀，使上层培养基铺满平板。(b )凝固后，放置37C培养(5) 观察平板中的噬菌斑将每个稀释度的噬菌斑数目记录于实验报告表格内，并选取30-30