【良心出品】3,5RACE流程

1、这个文件我看了，其实和普通的cDNA第一链的合成、 PCR 扩增技术步骤相似！只是引物不同罢了3端的克隆（ 3 RACE）特异性引物设计和合成根据测序的 Na+/H +逆向转运蛋白基因核心片段设计3端基因特异引物 P3（外TM侧引物）、P4（巢式引物），分别与 GeneRacerKit 提供的 3 Primer（3P）、3 NestedPrimer（3 NP）配对，分别用于外侧 PCR扩增和巢式 PCR扩增。 P3、P4由上海生工合成。P3： 5-CTGTATTCTTCTGTGGGATTGTGATG- 3P4： 5-TGGGATGGATGCTTTAGACATTGAG- 33P：5-GCTGTC

2、AACGATACGCTACGTAACG- 33 NP：5-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG- 31.2.3.2 cDNA第一链的合成（1）200l PCR管置于冰上，依次加入下列组分：Total RNA8lOligo dT Primer（0.82 g·l-1）1ldNTP Mix （25mmol·L -1）1lRNase-free ddH2O3l（2）轻轻混匀，瞬时离心收集液体。（3）65温育 5min，置于冰上冷却 1min，瞬时离心收集液体。（4）于冰上依次加入下列组分：5 First Strand Buffer4lDTT （ 1mol·L-1）

3、1lRNaseOut? （40U·l-1）1lSuperScript?IIIRT（200U·l-1）1l（5）轻轻混匀，瞬时离心收集液体。（6）50温育 1h。（7）70温育 5min以终止反应，置于冰上冷却2min，瞬时离心收集液体。-1（8）加入 1l RNase H (2U ·l)。（9）37 温育 20min，瞬时离心收集液体， 即可用于 3外侧 PCR扩增或 -20保存备用。1.2.3.3 外侧 PCR 扩增在200l PCR管中加入下列组分：Sterilized ddH 2O29.5 lMgCl 2 （25mmol·L -1 ）4l10 PC

4、R Buffer5ldNTP（ 2mmol·L -1）5lP3（ 10mol·L-1 ）1l3P（10mol·L-1 ）3 lcDNA2lTaq DNA polymerase（ 5U·l-1）0.5 lTotal50l轻轻混匀，瞬时离心后按下列条件进行反应：94 预变性 2min94变性 30sec57 退火 30sec30cycles72 延伸 1.5min72 延伸 10min取6l PCR产物在 1.2%的琼脂糖凝胶上电泳，检测是否扩增出条带。1.2.3.4 巢式 PCR 扩增取1l PCR产物用于巢式 PCR扩增，反应体系如下：Sterilize

5、d ddH2O32.5 lMgCl 2（ 25mmol·L-1 ）4l10 PCR Buffer5ldNTP（ 2mmol·L -1）5lP4（ 10mol·L-1 ）1l3 NP（10mol·L-1 ）1 lPCR product1lTaq DNA polymerase（ 5U·l-1）0.5 lTotal50l轻轻混匀，瞬时离心后按下列条件进行反应：94 预变性 2min94变性 30sec59 退火 30sec30cycles72 延伸 1.5min72 延伸 10min取6l PCR产物在 1.2%的琼脂糖凝胶上电泳，检测是否扩增出目的

6、片段。将获得的 3端目的基因的 PCR产物经过胶回收，连接到pUCm-T Vector，转化菌株，经 PCR鉴定后送出测序。方法同2.2。霸王液泡 Na+/H +逆向转运蛋白基因 5端的克隆（ 5 RACE）特异性引物设计和合成根据测序的 Na+/H +逆向转运蛋白基因核心片段设计5端基因特异引物 P5（外TM侧引物）、P6（巢式引物），分别与 GeneRacerKit 提供的 5 Primer（5P）、5 NestedPrimer（5 NP）配对，分别用于外侧 PCR扩增和巢式 PCR扩增。 P5、P6由上海生工合成。P5： 5-GAGCATCATTAGAGCAACCTCACGA-3P6：

7、5-TGAGAAGACCAGTAAATGCTCCCAG-35P：5-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-35 NP：5-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3总RNA 反转录前的处理总RNA 脱磷酸基团脱磷酸基团反应：（1）取 1.5ml离心管，置于冰上，依次加入下列组分：Total RNA7l10 CIPBuffer1lRNaseOut? （40U·l-1 ）1lCIP（10U·l-1 ）1lTotal10l（2）轻轻混匀，瞬时离心收集液体。（3）50温育 1h，瞬时离心，置于冰上。沉淀 RNA ：（1）加入 90l DEPC 水、 100l

8、 酚：氯仿：异戊醇（ 25： 24：1），颠倒混匀。（2）20 、12000rpm 离心 5min，吸取上清（约 100l）转移至另 1 支新的离心管。-1（3）加入 2l 10mg ·ml-1 贻贝糖源（ Mussel Glycogen）、10l 3mol L·NaAc（ pH5.2），混匀，加入220l95%乙醇，颠倒混匀，冰上静置10min。（4）4、 12000rpm 离心 20min，弃上清，小心不要冲掉沉淀。（5）加入 500l 70%乙醇，颠倒数次。（6）4、12000rpm 离心 20min，小心弃去乙醇，再次离心弃去剩余乙醇。（7）沉淀在室温下干燥1-2m

9、in，加入 7l DEPC 水溶解沉淀，用于下步去帽反应。去除帽子结构去帽反应：（ 1）取 1.5ml离心管，置于冰上，依次加入下列组分：Dephosphorylated RNA7l10 TAP Buffer1lRNaseOut? （ 40U·l-1）1lTAP （0.5U ·l-1 ）1lTotal10l（2）轻轻混匀，瞬时离心收集液体。（3）37温育 1h，瞬时离心，置于冰上。沉淀 RNA ：方法同 。连接到去帽后的 mRNA连接反应：TM（1）将7l已脱磷酸基团和去帽的 RNA 加入到含有 0.25 g GeneRacerRNAOligo的离心管中，轻轻混匀，瞬时离心

10、收集液体。（2）65温育 5min，以消除 RNA 二级结构。（3）冰上冷却 2min，瞬时离心。（4）依次加入下列组分：10 Ligase BufferATP（ mmol·L -1 ）RNaseOut? （ 40U·l-1）T4 RNA Ligase（5U·l-1）（5）轻轻混匀，瞬时离心。（6）37温育 1h，瞬时离心，置于冰上。沉淀 RNA ：方法同 。沉淀用 10l DEPC水溶解。第一链的合成（1）在上步获得的 10l ligated RNA 中加入下列组分：Random Primers (N6)-1dNTP Mix (25mmol ·L )R

11、Nase-free ddH2O（2）轻轻混匀，瞬时离心收集液体。（3）65温育 5min，置于冰上冷却 1min，瞬时离心收集液体。（4）于冰上依次加入下列组分：5 First Strand Buffer DTT(1mol·L -1)-1RNaseOut?(40U·l)1l1l1l1l1l1l1l4l1l1lSuperScript? III RT (200U-1 ·l1l)（5）轻轻混匀，瞬时离心收集液体。（6）25温育 5min后， 50温育 1h。（7）70温育 15min，置于冰上冷却 2min，瞬时离心收集液体。-1（8）加入 1l RNase H (2U

12、 ·l)。（9）37 温育 20min，瞬时离心收集液体， 即可用于 3外侧 PCR扩增或 -20保存备用。外侧 PCR 扩增在200l PCR管中加入下列组分：Sterilized ddH 2O30.5 lMgCl 2 （25mmol·L -1 ）3l10 PCR Buffer5ldNTP（ 2mmol·L -1）5lP5（ 10mol·L-1 ）1l5P（10mol·L-1 ）3 lcDNA2lTaq DNA polymerase（ 5U·l-1）0.5 lTotal50l轻轻混匀，瞬时离心后按下列条件进行反应：94 预变性 2min94变性 30sec59 退火 30sec30cycles72 延伸 1min72 延伸 10min取6l PCR产物在 1.2%的琼脂糖凝胶上电泳，检测是否扩增出条带。巢式 PCR 扩增取1l PCR产物用于巢式 PCR扩增，反应体系如下：Sterilized ddH2O32.5 lMgCl2 （25mmol·L-1 ）4l10 PCR Buffer5ldNTP（2mmol·L-1）5lP5（ 10mol·L-1 ）1l5 NP（10mol·L-1 ）1lPCR product1lTaq DNA polymerase（5U