疾病产生的分子基础

1、会计学1疾病产生的分子基础疾病产生的分子基础第1页/共73页2一、基因结构、表达异常与疾病发生一、基因结构、表达异常与疾病发生二、基因结构和表达与疾病的研究策略二、基因结构和表达与疾病的研究策略三、三、HGP与疾病相关基因的研究与疾病相关基因的研究四、生物信息学主要研究领域四、生物信息学主要研究领域第2页/共73页 人体内人体内蛋白质蛋白质分子分子结构和结构和功能功能的的异常异常是疾病发生发展是疾病发生发展的主要原因的主要原因 。第3页/共73页第4页/共73页第5页/共73页6第6页/共73页（二）细胞间信号异常（二）细胞间信号异常（三）细胞内因素（三）细胞内因素（一）基因的结构改变（一）基

2、因的结构改变第7页/共73页8第8页/共73页 （一）基因结构改变（一）基因结构改变 定义：定义：DNA一级结构发生改变一级结构发生改变，改变了基因结构。，改变了基因结构。第9页/共73页转换（转换（transitiontransition）颠换（颠换（transversiontransversion）第10页/共73页（3 3）插入（）插入（insertioninsertion）；）；第11页/共73页第12页/共73页 2.2.基因突变引起的遗传效应基因突变引起的遗传效应a.同义突变 (consense mutation)b. 错义突变 (missense mutation)c. 无义突变

3、 (nonsense mutation)d. 终止密码子突变或延长突变e. 起始密码子突变 (initiation codon mutation)f. 非编码序列点突变 (point mutation in noncoding sequence)第13页/共73页14同义突变同义突变 、错义突变、无义突变、延长突变、错义突变、无义突变、延长突变、起始密码子突变、非编码序列点突变起始密码子突变、非编码序列点突变第14页/共73页3. 3. 基因突变影响不均一核基因突变影响不均一核RNA(RNA(hnRNAhnRNA) )的剪接的剪接 基因突变发生在 hnRNA 一级结构特定的剪接位点上，导致 h

4、nRNA 的剪接错误，产生异常的 mRNA，产生异常的蛋白产物，改变生物性状。第15页/共73页4. 结构基因改变导致蛋白质变化引起疾病结构基因改变导致蛋白质变化引起疾病血红蛋白分子一级结构上的轻微差别；正常成年人血红蛋白中的链的第六位的谷氨酸残基被缬氨酸取代就会导致镰刀形细胞贫血病的异常血红蛋白HbS 的生成。第16页/共73页血红蛋白病血红蛋白病镰刀形细胞贫血症镰刀形细胞贫血症第17页/共73页第18页/共73页地中海贫血：珠蛋白合成地中海贫血：珠蛋白合成( (量量) )减少，又称珠蛋白合成减少，又称珠蛋白合成障碍性贫血。障碍性贫血。 第19页/共73页基因突变类型基因突变类型 异常异常H

5、b 氨基酸变化氨基酸变化 临床特征临床特征 错义突变错义突变 Hb Shuangfeng 27GluLys(GAGAAG) 不稳定Hb病 Hb S 6GluVal(GAGGUG) 镰刀型细胞贫血 Hb Bibba 136LeuPro(CUGCCA) 不稳定Hb病 无义突变无义突变 Hb Mckees Rocks 145Tyr终止(UAUUAA) 不稳定Hb病 终止密码突变终止密码突变 Hb Constant Spring 142UAACAA- - -地贫 (延长：142Gln- -173UAA) 密码子缺失密码子缺失 Hb Gun Hill 9195缺失 不稳定Hb病 密码子插入密码子插入 H

6、b Grady 118与119间插入3个氨基酸 无明显症状 移码突变移码突变 Hb Tak 147UAAACU AA- 不稳定Hb病 -158UAA(Thr) 第20页/共73页 5. 5. 常常见单基因病：见单基因病：疾病名称疾病名称 发病频率发病频率( ) 遗传方式遗传方式 致病基因致病基因 典型症状典型症状血友病血友病A 0.1 X连锁连锁 凝血因子凝血因子 不规则出血不规则出血血友病血友病B 0.03 X连锁连锁 凝血因子凝血因子 不规则出血不规则出血杜氏肌营养不良杜氏肌营养不良 0.3 X连锁连锁 肌营养因子肌营养因子 肌萎缩肌萎缩贝氏肌营养不良贝氏肌营养不良 0.05 X连锁连锁

7、肌营养因子肌营养因子 肌萎缩肌萎缩脆性脆性X综合征综合征 0.5 X连锁连锁 FMR1 智力障碍智力障碍舞蹈病舞蹈病 0.5 常染色体显性常染色体显性 舞蹈病因子舞蹈病因子 痴呆痴呆神经纤维神经纤维 0.4 常染色体显性常染色体显性 NF-1,2 癌变癌变珠蛋白生成障碍性贫血珠蛋白生成障碍性贫血 0.05 常染色体隐性常染色体隐性 珠蛋白基因簇珠蛋白基因簇 贫血贫血镰刀细胞贫血镰刀细胞贫血 0.1 常染色体隐性常染色体隐性 珠蛋白基因珠蛋白基因 贫血贫血, 局部缺血局部缺血苯丙酮酸尿苯丙酮酸尿 0.1 常染色体隐性常染色体隐性 苯丙氨酸羟基化酶苯丙氨酸羟基化酶 无苯丙酮酸代谢能力无苯丙酮酸代谢

8、能力囊性纤维化囊性纤维化 0.4 常染色体隐性常染色体隐性 CFTR 进行性肺损伤及其他进行性肺损伤及其他 第21页/共73页第22页/共73页第23页/共73页第24页/共73页第25页/共73页第26页/共73页二、二、基因结构和表达与疾病的研究策略基因结构和表达与疾病的研究策略1通过结构分析确定基因变异 PCR-SSCP、PCR-RFLP、直接测序法、TaqMan探针法SNP分型、SNaPshot分型法、Mass Array分型法2基因表达水平分析 差异显示、基因表达芯片、RNA-seq分析3通过功能学研究确定致病基因 转基因技术、基因敲除、RNAi技术、基因诱导超表达第27页/共73页

9、281 1通过通过结构分析结构分析确定基因变异确定基因变异 PCR-SSCP、PCR-RFLP、直接测序法、TaqMan探针法SNP分型、SNaPshot法、Mass Array法第28页/共73页29第29页/共73页30（2）限制性片段长度多态性）限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)第30页/共73页第31页/共73页32第32页/共73页33第33页/共73页34针对染色体上的不同SNP位点分别设计PCR引物引物和TaqMan探针探针，进行实时荧光PCR扩增。探针的5-端和3-端分别标记一个报告荧光基团报告荧光基团和一个淬灭淬灭荧光基团荧光基团。存在PCR产物时，产生适合于核酸外切酶

10、核酸外切酶活性的底物，从而将探针5-端连接的荧光分子荧光分子从探针上切割下来，发出荧光。通常用于少量SNP位点分析。第34页/共73页35通常用于通常用于10-30个个SNP位点分析位点分析第35页/共73页36MassEXTEND单碱基延伸反应，紧挨SNP位点设计一段探针，在反应体系中以ddNTP替代dNTP，使探针仅在使探针仅在SNP位点处延位点处延伸一个碱基即终止。伸一个碱基即终止。根据SNP位点的不同，探针将结合不同的ddNTP，从而具有不同的分子量，质谱仪即可检测出这种分子分子量量差异，从而实现SNP分型的目的。第36页/共73页37 差异显示、基因表达芯片、RNA-seq分析第37

11、页/共73页 在不同的生长时期、在个体的发育与分化的不同阶段、在生物体对疾病的反应以及不同的环境下调控基因的表达是不同的，这就是基因的差别表达（differential expression）。第38页/共73页原理原理：利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增。3端引物端引物：利用mRNA的poly A尾巴设计。根据mRNA结构分析知道，poly A尾巴之前的两个碱基只有12种可能的排列组合：根据这12种排列组合，设计12种不同的引物。这些引物由1112个 T 及两个其它的碱基组成，用通式5-T11MN或5-T12MN表示，M为A、G、C的任一种，N为A、G、C、T的任一种。这种引物称锚定

12、引物。第39页/共73页5端引物：5端为10个碱基（10-mer）组成的随机引物。每一个随机引物都可能与总mRNA中的某一些分子发生杂交，杂交位点也可能在mRNA的不同位点上。用 3锚定引物和 5随机引物进行扩增，可获得50100条100500bp的DNA扩增带。为了要寻找更多的DNA差异带，应使用全部的12种锚定引物以及尽可能多的5随机引物。第40页/共73页第41页/共73页42第42页/共73页43第43页/共73页44第44页/共73页45第45页/共73页463通过通过功能学功能学研究确定致病基因研究确定致病基因 转基因技术、基因敲除、RNAi技术、基因诱导超表达第46页/共73页第

13、47页/共73页48 显微注射法：显微注射法：在显微镜下，直接将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。第48页/共73页49第49页/共73页50第50页/共73页（2）基因敲除技术）基因敲除技术定义：通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。定义：通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。 应用应用DNA同源重组原理进行基因敲除。同源重组原理进行基因敲除。 利用随机插入突变进行基因敲除利用随机插入突变进行基因敲除 RNA干扰也可以引起基因敲除干扰也可以引起基因敲除第51页/共73页52第52页/共73页 利用随机插入突变进行基因敲

14、除利用随机插入突变进行基因敲除基因捕获法基因捕获法 利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。第53页/共73页第54页/共73页转录后基因表达抑制现象的发现转录后基因表达抑制现象的发现CHS GeneCHS Gene矮牵牛花矮牵牛花(Jorgensen, R, 1990)第55页/共73页RNA干扰干扰(RNA interference, RNAi) RNAi 是将一段双链的RNA 序列导入机体或细胞中,机体或细胞中与之有同源序列的基因表达将会受到抑制,甚至表达

15、受到完全抑制第56页/共73页 三位在基因敲除技术敲除技术方面进行了卓越、开拓性工作并取得了显著成就的科学家分享了诺贝尔生理或医学奖，他们是美国盐湖城犹他州大学的Marie Capecchi教授、美国北卡罗来纳州大学的Oliver smithies教授以及英国加蒂夫大学的Martin Evans教授 第57页/共73页第58页/共73页随着人类基因组草图测定的完成，宣告了随着人类基因组草图测定的完成，宣告了“ 后基因组时代后基因组时代 ”的到的到来。来。功能基因组学功能基因组学成为研究的重心，成为研究的重心，蛋白质组学蛋白质组学的研究受到了空前的关注的研究受到了空前的关注，也为疾病相关基因的克

16、隆创造了条件。，也为疾病相关基因的克隆创造了条件。第59页/共73页同一种细胞或组织，处于不同的状同一种细胞或组织，处于不同的状态（态（生理与病理生理与病理等），发育的不同阶段等），发育的不同阶段，受到外界的不同影响时，都可能使细，受到外界的不同影响时，都可能使细胞中蛋白质的情况产生相应的变化，从胞中蛋白质的情况产生相应的变化，从而产生不同的蛋白质组。蛋白质组学关而产生不同的蛋白质组。蛋白质组学关注和研究的就是这些变化。注和研究的就是这些变化。第60页/共73页第61页/共73页第62页/共73页第63页/共73页第64页/共73页第65页/共73页2003-2-1630两种慢性髓系白血病细胞对干扰素干扰素的不同反应性的不同反应性2002年度总结报告年度总结报告中南大学湘雅医学院分子生物学研究中心Thank you!Thank you!第66页/共73页转换（转换（transitiontransition）颠换（颠换（transversiontransversion）第67页/共73页第68页/共73页4. 结构基因改变导致蛋白质变化引起疾病结构基因改变导致蛋白质变化引起疾