蛋白质的盐析

1、蛋白质的盐析Docume nt serial number NL89WT-NY98YT-NC8CB-NNUUT-NUT108蛋白质的盐析验证型一、实验目的了解在工业化生产过程中使用NHJ $0,的情况.及NH V: S0 使用时的注意爭项。二、实验原理用商浓度中性盐使貳白质从溶液中沉淀出來的方法称盐析。常用的中性盐有NHJ必0小XaCI等。岛浓度中性盐能使蛋白 质沉淀是因为它具有脱水性，能脱去贵白质胶粒水膜又有中和贵白质胶粒外双电层电荷的作用。不同蛋白质盐析时所需盐浓度不同，故调节盐浓度.可适十地将蛋白质分幵。如球蛋白在半饱和硫酸钱溶液中沉淀？清蛋白在饱和硫酸馁溶液中沉淀，用盐析法沉淀的蛋白质

2、并未变性，用稀释的方法或透析的方法可使之复溶。三、器材与试剂1 发酵溶液2、10%的三氯醋酸溶液3、饱和NH V 心溶液4、NH, £:粉末四、实验步骤1取发酵溶液5".加饱和讯鈕溶液ImI2mI3mI4mI5mE混匀，静止数分钟即有白色沉淀析出，应为何物 ？过滤至淸.除去沉淀， 滤液备用。取少址沉淀加H4看是否复溶？2 取濾液0? 5ml.加10%的三氯醋酸数滴，有白色沉淀产生，应为何物？然后在 721分光光度 0D& : o下进行透光率的检测.检 测时必须在倒入比色皿以后 10秒内读取为什么？。在进行检测时应注慰将 721分光光度讣调整到0D曲 在测址前应把机

3、器预热 半小时左右。在检测时应注意有效的检测范憎是 T值15弔以上到70弔以下o3另外，取滤液2. 5ml于小烧杯中.力【1 NH 另X粉末.随加随搅拌，直至NHJ不能溶解为止，有白色沉淀产生， 应为何物？然后过滤至清.除去沉淀，过滤备用。4将1 - 3做的滤液中加10$三氯醋酸数滴观察有无沉淀产生。找到没有沉淀的加饱和 NHJ : S0j容液的点。然后在721 分光光度计0D&。下进行透光率的检测。并且作出曲线。5对大址的发酵液进行处理，在濾液中加10%三氯醋酸数滴观察有无沉淀产生。V 6盐析曲线的制作方法：如果要别离一种新的贵白质和酶.没有文献数据可以借鉴，那么应先确定沉淀该物质的

4、硫酸钱饱和度。具体操作方法如下：取已定址测定贵白质或的的活性与浓度的待别离样品溶液.冷至09? 5C,调至该贵白质稳定的pH值.分610次分别参加不同量的硫酸饭.第一次加硫酸钱至责白质溶液刚幵始出现沉淀时，记下所加硫酸钱的：这是盐析曲线的起点。继续加硫酸饭至溶液微微混浊时.静止一段时间.离心得到第一个沉淀级分，然后取上清再加至混浊，离心得到第二个级分.如此连续可得到6? 10个级分，按照每次参加硫酸饮的址.査出相应的硫酸钱饱和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定休积的适宜的pH缓冲液中.测定其贵白质含虽和酶活力。以每个级分的蛋白质含虽和酶活力对硫酸饮饱和度作图.即可得到盐 析曲线。五、盐析本卷须

5、知：1?盐析的成败决定于溶液的 pH值与离子强度，溶液pH值越接近责白的等电点，蛋白质越容易沉淀。2?盐析一般用的硫酸恢.容易吸潮？因而在使用前，一般先磨碎，平铺放入烤箱内60C烘干后再称址.这样更准确。3?在参加盐时应该缓慢均匀.搅拌也要缓慢.越到后來速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐.应该等其完全溶解后再 加盐.以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。4.盐析后最好搅拌40分钟到一个小时而且再在冰浴中放宜一段时间。为门磁免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。5?盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理 .以免变性，透析较慢，一般可用超滤或者G-25. G-50处理。6.般粗提物蛋白完全沉淀

6、是在硫酸饮浓度在70%左右。兀、盐析影响因素：1. 蛋白质的浓度：中性盐沉淀蛋白质时.溶液中蛋白质的实际浓度对别离的效果有较大的影响。通常髙浓度的黃白质用稍低的硫酸钱饱和度即可将其沉淀下來.但假设貳白质浓度过岛.那么易产生各种蛋白质的共沉淀作用.除朵蛋白的效果会明显下降。对低浓 度的贵白质， 婆使用更大的硫酸饮饱和度，但共沉淀作用小，别离纯化效果较好 .但回收率会降低。通常认为比较适中的蛋白质 浓度是 2? 5%3? 0%, 相当于 25mg/mL ? 30mg/mL°2. 离子强度 : 各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。3. 盐的性质：最有效的盐是多电荷阴离子。4. pH 值：一般说來，贵白质所带净电荷越女 . 它的溶解度就越大。改变 pH 值可改变蛋白质的带电性质，閃而就改变了蛋白质的溶 解 度。远离等电点处溶解度大 . 在等电点处溶解度小 ?因此用中性盐沉淀蛋白质时， pH 值常选在该蛋白质的等电点附近。5. 温度：除对温度敏感的蛋白质在低温 ro 操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质如血红貳白、肌红蛋白、清蛋白在较舟的温度 259比TC时溶解度低.见容易盐析。黃白质沉淀后宜在 4C放3小时以上或 过 夜，以形成较大沉淀而易于别离。盐析时 . 分子虽较小的黃白质逐步沉