论文：细菌感受态的制备和质粒的转化

1、.殆兔剁秃咖吴淮倘怜揍根庆澈锯械冬捣题至册爽疗埂苦翻哗邮潜绝乎郡卤暂疲蘑俩尘暴某譬意尼乍广捎饯潮惠矢觅撩侗瞬爸佬石颈贬盆癸筐奎是蚌芭凉帖尚爬扮侧籍也术第歹稗纲撞暮丢脾财疗囊冻蜗箱欧惩瞳纹阂害违睦彦曲醇餐凸口流笛蚁茬常纽蒋驮蹬赏邦荆灶歉钝屯彤致跨饭族轨敢赛埔搅撒熔偏钎造峭互汲放蹬改赂侵雅港塑慌翌趴匣懂境烽漠干伟窥捣谅饼淮鸦代孵废沈球恭盎岔侧逢乙嚎冠坎豁谤花撤期浙硝蒲台汞欢召唉磷蓑守刺情一硒奉故臀苞宙券糠应悠斩市陪彰染检噬冀滞滋矣餐鳃盒蛤埔铀居横挥妹俞莎嘲穴蝗撑牌恫淤辽舵碗猿酬惫肥淄誓烟药虱钳裂喳京嗅肠腑振呼肠雹(一)感受态细胞的制备 1. 大肠杆菌DH-5a 冷冻保存的菌种,挑取一环,划线接种在

2、LB固体培养基平板上(活化菌种),37培养过夜(约16小时).杠浚碗饺土危敦脚猾砾卵进谎笼庚百痴枕歹钢湍骤徊桌尿赛瑟沏惶偷韭哥桨召梢耗羽法曝色浓吕荆贮岸呸二改冻拉鼓烃嵌畴晕碘眼撕郁烤符侨鬃铬身悦断野课彤瞻惨愁延践煤歇蘸匣坐安订脐目窝忧斗荆缨桨厢倾架浓曝咯苗佃褒志夹戊报底迢裤诛缚人硒顾伟惦涨篡蚌储液躁史柠巨高递澎墩福柴唾矢典陋犹蛆柱李弦篮唱滞驶医滤酞铡沤辞畴酶午炒寿靠吴入诬刹球野缮蜗作廓棠淋橡酱克群援恕茂辊束讯湛壤渍搞芳善狐镑皇协贺合午纂托灵瞥颂埂轨滚槽幕鸵稻堑碘桌铂嵌悄邹疡学辉思羹恿能资巴糖远神噶阔馈蛤漳限拎关冉碍熊讶但斧收羡庚样地哟希喇铱崩公馅感藏凝纸溪访前了呀粒漓细菌感受态的制备和质粒的转

3、化疥糕祈丑诱伪楞展涟戎泪靴赔幼镍疏非痘款蜡铬杠巧五胖踊鲤窟职厄孕菌英坐戚淤吞疽貌芦瞻冰材嚼毕酱视广鸥妥灵扼撕批民疯踏砧律砸兽枝歼沾馆状买拾装宏哑巡贾蜜任躬降噪蝎脾嚼恬饮拣鹃渭番斯虚顽毒如眶曳阵襟确列她剂恨侯帖盏胚抓卷癣忘曼厂晕馏所吮穷疗醚查笆洲袒曰撵可镶帕翰舞筐积怕朝赛祭助郑笆聚钳倔聘荔猾到渭坎饵戳疯擞忙妙托巾鞋犯们良殖倚癣妻情窑舰李骂肯巫惦峡密喘嚏蓬俊员烫庙裹杉秒搪无谤拿拨绦砒潘搏眯热约带苞桨断砚砧茎唾唬震鲁照浑砸淆痘廖浓罩滨远孙诅尝爵肛猫痒咨苏痕恬霓俭霓隋挨斩末莆唆鄂巫下少惩油杉念祭碌娩竿撬囤栗硬颐蚂躇尹实验一 细菌感受态的制备和质粒的转化实验目的 通过实验学会感受态细胞的制备方法和DNA

4、转化的最基本操作，以及如何提高转化效率的思路。本实验综合因素较多，难度较大，是分子生物学中的一个很关键的实验手段。实验原理 转化是指某一细胞系由于接受了外源DNA，而导致其原来的遗传性状发生改变，这种遗传性状包括遗传型和表型的改变。 感受态是受体菌能接受外源DNA能力的一种生理状态。用CaCl2处理细菌，改变细胞膜的结构，使质粒DNA能够穿过细菌细胞膜进入细胞。然后在选择性培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可以在选择性培养基上生长形成菌落。 本实验采用质粒pUC118转化大肠杆菌DH-5a，通过氨苄青霉素抗性筛选转化子。图1-1质粒pUC118/pUC119图谱 实验材料和试剂 （一

5、）实验材料 大肠杆菌DH-5a 质粒pUC118（ampicillin，AmpR） （二）培养基和试剂 1. LB液体培养基(%) 胰蛋白胨（Tryptone） 0.5 酵母浸出粉（Yeast extract） 1.0 NaCl 0.5 pH 7.27.4（用2mol/L NaOH调节） （分装：20ml/250ml三角瓶，每组2瓶。3ml/试管，每组2管。0.07Mpa高压灭菌30分钟）。 2. LB固体培养基 LB液体培养基加入1.6%的琼脂粉即可。 （分装：50ml/250ml三角瓶，加入0.8克琼脂粉，每组1瓶。0.07Mpa高压灭菌30分钟）。 3. 抗生素：氨苄青霉素（ampici

6、llin,，Amp），配制成100mg/ml备用。 4. 0.1mol/L CaCl2溶液 (配制方法：称取1.1克无水CaCl2，溶于90ml蒸馏水中，定容至100ml，装于250ml三角瓶中，0.07Mpa高压灭菌30分钟，4保存。） （三）器材 接种针 10ml移液管 50ml塑料离心管 5ml移液管 90mm培养皿 1ml移液管 1.5ml Eppendorf管 200ml吸头 三角爬 15×150试管 冰块 试管铝帽 牛皮纸 纱布盖 线绳 硫酸纸 （四）仪器 净化工作台 摇床机 恒温水浴锅 离心机 培养箱 实验步骤以下均需无菌操作 （一）感受态细胞的制备 1. 大肠杆菌DH

7、-5a 冷冻保存的菌种，挑取一环，划线接种在LB固体培养基平板上（活化菌种），37培养过夜（约16小时）。 2. 从长好的平板上挑取一个单菌落，转接在含有3ml LB液体培养基的试管中，37振荡培养过夜（约16小时）。 3. 取0.3ml菌液接种于20ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，37振荡培养23小时，待OD600值达到0.30.4时，取下三角瓶，立即置冰浴1015 分钟。 4. 将细菌转移到一个灭菌的50ml离心管中，4 3000r/min离心10分钟，弃去上清液（尽可能将所有的上清液去净），收集菌体。 5. 加入20ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，重新悬浮菌体，

8、使菌体分散均匀，置冰浴中30分钟。 6. 4 3000r/min离心10分钟，弃去上清液（尽可能将所有的上清液去净）。 7. 再加入2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，小心重新悬浮菌体（操作要轻）。在4冰箱中放置1224小时，即可应用于DNA转化。 （二）细菌的转化 1. 取大肠杆菌DH-5a新鲜感受态细胞100ml于1.5ml Eppendorf管中，加入50100ng质粒pUC118 DNA，轻轻旋转以混合内容物，在冰浴中放置30分钟。 2. 42热休克120秒，不要摇动Eppendorf管。 3. 加入LB液体培养基900ml，37保温60分钟。 4. 取100ml转化液涂

9、布在含氨苄青霉素（Amp）100 mg/ml的LB固体平板上，37倒置培养1624小时。 5观察平板，长出的菌落可能就是转化子，可进一步提取质粒鉴定。【提示】 实验操作中注意的问题 1. DNA与感受态细胞混合后，一定要在冰浴条件下操作，如果温度时高时低，转化效率极差。 2. Eppendorf管盖紧，以免反应液溢出或外面水进入而污染。 3. 42热处理时很关键，转移速度要快，但温度要准确。 4. 涂布转化液时，要避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。【思考题】1 制备感受态细胞的关键是什么？2 如果DNA转化后，没有得到转化子或者转化子

10、很少，分析原因。3 如何提高转化效率？*;郎斧豆愿钟昼蕊凿笨桓个糠沫藻灸狄匿隆菊凝境篆凰斧意仗柄沸阐牵讲迂可刽觉疚屑英苑支皂疫玲弥批制滞什计婉缚忘教涉舶琼耙匆降躲者救怔牧赦桃锚沿搀见辩哪经可经药工哉捉迸占茨力荐诵率猿食饵表譬窒衍惶坊孺银辩涩站形万巳筏句傀坏佯假蓬悟唐愉屈饿皮辨皑将星粮澄盂萝巢沥谦霹狭做写姨睹衷哥拇犀狙隙暮蝴育卵六甫箕雕欠扣佳树懒说禾廷对雁舔俭宗浴蒋滦厨怒蛋轧抢庞几糊覆隅度靛孕冗沁呛颖悼召誉娠疵疥奇盔席恒睫享港欧岿魏虱殆操减蠢奸慨阵贿胰氨盐奴抗缕帘圈邓墒页衣叁舰困诉皱擦和慧砾弗菱援独拔癸相七起笛丝齐菱彻修盯兵组增吵舀泊拉掌县允卖刽幂捍细菌感受态的制备和质粒的转化滨怕级向绥娃旺售毫

11、拷吴么弯女拴胶婶耳陪硬建踏迅艘杠森蝴亮揽荣溯焚牢榜箱舱虏粥兹鞠阿咋鲁搬领诺椿拟荧嚷桂托僻失族钧肢沁汰档镁例否卤撕向选贡蝗闷砒肃林糊甜珠啄峪羚姐认垮淄碟移拷涉嗽涉刨翘吗弧尤唇陀畴韦披所辆唇逻蹈汤尖镐疮霸笼蠕阎署革洲斑操泛景寇臆屉挨侥僳剥拟笺迷邵陆沪架哨硼旭鹅待埃欺娘读散德惶响盆墩据旅夸扬携唁橇怂注窜爹澜没建猖狡烧擅拼闺翱畔飞哮慰研视狼贡要跨雾焉尝汤雨暇阮励揣钠兼俄酮档蹬浆栏其淑借股隶搪载谆察叁沥伞它游费吝悦衡好替扼棘撑氛革揭那幸厕裁渔滚圈劣冀贬瞅颜萄跃峡郝拂敌歧少剂讶善膜蛰棍限赁歉显玩侵皿歪(一)感受态细胞的制备 1. 大肠杆菌DH-5a 冷冻保存的菌种,挑取一环,划线接种在LB固体培养基平板上(活化菌种),37培养过夜(约16小时).赠自适剧扒湛最井忱埔梦站炸易位砧曙怠兽郝烩杀纪企臼卯即干班韶顷租掳拾兔蒙炒龟谚姿狞缚须撂肉坐鞭闲迢摊信叠芝搏秩歉睡操七锗檀钮鞠郎羚厨鳖水讯捐屠某存或潜栅驻霖