奶牛乳房炎病原菌分离鉴定及耐药性试验

1、奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及耐药性试验摘要：为查清伊利合肥牧场奶牛乳房炎的主要病原菌种类、分布情况以及病原菌的耐药情况，并为奶牛乳房炎的综合防治提供依据，对本场采集的20份临床型乳房炎奶样进行细菌分离鉴定，并对主要病原菌进行药敏试验。共分离到13株细菌，结果金黄色葡萄球菌6株、表皮葡萄球菌2株、无乳链球菌1株、大肠杆菌3株、铜绿假单胞菌1株。在所选用的11种常用药物中，新霉素、乙酰螺旋霉素、壮观霉素、强力霉素对所分离的病原菌都有较好的杀灭作用，庆大霉素、红霉素、氯霉素、卡那霉素对革兰氏阳性菌的杀菌效果较好，而对革兰氏阴性菌不敏感。常用药物如青霉素、链霉素、磺胺类药物的抑菌效果不明显，大多菌株已

2、产生耐药性。关键词：奶牛乳房炎；病原菌；分离鉴定；药敏试验isolation and identification of pathogenic bacteria causing dairy cattle mastitis and drug sensitivity teststudent majoring in veterinary zhang saitutor ren baoboabstract: to indagate the species and distributing of the main pathogetic bacteria causing dairy cow mastitis

3、 in yili cattle farm in hefei, identify the susceptivity to antibiotic of mail pathogens , and to provide a theory evidence for comprehensive prevention and control of dairy cow mastitis . 20 milk samples from the clinically infected cattle were collected from this cattle farm, and the main pathogen

4、s were identified and then used for drug sensitive test. we got 13 from 20 sample,including 6 isolates of staphylococcus aureus,2 of staphylococcus epidermidis,1 of e.coli., 3 of streptococcus agalactiae,1 of pseudomonas pyocyaneas.the result of sensitivity against 11 kind of common antibiotics show

5、s that all the strains are sensitive to neomycin sulfate,acetylspiramycin,spectinomycin doxycycline,and all gram-positive strains are sensitive to gentamicin sulfate ,erythromycin,kanamycin sulfate,chloramphenicol,while the opposite to gram-negative strains. the most popular antibiotics such as penn

6、icillin,streptomycin sulfate,sulfonamide,are not so effective because resistant against antibiotics above produced in majority of them.key words: dairy cattle mastitis; pathogens; isolation and identification; drug sensitive test(dst)引 言奶牛乳房炎是奶牛乳腺组织受到物理，化学，微生物等因素的不良刺激而引起的炎症反应，是奶牛最常见的一种疾病，也是奶牛生产危害性最大

7、的一种疾病。美国乳房炎委员会（nmc）在1978年根据乳房和乳汁有无肉眼可见变化，将奶牛乳房炎分为临床型和隐性型两种。临床型乳房炎主要表现为乳腺组织不同程度的红肿热痛和乳汁变性。隐性乳房炎又称亚临床型乳房炎，无临床症状表现，乳房和乳汁无肉眼可见的异常变化，但乳汁在理化性质和细菌学上已发生变化，实际生产中常被忽视，如不及时治疗，极易转化为临床型乳房炎1。1 材料与方法1.1 材料 1.1.1主要培养基普通琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、伊红美兰琼脂培养基、三糖铁培养基、ss琼脂培养基、血琼脂培养基、营养肉汤，培养基均按照常规方法配制2。葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、山梨醇、七叶苷、枸橼酸盐、

8、马尿酸盐、尿素酶等微量生化发酵管，并进行vp试验、mr试验和吲哚试验。生化鉴定所用的微量发酵管和培养基材料均购自杭州天和微生物试剂有限公司。1.1.2药敏纸片青霉素（青霉素类）、链霉素（氨基糖苷类）、新霉素（氨基糖苷类）、卡那霉素（氨基糖苷类）、庆大霉素（氨基糖苷类）、氯霉素（氯霉素类）、红霉素（大环内酯类）、乙酰螺旋霉素（大环内脂类）、壮观霉素（大环内酯类）、强力霉素（四环素类）、磺胺嘧啶钠（磺胺类），均购自济宁正阳微生物试剂有限公司。1.1.3其他仪器吸管，试管，锥形瓶，接种针，酒精灯，培养皿，l棒，显微镜，盖玻片，载玻片，革兰氏染色试剂（乙醇，碘液，结晶紫，复红），恒温培养箱，高压灭菌锅

9、等。1.2方法1.2.1 乳样采集 待检奶样20份，采自伊利合肥牧场。在泌乳牛群中，随机选择临床型乳房炎奶牛20头，采样前先用40左右的温水将4个乳区及乳头清洗干净，用干净毛巾擦干，再用75%酒精棉球消毒乳头，每次清洗或消毒乳头后均用灭菌纸巾擦干。弃去每个乳区的头三把乳，将四个乳区的乳汁收集到灭菌锥形瓶中，均匀混合后，吸取510ml乳汁于无菌试管中，作为待检乳样。每一乳样做好标记，放置在装有冰块的保温箱中，尽快送回实验室进行细菌培养和相关检测4。1.2.2细菌分离鉴定将采集到的每份乳样均做增菌处理,方法如下，按常规方法配制营养肉汤3，用无菌吸管吸取1ml乳样加于10ml营养肉汤中，放置在37的

10、恒温箱中培养24h。第二天，将营养肉汤用接种针划线接种于普通琼脂培养基和血液琼脂培养基，放置于37的恒温箱中培养24h，然后观察细菌形态特征。挑选形态不同的典型菌落涂片，经革兰氏染色后，在显微镜下观察细菌染色特征。1.2.3动物致病性试验取纯化细菌菌样，接种于营养肉汤中，放置于37恒温培养箱中培养24h后取出备用。将该肉汤培养物接种于兔血液琼脂平板，37培养24h、48h、72h后观察溶血现象。同时，取该肉汤培养物，以每只0.5ml的剂量进行小白鼠腹腔注射，每个菌样做三个重复及生理盐水对照。观察24h内的发病死亡情况，对发病明显或死亡者进行剖检，取小白鼠的心、肝组织涂片、革兰氏染色镜检，若与注

11、入腹腔的菌样相同，则可判断此菌为病原菌。未见发病者，继续观察一周3。1.2.4药敏试验依据琼脂纸片扩散法设计药敏试验3。从已经分离鉴定的细菌培养物上，用接种环挑取一环接种于含有5ml营养肉汤的试管中，放置于37恒温培养箱中培养8h后取出，与0.5号麦氏标准管进行浊度比较，若肉汤浊度低于0.5号麦氏标准管浊度，继续培养；若肉汤浊度超过0.5号麦氏标准管，则用生理盐水稀释，调节至与0.5号麦氏标准管相同的浊度。滴加0.5ml菌液于血清琼脂平板表面，用“l”棒均匀涂布于平板表面，待平板表面稍干燥后，用无菌镊子夹取药敏纸片，按一定距离分别贴于平板上，轻压纸片，保证与琼脂表面完全接触，纸片之间的中心距离

12、应大于24mm。将粘贴药敏纸片的平板倒置放于37恒温培养箱中培养24h后取出，用游标卡尺测量每个抑菌圈的直径。参照有关资料判定细菌对药物的敏感程度，直径小于16mm为不敏感，16mm20mm为中度敏感，大于20mm为高度敏感4。2 结果与分析2.1培养及染色特性 对20份随机采取的乳样进行细菌的分离鉴定，共分离得到13株细菌。依据革兰氏染色特性，可将该13株细菌划分为革兰氏阳性球菌和革兰氏阴性杆菌。其中9株细菌经革兰氏染色镜检，菌体呈紫色、规则或不规则圆形，链状或葡萄串状排列，为革兰氏阳性球菌；另外4株细菌在显微镜下观察，菌体呈红色杆状，散在或多个聚集排列，为革兰氏阴性杆菌。在9株革兰氏阳性球

13、菌中，有8株在普通琼脂培养基和鲜血琼脂培养基上生长良好，形成金黄色、灰白色或柠檬色圆形菌落，部分菌株表现溶血现象；其余1株在普通琼脂培养基上生长不良，在鲜血琼脂培养基上生长良好，呈现灰白色、隆起的菌落，形成透明溶血环。在4株革兰氏阴性杆菌中，有3株在普通琼脂培养基上形成黄白色、光滑湿润的圆形菌落，在麦康凯琼脂培养基上形成密集连接的红色菌落，在鲜血琼脂培养基上表现溶血现象；其余1株在普通琼脂培养基上形成光滑湿润、中间隆起的黄绿色菌落，具有芳香气味，菌落成单或成双排列。2.2 生化试验2.2.1接触酶实验结果在待测的9株细菌中，有8株细菌能够产生气泡，即接触酶试验呈现阳性结果；另外1株细菌在实验过

14、程中没有气泡产生，即接触酶试验呈现阴性结果。2.2.2凝固酶试验结果在待测的8株细菌中，应用玻片法操作，有5株细菌在5分钟内能使新鲜抗凝血浆出现凝集现象，对照组无凝集现象，即凝固酶试验阳性；有2株细菌和对照组都无凝集现象，即凝固酶试验阴性；另有1株细菌和对照组都出现凝固现象，实验结果可疑，进行试管凝固酶试验做进一步确定，通过试管凝固酶试验，该株细菌呈阳性结果。所以，在血浆凝固酶试验中，待测的8株细菌中，6株细菌实验结果呈阳性，2株细菌实验结果呈阴性。2.2.3氧化酶试验结果在待测的4株细菌中，1株细菌在滴加二甲基对苯二胺试剂后立即出现粉红色，即氧化酶试验阳性；另外3株细菌没有颜色变化，即氧化酶

15、试验阴性。2.2.4其他生化试验结果根据细菌生化试验结果，可以将待检菌株分为五类，分别以a、b、c、d、e表示。糖发酵试验，尿素酶试验，vp试验，mr试验，枸橼酸盐利用实验等其他生化试验结果见表1。 表1 分离菌株的生化试验结果项目 a b c d e葡萄糖 + + + + +麦芽糖 + + + +甘露醇 + - - + +乳 糖 + + + + -蔗 糖 - +vp + d + - -mr + -吲 哚 + -枸橼酸盐 -尿素酶 d + -山梨醇 - +七叶苷 - - - d马尿酸钠 +注：+90%菌株阳性；d=11%-89%菌株阳性；-90%菌株阴性；空白表示无此项试验2.3分离鉴定结果结

16、合待测菌株培养及染色特性、生化试验结果等细菌特性，参照伯杰细菌鉴定手册等相关资料5,6，对所有待测菌株做出如下判断。a类菌株为金黄色葡萄球菌，共6株，占46.15%；b类菌株为表皮葡萄球菌，共2株，占15.39%；c类细菌为无乳链球菌，共1株，占7.69%；d类细菌为大肠杆菌，共3株，占23.08%；e类细菌为铜绿假单胞菌，共1株，占7.69% 。见表2。表2 分离菌株数量及所占比例细菌名称 分离株数 所占比例（%）金黄色葡萄球菌 6 46.15表皮葡萄球菌 2 15.39无乳链球菌 1 7.69大肠杆菌 3 23.08铜绿假单胞菌 1 7.692.4药敏试验结果药敏试验结果详见表3。表3 分

17、离细菌药敏试验结果抗生素 金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 无乳链球菌 大肠杆菌 铜绿假单胞菌 青霉素 18 25 24 0 0 庆大霉素 22 28 23 17 【8】 新霉素 18 18 22 24 19 卡那霉素 21 24 21 17 16 链霉素 【10】 【12】 【15】 【14】 【9】 壮观霉素 22 24 26 25 22 红霉素 20 28 24 0 0 乙酰螺旋霉素 17 20 18 20 20 氯霉素 20 28 25 20 【12】 强力霉素 21 23 23 20 【13】 磺胺嘧啶钠 【7】 【10】 【9】 【5】 【9】 注：表中数据为所测抑菌圈直径（单位：mm

18、），其中【】表示已产生耐药性，“0”表示完全耐药3 小结与讨论3.1乳房炎的病原体特点引起奶牛乳房炎的病原微生物很多，主要包括细菌、病毒、真菌和霉形体四大类，其中细菌是最主要的病原体。本场奶牛乳房炎的主要病原菌为革兰氏阳性菌，其中以金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌为主，约占61.54%；而链球菌感染较少，所占比率仅为7.69%；除上述引起奶牛乳房炎的革兰氏阳性菌以外，还有大肠杆菌、铜绿假单胞菌等革兰氏阴性菌，该试验结果与目前国内其他同行的相关报道基本类似7,8,9,10,11,12,。另外，奶牛乳房炎主要病原的区域分布有所不同，如有些地区以金黄色葡萄球菌为主，有些地区以链球菌为主，不同地区要针对本

19、区域的病原菌，制定切实可行的预防和治疗方案，降低奶牛乳房炎的发病率13。3.2乳房炎的药物敏感试验本场奶牛乳房炎的临床治疗中，药物选择主要以抗生素为主，其次是中药制剂，例如鱼腥草注射液。常用药物有青霉素钠、氨苄青霉素、链霉素、土霉素、庆大霉素、新霉素、鱼腥草注射液等。抗生素作为主要治疗药物，在奶牛乳房炎的控制中发挥了重大作用，但长期应用抗生素导致敏感菌被消除，而耐药性细菌却大量滋生，使得常用的抗生素很难在发挥显著治疗作用，甚至完全丧失了治疗作用14。通过试验发现，临床常用的抗菌药物如青霉素、链霉素等已普遍产生了抗药性，可能是由于大量反复使用此类抗生素，导致细菌对这些抗生素产生了耐药性，从而造成

20、该类抗生素杀菌活性和治疗效果的降低；同时发现，临床上不常用的一些药物如强力霉素、新霉素、乙旋螺旋霉素等对所分离细菌都能发挥良好的杀菌作用。另外，药物敏感试验的准确性直接关系到试验的结果，因此，在药敏试验中要避免待测菌液过浓或过稀，禁止用未稀释的过夜肉汤培养物或其它非标准菌液进行平板划线接种。进行药敏试验时，药敏纸片之间的中心距离应不小于24mm，药敏纸片一旦接触琼脂，就不要轻易挪动药敏纸片的位置，避免药敏纸片中所含的药物在琼脂中扩散，最终影响试验结果的准确性。3.3 乳房炎的综合防治引起奶牛乳房炎的病原微生物有很多种，有细菌、真菌、病毒、支原体等，其中最主要的是细菌。要从根本上控制奶牛乳房炎的

21、发生，只有从饲养管理、卫生防疫、挤奶操作等多方面入手，查缺补漏，及时完善牧场生产管理机制，实现规模化、科学化、标准化管理模式，各个生产环节齐抓共管，通过综合性防治策略，有效控制奶牛乳房炎的发病率，提高牧场生产效益。由于引起奶牛乳房炎的病原微生物多样，且各地区甚至同一地区的不同时间，引起奶牛乳房炎的病原微生物也有不同，为了更有针对性地对症治疗，不延误治疗时机，同时也避免因为滥用抗生素引起的耐药菌株和抗奶（牛奶中抗生素含量超标）的产生，在使用抗菌药物前最好采集奶样做病原菌的分离和药物敏感试验。本次试验从药物防治的角度入手，为该病的有效防治提供参考依据。由试验结果可以看出，病原微生物感染是引起奶牛乳

22、房炎的主要原因，所分离鉴定的病原菌中，金黄色葡萄球菌的分离率相对最高，是最主要的病原菌。由药敏试验可以看出，强力霉素、新霉素、乙酰螺旋霉素等药物有良好的体外杀菌效果，可以作为防治本场奶牛乳房炎的首选药物；而本场奶牛乳房炎病原菌对于青霉素、链霉素、磺胺药等抗菌药物已产生明显的耐药性，此类传统常用药物已不能发挥理想的治疗作用，建议停止应用，经过一段时间的停药期再重新考虑应用此类药物。通过本次试验，进一步查明了本场奶牛乳房炎主要致病微生物，为本场药物防治奶牛乳房炎提供了参考依据。在进一步的治疗过程中，可以参考本次实验结果，科学合理地选择预防和治疗药物，避免滥用抗生素引起的经济损失、耐药菌和抗奶的产生，提高牛群的健康水平，生产出令消费者放心的安全、高品质牛奶，最终提高牧场的经济效益，实现奶牛养殖业的科学化、