病毒工业微生物学

1、病毒和我们的关系病毒和我们的关系“Virus”，它是由，它是由拉丁文中拉丁文中“virus”一词演化而来，一词演化而来，即即“有毒的物质有毒的物质”1886年，年，A. Mayer 发现具有传染性的烟草花叶病；发现具有传染性的烟草花叶病；1892年，年，D. Ivanovsky烟草花叶病病原体能通过细菌滤器：烟草花叶病病原体能通过细菌滤器： 一种能通过细菌滤器的一种能通过细菌滤器的“细菌毒素细菌毒素”或或“极小细极小细菌菌”1898年，年，M W Beijerinck对烟草花叶病病原体的研究结果：对烟草花叶病病原体的研究结果：1884年年Chamberland发明细菌滤器发明细菌滤器1900年

2、前后，包括口蹄疫（年前后，包括口蹄疫（foot and mouth disease）在内的）在内的多种动植物疾病病原体的滤过性特性被证明。多种动植物疾病病原体的滤过性特性被证明。F W Twort（1915年）、年）、F dHerelle（1917年），分别发现年），分别发现细菌（细菌（Shigella dysenteriae）病毒）病毒-噬菌体噬菌体1935年，年，W M Stanley首次提纯并结晶了烟草花叶病毒；首次提纯并结晶了烟草花叶病毒； Bawden等证明烟草花叶病毒的本质为核蛋白；等证明烟草花叶病毒的本质为核蛋白；1940年，年，Kausche首先用电镜观察到烟草花叶病毒颗粒首先

3、用电镜观察到烟草花叶病毒颗粒.1952年，年，Hershey和和Chase利用同位素证实噬菌体的遗传物利用同位素证实噬菌体的遗传物质是质是DNA，将人类带入病毒的分子生物学阶段。，将人类带入病毒的分子生物学阶段。 四、病毒的培养和纯化四、病毒的培养和纯化 将少量噬菌体与将少量噬菌体与大量宿主细胞混合后，大量宿主细胞混合后，在合适条件下培养一在合适条件下培养一定时间后，在平板表定时间后，在平板表面布满宿主细胞的菌面布满宿主细胞的菌苔上，出现一个个肉苔上，出现一个个肉眼可见的透明小圆斑。眼可见的透明小圆斑。（ “负菌落负菌落” ） 设设0.10mL稀释度为稀释度为10-6的病毒悬液可产生的病毒悬液

4、可产生75个噬菌斑，则样品的噬菌斑形成单位为：个噬菌斑，则样品的噬菌斑形成单位为：PFU/mL=（75 PFU /0.10 mL ）（106）=7.5 108若标本经过适当稀释进行接种并辅以染色处理，病毒可若标本经过适当稀释进行接种并辅以染色处理，病毒可在培养的细胞单层上形成肉眼可见的局部病损区域，即在培养的细胞单层上形成肉眼可见的局部病损区域，即蚀斑（蚀斑（plaque）或称空斑。）或称空斑。 在某些感染病毒的宿主细胞质或细胞核内，出现光学在某些感染病毒的宿主细胞质或细胞核内，出现光学显微镜下可见的大小、形状和数量不等的小体。显微镜下可见的大小、形状和数量不等的小体。（盐析、等电点沉淀、有机

5、溶剂沉淀、凝胶层析、离子交换等）（盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、凝胶层析、离子交换等）差速离心、梯度离心（超速离心）差速离心、梯度离心（超速离心） 个体小（测量单位个体小（测量单位nm），必需在电镜下观察；），必需在电镜下观察；基本构造：核衣壳基本构造：核衣壳(nucleocapsid)非基本构造非基本构造DNA或或RNA核心核心衣壳衣壳包膜包膜刺突刺突螺旋对称衣壳病毒：烟草花叶病毒螺旋对称衣壳病毒：烟草花叶病毒 病毒可以根据衣壳中衣壳粒的排列方式将其分为病毒可以根据衣壳中衣壳粒的排列方式将其分为3 3种：种：二十面体对称衣壳病毒：腺病毒二十面体对称衣壳病毒：腺病毒复合对称衣壳病毒：复合对称

6、衣壳病毒：T4T4噬菌体噬菌体 壳体外形如中空的蛋白质圆壳体外形如中空的蛋白质圆管，呈坚硬或柔韧状。管，呈坚硬或柔韧状。 由由2130个个相同的蛋白质亚基相同的蛋白质亚基（158个氨基酸）个氨基酸）以逆时针方以逆时针方向螺旋状排列，形成一个长向螺旋状排列，形成一个长300nm，内径，内径4nm，外径，外径15nm的刚直中空柱。的刚直中空柱。ssRNA盘绕在盘绕在壳体内面由亚基形成的沟内，壳体内面由亚基形成的沟内，与蛋白质亚基通过弱键结合。与蛋白质亚基通过弱键结合。螺旋对称壳体病毒螺旋对称壳体病毒代表：代表：TMV流感病毒流感病毒衣壳有衣壳有20个等边三角形面，个等边三角形面，12个顶角。个顶角

7、。包括包括12个五邻体（分布在个五邻体（分布在12个顶角上的个顶角上的衣壳粒）和衣壳粒）和240个六邻体（分布在棱上和个六邻体（分布在棱上和面上的非顶角衣壳粒）。核心为线状双面上的非顶角衣壳粒）。核心为线状双链链DNA(dsDNA)，核酸分子以高度卷曲，核酸分子以高度卷曲的状态存在于衣壳内。的状态存在于衣壳内。 五邻体五邻体六邻体六邻体二十面体衣壳在形成时通常是由五边形二十面体衣壳在形成时通常是由五边形衣壳粒（五邻体）和六边形衣壳粒（六衣壳粒（五邻体）和六边形衣壳粒（六邻体）组成的邻体）组成的（参见（参见P74） 其壳体由头部和尾部组成。通常头部呈二十面体对称，尾其壳体由头部和尾部组成。通常头

8、部呈二十面体对称，尾部呈螺旋对称。线状部呈螺旋对称。线状dsDNA折叠盘绕于头部的核心。折叠盘绕于头部的核心。代表：大肠杆菌的代表：大肠杆菌的T偶数噬菌体偶数噬菌体头头尾髓尾髓颈环颈环尾鞘尾鞘尾丝尾丝刺突刺突基板基板1、 病毒的核酸病毒的核酸病毒基因组大小差别很大病毒基因组大小差别很大 最小的基因组（最小的基因组（MS2病毒，病毒，QB病毒）只有病毒）只有1 106 Da，仅够编码，仅够编码34种蛋白质，这些病毒利用重叠基因来节省空种蛋白质，这些病毒利用重叠基因来节省空间。最大的基因组（间。最大的基因组（T偶数噬菌体，疱疹病毒，痘病毒）达偶数噬菌体，疱疹病毒，痘病毒）达1.6 108 Da，可

9、编码，可编码100多种蛋白质。多种蛋白质。单链单链DNA（ss DNA）；）；双链双链DNA（ds DNA）；）；单链单链RNA（ss RNA）；）；双链双链RNA（ds RNA）4种类型种类型(1) DNA病毒病毒 特殊的碱基：除常见核苷酸外，许多病毒具有特殊的碱基，特殊的碱基：除常见核苷酸外，许多病毒具有特殊的碱基，如，大肠杆菌如，大肠杆菌T偶数噬菌体以偶数噬菌体以5-羟甲基胞嘧啶羟甲基胞嘧啶代替胞嘧啶。代替胞嘧啶。 (2) RNA病毒病毒 2、病毒的蛋白质、病毒的蛋白质3、病毒的其它化学成分、病毒的其它化学成分 （一）双链（一）双链DNA噬菌体的复制噬菌体的复制1. 一步生长实验一步生长

10、实验 病毒的滴度（病毒的滴度（titer），又称效价，是指每毫升样品中），又称效价，是指每毫升样品中含有的侵染性病毒粒子的数量。含有的侵染性病毒粒子的数量。(双层平板法测双层平板法测)潜伏期：是从噬菌潜伏期：是从噬菌体吸附于宿主细胞体吸附于宿主细胞表面到子代噬菌体表面到子代噬菌体释放所需的最短时释放所需的最短时间间裂解量：是每个受裂解量：是每个受侵染的细胞所产生侵染的细胞所产生的子代噬菌体的数的子代噬菌体的数目。目。 2. 噬菌体的复制过程（烈性噬菌体的裂解周期）噬菌体的复制过程（烈性噬菌体的裂解周期） 受体（吸附）位受体（吸附）位点：细胞壁上的点：细胞壁上的脂多糖、蛋白质、脂多糖、蛋白质、磷

11、壁酸，以及鞭磷壁酸，以及鞭毛和菌毛毛和菌毛附着附着 固着固着 尾部收缩尾部收缩 刺入细胞刺入细胞 DNA注入注入T4噬菌体吸附和侵入宿主细胞过程：噬菌体吸附和侵入宿主细胞过程：如果大量噬菌体在短时间内吸附于同一细胞上，使细胞壁产生许多如果大量噬菌体在短时间内吸附于同一细胞上，使细胞壁产生许多小孔，也可引起细胞立即裂解，但并未进行噬菌体的增殖，这种现小孔，也可引起细胞立即裂解，但并未进行噬菌体的增殖，这种现象称为象称为自外裂解自外裂解（lysis from without）。）。早期早期mRNA ：宿主：宿主RNA聚合酶开始合成的病毒聚合酶开始合成的病毒mRNA，即噬，即噬菌体菌体DNA复制前转

12、录的复制前转录的mRNA。早期蛋白：早期早期蛋白：早期mRNA翻译成的蛋白，这些蛋白将接管宿主翻译成的蛋白，这些蛋白将接管宿主细胞并合成病毒核酸。其中一些酶将宿主细胞并合成病毒核酸。其中一些酶将宿主DNA降降解成核苷酸，为病毒解成核苷酸，为病毒DNA的合成提供原料；一些的合成提供原料；一些蛋白对宿主细胞蛋白对宿主细胞RNA聚合酶进行修饰，使其识别聚合酶进行修饰，使其识别病毒的病毒的DNA启动子，开始转录合成中期启动子，开始转录合成中期mRNA。中期中期mRNA：即病毒：即病毒DNA复制所需的酶的复制所需的酶的mRNA。 噬菌体噬菌体DNADNA注入宿主细胞后，宿主细胞自身的注入宿主细胞后，宿主

13、细胞自身的DNADNA、RNARNA和蛋白质的合成便会中止，转而合成病毒复制所需的成分。和蛋白质的合成便会中止，转而合成病毒复制所需的成分。中期蛋白中期蛋白：中期中期mRNA翻译成的蛋白翻译成的蛋白(DNA复制所需的酶、羟复制所需的酶、羟甲基胞嘧啶合成酶以及晚期甲基胞嘧啶合成酶以及晚期mRNA聚合酶等聚合酶等)，病，病毒毒DNA开始复制开始复制(某些碱基的修饰是抵制宿主的限某些碱基的修饰是抵制宿主的限制制)。 多联体多联体-合成的合成的T4噬菌体噬菌体DNA具有末端冗余具有末端冗余(重复的一重复的一段碱基序列段碱基序列)，大约，大约6-10个克隆通过末端冗余序列个克隆通过末端冗余序列连接在一起

14、，这种由若干单元同向相连形成的超连接在一起，这种由若干单元同向相连形成的超长链长链DNA称为多联体，多联体在装配过程中被切称为多联体，多联体在装配过程中被切割。割。 晚期晚期mRNA： DNA复制完成后合成的复制完成后合成的mRNA(指导结构蛋白、指导结构蛋白、装配蛋白、溶菌酶等装配蛋白、溶菌酶等)。晚期蛋白：噬菌体的结构蛋白、装配蛋白、溶菌酶等这些细晚期蛋白：噬菌体的结构蛋白、装配蛋白、溶菌酶等这些细胞裂解期间合成的蛋白质胞裂解期间合成的蛋白质。大致分为大致分为4个独立的途径：个独立的途径：1）头部壳体装入）头部壳体装入DNA形成形成成熟的头部成熟的头部2）由基板、尾管、尾鞘组）由基板、尾管

15、、尾鞘组装成无尾丝的尾部；装成无尾丝的尾部；3）头部与尾部自发结合；）头部与尾部自发结合；4）装上尾丝）装上尾丝头部头部衣壳粒衣壳粒DNA衣壳衣壳尾部尾部尾鞘尾鞘噬菌体噬菌体尾丝尾丝 37培养时，侵染约培养时，侵染约22分钟后，分钟后，E. coli发生裂解并发生裂解并释放约释放约300个个T4噬菌体。这一过程需要一些噬菌体。这一过程需要一些T4基因的支基因的支持：持： 一种基因指导溶菌酶的合成，溶菌酶可以攻击细胞一种基因指导溶菌酶的合成，溶菌酶可以攻击细胞壁的肽聚糖；壁的肽聚糖； 另一种噬菌体蛋白称为另一种噬菌体蛋白称为holin，它可破坏细胞膜，使，它可破坏细胞膜，使溶菌酶到达并破坏细胞壁

16、，同时阻止细胞膜上的能量溶菌酶到达并破坏细胞壁，同时阻止细胞膜上的能量代谢反应。代谢反应。 （二）单链（二）单链DNA噬菌体的复制噬菌体的复制(1) X174噬菌体噬菌体DNA进入宿主细胞后，利用宿主进入宿主细胞后，利用宿主DNA聚聚合酶以单链合酶以单链DNA为模板合成双链模式为模板合成双链模式(复制型复制型DNA或或RF DNA); (2)随后复制型随后复制型DNA将指导合成更多的将指导合成更多的RF DNA、mRNA和和+DNA基因组，基因组，mRNA翻译成病毒蛋白；翻译成病毒蛋白；(3)此类噬菌体的裂解和释放机制和此类噬菌体的裂解和释放机制和T4噬菌体基本相同。噬菌体基本相同。 E. c

17、oli噬菌体噬菌体X174的遗传物质是单链的遗传物质是单链DNA。其。其DNA序序列与病毒列与病毒mRNA相同，即为正链，其基因组中有重叠基相同，即为正链，其基因组中有重叠基因（因（overlapping genes）。）。复制过程复制过程1. X174复制过程复制过程2. 丝状丝状ssDNA噬菌体噬菌体(如：如：fd噬菌体噬菌体)(1)丝状噬菌体通过附着丝状噬菌体通过附着于大肠杆菌性菌毛而侵于大肠杆菌性菌毛而侵染宿主细胞。染宿主细胞。(2)噬菌体噬菌体DNA在吸附蛋在吸附蛋白协助下沿着或通过菌白协助下沿着或通过菌毛注入宿主。毛注入宿主。(3)噬菌体噬菌体DNA首先合成首先合成复制型复制型DN

18、A，然后进行，然后进行转录，噬菌体转录，噬菌体DNA以滚以滚环模式进行复制。环模式进行复制。丝状丝状ssDNA噬菌体单链噬菌体单链DNA为环形，位于衣壳中心。其复制为环形，位于衣壳中心。其复制过程不同于过程不同于X174噬菌体或其他噬菌体或其他ssDNA噬菌体。噬菌体。 A-蛋白蛋白细细胞胞壁壁细胞膜细胞膜衣壳蛋白衣壳蛋白噬菌体噬菌体ssDNA C-蛋白蛋白(4)子代颗粒的装配是在噬菌体子代颗粒的装配是在噬菌体DNA穿过宿主细胞外膜时完成穿过宿主细胞外膜时完成并分泌出来，不引起细胞破裂，但降低细胞生长速率。并分泌出来，不引起细胞破裂，但降低细胞生长速率。（三）（三）RNA噬菌体的复制噬菌体的复

19、制 MS2是是E. coli的单链的单链RNA噬菌体。吸附宿主的性菌毛，噬菌体。吸附宿主的性菌毛，RNA进入宿主。其进入宿主。其RNA只有只有34个基因，分别编码与吸附个基因，分别编码与吸附有关的蛋白、衣壳蛋白、有关的蛋白、衣壳蛋白、RNA复制酶和细胞裂解蛋白。复制酶和细胞裂解蛋白。+RNA翻译翻译RNA复制酶复制酶RNA(ds)+RNA其单链其单链RNA为正链，可作为为正链，可作为mRNA指导噬菌体蛋白合成指导噬菌体蛋白合成组装成噬菌体组装成噬菌体（四）其它类型（四）其它类型RNA噬菌体（病毒）的复制噬菌体（病毒）的复制 +RNA反转录酶反转录酶DNA(ds)+RNA组装成噬菌体组装成噬菌体

20、反转录病毒反转录病毒 +RNADNADNA聚合酶聚合酶转录转录+RNA病毒病毒 RNA转录转录+RNA+RNARNA组组装装成成噬噬菌菌体体目前发现的唯一一种目前发现的唯一一种dsRNA噬菌体，以铜绿假单噬菌体，以铜绿假单胞菌为宿主。还不清楚该噬菌体如何复制。胞菌为宿主。还不清楚该噬菌体如何复制。 6噬菌体噬菌体 感染宿主细胞后能在细胞内正常复制并引起宿主细胞迅感染宿主细胞后能在细胞内正常复制并引起宿主细胞迅速裂解的噬菌体。速裂解的噬菌体。 感染宿主细胞后，噬菌体基因组长期存在于宿主细胞感染宿主细胞后，噬菌体基因组长期存在于宿主细胞内（整合于宿主的基因组上或以质粒形成独立存在），并内（整合于宿

21、主的基因组上或以质粒形成独立存在），并随宿主基因组的复制而同步复制，没有成熟噬菌体产生，随宿主基因组的复制而同步复制，没有成熟噬菌体产生，不引起宿主细胞裂解的噬菌体。不引起宿主细胞裂解的噬菌体。 这种噬菌体与宿主之间的关系称为这种噬菌体与宿主之间的关系称为溶源性（溶源性（lysogeny）。 凡能引起溶源性的噬菌体称为凡能引起溶源性的噬菌体称为温和噬菌体温和噬菌体，其宿主称为，其宿主称为溶源菌溶源菌。第三节第三节 噬菌体噬菌体温和噬菌体的存在形式有温和噬菌体的存在形式有3种：种：游离态：游离态：前噬菌体所携带的遗传信息由于受噬菌体本身编码的一种前噬菌体所携带的遗传信息由于受噬菌体本身编码的一种

22、特异阻遏物的阻遏作用而得不到表达，因此不进行特异阻遏物的阻遏作用而得不到表达，因此不进行DNA复复制和蛋白质合成。但随宿主菌基因组的复制而同步复制。制和蛋白质合成。但随宿主菌基因组的复制而同步复制。营养态：营养态：整合态：整合态：指成熟后被释放并有侵染性的游离噬菌体粒子指成熟后被释放并有侵染性的游离噬菌体粒子已整合到宿主基因组上的噬菌体核酸，称为已整合到宿主基因组上的噬菌体核酸，称为前噬菌体（前噬菌体（prophage ）。）。指前噬菌体经外界理化因子诱导后，脱离宿主指前噬菌体经外界理化因子诱导后，脱离宿主核基因组而处于积极复制、合成和装配的状态核基因组而处于积极复制、合成和装配的状态（参见（

23、参见P82）整合于细菌染色体或以质粒整合于细菌染色体或以质粒形成存在的温和噬菌体基因形成存在的温和噬菌体基因组称做组称做原噬菌体（原噬菌体（prophage）细胞中含有以原噬菌体状态存在的细胞中含有以原噬菌体状态存在的温和噬菌体基因组的细菌称做温和噬菌体基因组的细菌称做溶源溶源性细菌（性细菌（lysogenic bacteria）噬菌体的的溶源性反应：噬菌体的的溶源性反应：基因组基因组的表达的表达与复制与复制存在着存在着强烈的强烈的时序性时序性噬菌体基因组有噬菌体基因组有40多个基因，大多数基因根据功能不同聚集多个基因，大多数基因根据功能不同聚集在一起，分别涉及头部合成、尾部合成、溶源性及调控

24、、在一起，分别涉及头部合成、尾部合成、溶源性及调控、DNA复制和细胞裂解。复制和细胞裂解。3. 溶源菌（溶源菌（lysogen或或 lysogenic bacteria）含有含有噬菌体基因组的大肠杆菌，表示：噬菌体基因组的大肠杆菌，表示：E. coli K12()溶源菌的特性：溶源菌的特性：第四节第四节 真核细胞病毒真核细胞病毒主要参考两方面的特征主要参考两方面的特征: 形态学特征、核酸特征形态学特征、核酸特征 与噬菌体基本相同，其复制可以分成六个阶段：与噬菌体基本相同，其复制可以分成六个阶段：吸吸附附、侵入和脱壳侵入和脱壳，病毒核酸的复制病毒核酸的复制，病毒外壳的合成与病毒外壳的合成与装配装

25、配，最后是，最后是成熟病毒的释放成熟病毒的释放。 (1)随机碰撞而接触（静电引力或氢键）随机碰撞而接触（静电引力或氢键）可逆吸附，无特异性（可逆吸附，无特异性（）(2)病毒吸附蛋白与细胞受体的结合病毒吸附蛋白与细胞受体的结合特异性，不可逆吸附，特异性，不可逆吸附，动物病毒：动物病毒： 3种侵入方式种侵入方式无包膜病毒只有核酸注入细胞质中；无包膜病毒只有核酸注入细胞质中；大多数包膜病毒或部分无包膜大多数包膜病毒或部分无包膜病毒通过细胞的内吞功能病毒通过细胞的内吞功能病毒包膜与细胞质病毒包膜与细胞质 膜的融合膜的融合；动物病毒存在不同的结构类型和不同的侵入方式，动物病毒存在不同的结构类型和不同的侵

26、入方式，其脱壳过程也较复杂。其脱壳过程也较复杂。病毒的毒粒消失，失去原有的感染性，进入潜隐期。病毒的毒粒消失，失去原有的感染性，进入潜隐期。 DNA复制：复制：通常在宿主细胞核完成，也有一些病毒的基因通常在宿主细胞核完成，也有一些病毒的基因组在细胞质中复制组在细胞质中复制(如痘病毒如痘病毒)。早期。早期mRNA通常由宿主的酶以通常由宿主的酶以病毒病毒DNA为模板进行转录，仍有例外情况，如痘病毒利用自身为模板进行转录，仍有例外情况，如痘病毒利用自身的聚合酶合成的聚合酶合成mRNA。 RNA的复制：的复制：在宿主细胞基质中进行的。在宿主细胞基质中进行的。 单链单链RNA病毒通常将病毒通常将ssRN

27、A转变为复制型转变为复制型dsRNA，指导合成新的病毒，指导合成新的病毒RNA基因组。基因组。 双链双链RNA病毒一般包含多条不同的病毒一般包含多条不同的dsRNA，RNA要与特定蛋白结合形要与特定蛋白结合形成一个复合体，在复合体中复制形成一个双链基因组。成一个复合体，在复合体中复制形成一个双链基因组。反转录病毒核酸的复制：反转录病毒核酸的复制：在其它病毒也显著不同。形成在其它病毒也显著不同。形成的的dsDNA进行环化，然后整合到宿主细胞染色体上，之进行环化，然后整合到宿主细胞染色体上，之后病毒核酸才开始增殖，或转录和合成能使细胞肿瘤化后病毒核酸才开始增殖，或转录和合成能使细胞肿瘤化的蛋白。的

28、蛋白。 晚期晚期mRNA指导衣壳蛋白的合成，衣壳蛋白的自发指导衣壳蛋白的合成，衣壳蛋白的自发装配过程与噬菌体的装配过程类似。装配过程与噬菌体的装配过程类似。 装配在细胞质中进行。在装配过程中，空的前衣壳装配在细胞质中进行。在装配过程中，空的前衣壳首先形成，然后核酸以某种未知的方式插入衣壳中。首先形成，然后核酸以某种未知的方式插入衣壳中。 有包膜病毒的衣壳的装配通常与无包膜病毒相同。有包膜病毒的衣壳的装配通常与无包膜病毒相同。 无包膜病毒粒子和有包膜病毒粒子释放的机制是不同的。无包膜病毒粒子和有包膜病毒粒子释放的机制是不同的。包膜病毒的释放与包膜的形成通常是并行的，宿主细胞包膜病毒的释放与包膜的

29、形成通常是并行的，宿主细胞可以在一段时间里持续释放病毒粒子。可以在一段时间里持续释放病毒粒子。病毒编码的蛋白质病毒编码的蛋白质与细胞膜融合，然与细胞膜融合，然后在释放核衣壳的后在释放核衣壳的同时，细胞膜以出同时，细胞膜以出芽的形式形成病毒芽的形式形成病毒包膜。包膜。无包膜病毒通常是通过裂解宿主细胞而释放的。无包膜病毒通常是通过裂解宿主细胞而释放的。 有包膜病毒的装配与释放有时有包膜病毒的装配与释放有时也是同时完成的。也是同时完成的。 主要依据形态学特征主要依据形态学特征：(很多植物病毒具有螺旋型衣很多植物病毒具有螺旋型衣壳壳 ，多数植物病毒衣壳是由一种类型的蛋白质组成的，多数植物病毒衣壳是由一

30、种类型的蛋白质组成的) 几乎所有的植物病毒都是单链或双链的几乎所有的植物病毒都是单链或双链的RNA病毒，病毒，极少数是极少数是DNA病毒。病毒。 通过因人为地或自然的机械损伤所形成的微伤口进入通过因人为地或自然的机械损伤所形成的微伤口进入细胞；或者靠携带有病毒的媒介，主要靠是有吮吸式口器细胞；或者靠携带有病毒的媒介，主要靠是有吮吸式口器的昆虫取食将病毒带入细胞。的昆虫取食将病毒带入细胞。+RNA翻译翻译RNA复制酶复制酶RNA(ds)+RNA其单链其单链RNA为正链，可作为为正链，可作为mRNA指导噬菌体蛋白合成指导噬菌体蛋白合成组装成噬菌体组装成噬菌体病毒粒子整个装配过程高度有序。在病毒粒子

31、整个装配过程高度有序。在衣壳蛋白和衣壳蛋白和RNA基因组合成完毕后，基因组合成完毕后，衣壳粒靠拢，衣壳蛋白与衣壳粒靠拢，衣壳蛋白与TMV RNA同时从专一的装配起始位点开始装配。同时从专一的装配起始位点开始装配。衣壳粒不断地以螺旋方式装配，形成衣壳粒不断地以螺旋方式装配，形成一个长杆状衣壳。随着杆的延长，一个长杆状衣壳。随着杆的延长，RNA也螺旋形盘绕于衣壳的中间通道也螺旋形盘绕于衣壳的中间通道内，并在末端形成环状结构。内，并在末端形成环状结构。 增殖产生的子代病毒或病毒核酸可通过病毒编码的增殖产生的子代病毒或病毒核酸可通过病毒编码的运动蛋白（运动蛋白（movement protein）与胞间

32、连丝的相互作用）与胞间连丝的相互作用从受染细胞进入邻近细胞。从受染细胞进入邻近细胞。 依据病毒是否能感染昆虫并在其体内繁殖以及是否以依据病毒是否能感染昆虫并在其体内繁殖以及是否以昆虫为主要宿主，可把病毒分为昆虫为主要宿主，可把病毒分为7个科：个科：杆状病毒科、杆状病毒科、虹彩病毒科、虹彩病毒科、呼肠弧病毒科、呼肠弧病毒科、痘病毒科、痘病毒科、细小病毒科、细小病毒科、微小核糖核酸病毒科、微小核糖核酸病毒科、弹状病毒科弹状病毒科 最重要的最重要的3 3个科个科 很多昆虫的感染伴随着细胞内包涵体的形成。根据很多昆虫的感染伴随着细胞内包涵体的形成。根据包涵体的形状和形成位置可将病毒分为三类：颗粒体病包

33、涵体的形状和形成位置可将病毒分为三类：颗粒体病毒、细胞质多面体和核心多面体病毒。毒、细胞质多面体和核心多面体病毒。颗粒体病毒：在细胞质内形成的颗粒状蛋白包含体颗粒体病毒：在细胞质内形成的颗粒状蛋白包含体多面体病毒：在被感染细胞的细胞核或细胞质中形成多面体包含体。多面体病毒：在被感染细胞的细胞核或细胞质中形成多面体包含体。 包涵体的成分是蛋白质，其内包裹一个或多个病毒粒包涵体的成分是蛋白质，其内包裹一个或多个病毒粒子。多面体病毒粒子对高温、低子。多面体病毒粒子对高温、低pH和多种化学物质有耐受和多种化学物质有耐受力，但当接触到昆虫肠中的碱性物质后，包含体就会溶解，力，但当接触到昆虫肠中的碱性物质

34、后，包含体就会溶解，释放出病毒粒子，随后感染昆虫的中肠细胞。释放出病毒粒子，随后感染昆虫的中肠细胞。第一，昆虫病毒只攻击无脊椎动物，有很强的宿主第一，昆虫病毒只攻击无脊椎动物，有很强的宿主专一性，因此相对安全可靠。专一性，因此相对安全可靠。第二，由于包含体对病毒具有保护作用，当散布到第二，由于包含体对病毒具有保护作用，当散布到环境中这些病毒粒子有较长的保存期和较高环境中这些病毒粒子有较长的保存期和较高的存活率。的存活率。第三，这些病毒粒子在昆虫的幼虫组织内能够达到第三，这些病毒粒子在昆虫的幼虫组织内能够达到很高的浓度（每只幼虫含有高达很高的浓度（每只幼虫含有高达1010个病毒个病毒粒子），因此

35、非常适合商业生产。粒子），因此非常适合商业生产。 大多数真菌病毒来自高等真菌，如青霉菌属和曲霉菌大多数真菌病毒来自高等真菌，如青霉菌属和曲霉菌属，一般包含有双链属，一般包含有双链RNA，真菌病毒大多是具有潜，真菌病毒大多是具有潜伏性的病毒，该病毒在宿主体内可诱发植物疾病。伏性的病毒，该病毒在宿主体内可诱发植物疾病。 低等真菌的病毒知之甚少，在研究过的少量病毒中，低等真菌的病毒知之甚少，在研究过的少量病毒中，含有含有dsRNA和和dsDNA基因组。与高等真菌的病毒不基因组。与高等真菌的病毒不同，低等真菌病毒的繁殖都伴随着宿主损伤和裂解。同，低等真菌病毒的繁殖都伴随着宿主损伤和裂解。 真核藻类的病

36、毒只有少数被分离出来，目前所有研究真核藻类的病毒只有少数被分离出来，目前所有研究过的这类病毒都具有过的这类病毒都具有dsDNA基因组和多面体结构衣基因组和多面体结构衣壳。壳。 第五节第五节 亚病毒亚病毒类病毒类病毒拟病毒（卫星病毒）拟病毒（卫星病毒） 朊病毒朊病毒 自然界中一些只含有核酸或只含有蛋白质的分子自然界中一些只含有核酸或只含有蛋白质的分子病原体，被称为亚病毒。病原体，被称为亚病毒。亚病毒亚病毒一、类病毒（一、类病毒（viroids）1.定义：定义：只含只含RNA组分、专性活细胞内寄生的分子病原体。组分、专性活细胞内寄生的分子病原体。2.与其它病毒不同点：与其它病毒不同点：没有衣壳；没

37、有衣壳；闭合闭合ssRNA (250-370bp)；碱基配对的杆状区与未配对的环状区相间排列（棒状闭合环状分子）碱基配对的杆状区与未配对的环状区相间排列（棒状闭合环状分子）不作不作mRNA指导蛋白质合成；能在宿主细胞内自我复制。指导蛋白质合成；能在宿主细胞内自我复制。3.致病性：致病性：马铃薯纺锤形块茎病，柑橘裂皮病马铃薯纺锤形块茎病，柑橘裂皮病二、拟病毒（二、拟病毒（virusoids）拟病毒：一类包裹在真病毒粒子中的有缺陷的亚病毒。拟病毒：一类包裹在真病毒粒子中的有缺陷的亚病毒。辅助病毒：包裹拟病毒的真病毒被称为辅助病毒。辅助病毒：包裹拟病毒的真病毒被称为辅助病毒。拟病毒特点：拟病毒一般不

38、具有衣壳，基因组为拟病毒特点：拟病毒一般不具有衣壳，基因组为RNA或或DNA，多数只含，多数只含300-400个核苷酸，是辅助病毒的个核苷酸，是辅助病毒的“卫星病毒卫星病毒”（所以又称卫星病毒），不能独立复（所以又称卫星病毒），不能独立复制，必须依赖辅助病毒的协助。拟病毒和辅助病制，必须依赖辅助病毒的协助。拟病毒和辅助病毒基因组没有同源性。毒基因组没有同源性。辅助病毒的复制不需要拟病毒的参与辅助病毒的复制不需要拟病毒的参与三、朊病毒（三、朊病毒（prion）又称又称“普利昂普利昂”或或“蛋白侵染子蛋白侵染子”1.定义：定义：一类不含核酸的侵染性蛋白质分子，通常称为一类不含核酸的侵染性蛋白质分子

39、，通常称为PrP(prion protein)2. 致病性：致病性：引起人与动物的致死性引起人与动物的致死性中枢神经系统疾病中枢神经系统疾病羊瘙痒病羊瘙痒病牛海绵状脑病（疯牛病）牛海绵状脑病（疯牛病） 库鲁氏病库鲁氏病克雅氏病克雅氏病 格格-史氏综合症史氏综合症3. 朊病毒致病的可能机制朊病毒致病的可能机制推测其致病机制是：推测其致病机制是： prp存在两种类型，即在患病组织中的存在两种类型，即在患病组织中的prpsc（致病型）和（致病型）和正常脑组织与患病组织中都存在的正常脑组织与患病组织中都存在的prpc（细胞型）。（细胞型）。 两种蛋白的一级结构相同，但二级结构有很大差异，细胞两种蛋白的

40、一级结构相同，但二级结构有很大差异，细胞型型prp对蛋白酶敏感，无聚集能力，而致病型对蛋白酶敏感，无聚集能力，而致病型prp对蛋白酶有对蛋白酶有一定抗性，且可聚集成纤维状组织。一定抗性，且可聚集成纤维状组织。 动物体内如果未被朊病毒感染，通常细胞型动物体内如果未被朊病毒感染，通常细胞型prp不会自发不会自发转变为致病型转变为致病型prp，而当被朊病毒感染后，患者体内的细胞型，而当被朊病毒感染后，患者体内的细胞型prp会发生构象转变而成为致病型会发生构象转变而成为致病型prp。 朊病毒感染会导致多拷贝的朊病毒蛋白质的产生，是否朊病毒感染会导致多拷贝的朊病毒蛋白质的产生，是否违背违背“中心法则中心

41、法则”？朊病毒的发现与思考朊病毒的发现与思考1）蛋白质是否可以作为遗传物质？）蛋白质是否可以作为遗传物质？ prion是生命的一个特例？还是仅仅为表达调控的一种形式？是生命的一个特例？还是仅仅为表达调控的一种形式？2）蛋白质折叠与功能的关系，是否存在折叠密码？）蛋白质折叠与功能的关系，是否存在折叠密码？1. 噬菌体的侵染与异常发酵噬菌体的侵染与异常发酵 发酵周期延长；发酵周期延长；碳源消耗缓慢；碳源消耗缓慢；OD值不升或下降；值不升或下降；pH值变化大，明显上升；值变化大，明显上升；发酵液产气泡，粘稠，拉丝；发酵液产气泡，粘稠，拉丝；革氏染色不均匀，菌体少，有碎片；革氏染色不均匀，菌体少，有碎

42、片；发酵产物形成缓慢或根本不形成；发酵产物形成缓慢或根本不形成；用敏感菌作平板检查时，出现大量噬菌斑；用敏感菌作平板检查时，出现大量噬菌斑；电镜观察，可见大量噬菌体粒子。电镜观察，可见大量噬菌体粒子。一、噬菌体与发酵工业一、噬菌体与发酵工业2. 噬菌体的分离与检查噬菌体的分离与检查直接观察法（电镜）直接观察法（电镜）双层平板法或液体法双层平板法或液体法3. 预防噬菌体污染的措施预防噬菌体污染的措施(1) 决不使用污染或有污染嫌疑的菌种，并经常轮决不使用污染或有污染嫌疑的菌种，并经常轮换生产菌种换生产菌种;(2) 严格保持环境卫生严格保持环境卫生;(3) 各种非生产菌液及时灭活各种非生产菌液及时

43、灭活;(4) 生产设备定期清洗、灭菌生产设备定期清洗、灭菌;(5) 严格操作守则。严格操作守则。4. 已染噬菌体后发酵过程应采取的措施已染噬菌体后发酵过程应采取的措施(1) 加入少量的表面活性剂，如加入少量的表面活性剂，如0.10.2土温等，土温等，抑制噬菌体吸附；抑制噬菌体吸附；(2) 加入少量的抗生素，如加入少量的抗生素，如12g/ml的四环素、的四环素、氯霉素等，抑制噬菌体蛋白合成；氯霉素等，抑制噬菌体蛋白合成；(3) 加入一些金属螯合剂，如草酸钠等也对抑制噬加入一些金属螯合剂，如草酸钠等也对抑制噬菌体的吸附有帮助。菌体的吸附有帮助。(4) 如要继续发酵，应及时向发酵液中补加抗噬菌如要继

44、续发酵，应及时向发酵液中补加抗噬菌体的菌种。体的菌种。(5) 如果是在发酵后期感染噬菌体，应尽快将发酵如果是在发酵后期感染噬菌体，应尽快将发酵液中的产品提取以减少损失。液中的产品提取以减少损失。二、噬菌体与基因工程二、噬菌体与基因工程通过结构改造，可成为理想的基因工程的载体通过结构改造，可成为理想的基因工程的载体作为基因工程载体的优点：作为基因工程载体的优点：(1)由于由于噬菌体基因组中约一半基因不是噬菌体生长和噬噬菌体基因组中约一半基因不是噬菌体生长和噬菌斑形成所必需的，可被外源基因取代而不影响其生长菌斑形成所必需的，可被外源基因取代而不影响其生长繁殖。繁殖。(2)噬菌体能将其自身基因组与宿

45、主基因组进行整合，可噬菌体能将其自身基因组与宿主基因组进行整合，可使插入的外源基因随宿主基因共同复制，便于目标基因使插入的外源基因随宿主基因共同复制，便于目标基因的收获。的收获。(3)噬菌体载体感染效率高，对宿主不需要象质粒转化那噬菌体载体感染效率高，对宿主不需要象质粒转化那样制备感受态细胞，操作简便。样制备感受态细胞，操作简便。 p91p921. 噬菌体噬菌体作为基因工程载体的优点：作为基因工程载体的优点：(1) 有大的基因片段可以接受改造。有大的基因片段可以接受改造。(2) 子代病毒粒子是通过病毒子代病毒粒子是通过病毒DNA穿出宿主细胞膜而释放，穿出宿主细胞膜而释放，宿主细胞并不裂解，可使

46、病毒粒子上携带的基因实现持宿主细胞并不裂解，可使病毒粒子上携带的基因实现持续表达和分泌。续表达和分泌。(3) 基因组为单链基因组为单链DNA，是测序和突变分析的理想材料，是测序和突变分析的理想材料，同时胞内复制型的双链同时胞内复制型的双链DNA便于基因重组的操作。便于基因重组的操作。 2.大肠杆菌丝状噬菌体大肠杆菌丝状噬菌体M13、fd、f1噬菌体展示技术：携带外源基因的噬菌体基因经过繁殖后噬菌体展示技术：携带外源基因的噬菌体基因经过繁殖后所编码的酶蛋白分子可独立的展示于所编码的酶蛋白分子可独立的展示于噬菌体衣壳表面而不影响噬菌体的结噬菌体衣壳表面而不影响噬菌体的结构和生物活性。构和生物活性。 三、病毒与农业三、病毒与农业应用昆虫病毒作为生物杀虫剂防治农业害虫应用昆虫病毒作为生物杀虫剂防治农业害虫生物杀虫剂使用至今仍不普及的主要原因：生物杀虫剂使用至今仍不普及的主要原因：(1)生物杀虫剂价格高；生物杀虫剂价格高；(2)病毒杀虫剂的专一性过高导致治理多种害虫感染无法病毒杀虫剂的专一性过高导致治理多种害虫感染无法用一种杀虫剂高效杀灭害虫；用一种杀虫剂高效杀灭害虫；(3)使用条件苛刻，导致杀虫效果不理想；使用条件苛刻，导致杀虫效