第七章核酸的分子杂交PPT课件

1、第七章第七章 核酸的分子杂交核酸的分子杂交 宋方洲宋方洲基础医学院生物化学与分子生物学教研室一、核酸分子杂交的概念一、核酸分子杂交的概念 三、核酸分子杂交的原理三、核酸分子杂交的原理四、核酸分子杂交的过程四、核酸分子杂交的过程 五、影响杂交的因素五、影响杂交的因素 六、核酸分子杂交的基本方法六、核酸分子杂交的基本方法 二、核酸分子杂交的用途二、核酸分子杂交的用途 核酸分子杂交（核酸分子杂交（nucleic acid hybridizationnucleic acid hybridization）是指具有是指具有互补序列的两条核酸互补序列的两条核酸单链单链在一定条件下按在一定条件下按碱基配对原则

2、碱基配对原则形成形成双双链链的过程。杂交的双方分别称为的过程。杂交的双方分别称为探针探针与与待测核酸待测核酸，杂交后形成，杂交后形成的异源双链分子称为的异源双链分子称为杂交分子杂交分子。 一、核酸分子杂交的概念一、核酸分子杂交的概念DNADNA杂交分子杂交分子DNARNA杂交分子杂交分子核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术是目前生命科学研究领域中应用最广泛的技术之一。是目前生命科学研究领域中应用最广泛的技术之一。用途：用途：1、是、是定性定性或或定量检测定量检测特异特异DNA或或RNA序列片段的有力工具；序列片段的有力工具；2、在基因工程技术中，用放射性标记或非放射性标记的寡核苷酸或、在基因工程技

3、术中，用放射性标记或非放射性标记的寡核苷酸或cDNA探针进行菌落杂交，探针进行菌落杂交，可从可从cDNA文库或基因组文库中筛选出特定文库或基因组文库中筛选出特定的克隆，获得某一重组体；的克隆，获得某一重组体；3、用克隆化的、用克隆化的DNA片段作探针进行片段作探针进行Southern杂交杂交，可确定基因组，可确定基因组DNA上上特定区域的核苷酸同源顺序特定区域的核苷酸同源顺序；二、核酸分子杂交的的用途二、核酸分子杂交的的用途4、用、用S1核酸酶或核酸酶或RNA酶消化酶消化DNA/RNA或者或者RNA/RNA杂交体是分杂交体是分析析基因转录或基因转录或RNA加工加工的重要方法；的重要方法；5、对

4、某一已知基因或已克隆测序的基因可利用核酸杂交技术进行、对某一已知基因或已克隆测序的基因可利用核酸杂交技术进行染色体定位；染色体定位；6、可用于遗传病的、可用于遗传病的基因诊断基因诊断，用于限制性片段长度，用于限制性片段长度多态性作疾病多态性作疾病的相关分析，基因连锁分析，的相关分析，基因连锁分析，法医学上的法医学上的性别分析和亲子鉴定性别分析和亲子鉴定。7、在人类学研究中，、在人类学研究中，HLA分型分型等方面也有应用价值。等方面也有应用价值。核酸分子杂交的基本原理是：核酸分子杂交的基本原理是：具有互补序列的两条单链核酸分子在具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下一定条件下（适宜的（适宜的

5、温度温度及及离子强度离子强度等）等）碱基互补配对结合，重新碱基互补配对结合，重新形成双链形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了；在这一过程中，核酸分子经历了变性变性和和复性复性的变化，以的变化，以及复性过程中分子间键的形成和断裂等。杂交的双方是及复性过程中分子间键的形成和断裂等。杂交的双方是待测核酸待测核酸序序列和列和已知核酸已知核酸序列。在杂交体系中序列。在杂交体系中已知已知的的核酸序列核酸序列称作称作探针探针（probeprobe），探针通常用于进行核素或非核素示踪标记。），探针通常用于进行核素或非核素示踪标记。三、核酸分子杂交的原理三、核酸分子杂交的原理探针的意义：探针的意义：要检测某一

6、样品或基因组要检测某一样品或基因组DNADNA中特定的中特定的DNADNA顺序或基因片段顺序或基因片段，首先必须获得相应的探针，即已知顺序的，首先必须获得相应的探针，即已知顺序的DNADNA或或RNARNA片段，并使它带上片段，并使它带上可检测到的示踪标记。可检测到的示踪标记。分子杂交的形式：分子杂交的形式： 固固液相杂交液相杂交 一般在进行某一核酸顺序的检测时，先将待测一般在进行某一核酸顺序的检测时，先将待测的单链靶核酸的单链靶核酸固定在适当的载体固定在适当的载体上，然后置于含相应单链核酸探针的上，然后置于含相应单链核酸探针的杂杂交反应体系交反应体系中，通过碱基互补配对原则，两条单链的同源顺

7、序通过氢键中，通过碱基互补配对原则，两条单链的同源顺序通过氢键互相结合，形成双链结构。经过对标记探针的检测可以判断待检测样品互相结合，形成双链结构。经过对标记探针的检测可以判断待检测样品中相应顺序的中相应顺序的存在与否存在与否及及分子量大小分子量大小。 液相杂交液相杂交 有时也将待测核酸和已知核酸同时放在有时也将待测核酸和已知核酸同时放在液体中液体中进行进行杂交反应。杂交反应。 两种杂交形式的两种杂交形式的基本原理都是一样的。基本原理都是一样的。 1 1、变性、变性：在：在物理或化学因素物理或化学因素作用下，例如作用下，例如加热加热、酸碱酸碱或或紫外线紫外线照射，照射，可以导致两条可以导致两条

8、DNADNA链之间的链之间的氢键断裂氢键断裂，而核酸分子中的所有共价键，而核酸分子中的所有共价键（如磷酸二酯键、糖苷键等）则不受影响，称为（如磷酸二酯键、糖苷键等）则不受影响，称为DNADNA变性变性（DNA DNA denaturationdenaturation）。）。 四、核酸分子杂交的的过程四、核酸分子杂交的的过程DNADNA的变性与复性的变性与复性导致导致DNADNA变性的常用方法有三种：变性的常用方法有三种：热变性热变性碱变性碱变性化学试剂变性。化学试剂变性。变性的情况：变性的情况：a. T700C，DNA几乎不变性；几乎不变性；b. 700CT900C，DNA变性使双链打开，成为

9、单链分子；变性使双链打开，成为单链分子；d .T1000C，DNA双链分离。双链分离。所以，一般核酸变性的温度都选在所以，一般核酸变性的温度都选在901000C之间。之间。 （1）热变性）热变性：当升高核酸溶液的温度时，核酸双链间的氢键：当升高核酸溶液的温度时，核酸双链间的氢键发生断裂，核酸的双链逐渐打开。发生断裂，核酸的双链逐渐打开。（2 2）酸碱变性酸碱变性：当核酸溶液的：当核酸溶液的pH低于低于3或高于或高于10时，核酸的双链可以时，核酸的双链可以完全打开成为单链核酸分子。在分子杂交中，完全打开成为单链核酸分子。在分子杂交中，最常用最常用的核酸变性方法的核酸变性方法是是碱变性碱变性。因通

10、常需要的核酸的载体如。因通常需要的核酸的载体如凝胶凝胶或或膜膜对热都不稳定对热都不稳定。（3）化学试剂变性）化学试剂变性：当核酸溶液中含有一定浓度的化学试剂如：当核酸溶液中含有一定浓度的化学试剂如尿素、尿素、甲醛等甲醛等时，两条链之间的氢键可以断裂而形成单链核酸分子。时，两条链之间的氢键可以断裂而形成单链核酸分子。 除物理、化学因素外，除物理、化学因素外，DNA分子的组成也影响变性。最主要的因分子的组成也影响变性。最主要的因素是素是DNA分子中的分子中的GC含量，含量，GC含量高的含量高的DNA不易变性，而不易变性，而AT含量含量高的高的DNA容易变性。容易变性。另外另外，环状，环状DNA比线

11、性比线性DNA难于变性难于变性。 DNA的变性是可逆的的变性是可逆的，即两条互补的单链，即两条互补的单链DNA分子在变性条分子在变性条件除去后件除去后重新重新按碱基互补原则以氢键相连按碱基互补原则以氢键相连形成双链形成双链DNA分子分子，这，这一过程称作一过程称作DNA复性复性（DNA renaturationDNA renaturation） 。 如果是如果是异源双链分子的结合异源双链分子的结合则称为则称为杂交杂交。 相似的复性或杂交反应可以发生在任何具有互补核苷酸顺序相似的复性或杂交反应可以发生在任何具有互补核苷酸顺序的两条单股核酸链之间，如的两条单股核酸链之间，如DNA/DNA，DNA/

12、RNA，RNA/RNA或或人工合成的寡核苷酸片段与人工合成的寡核苷酸片段与DNA、RNA等。等。2 2、复性、复性1 1、核酸分子的浓度和长度、核酸分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快；分子：浓度越大，复性速度越快；分子 量越大，复性速度越慢。量越大，复性速度越慢。 一般情况下：探针浓度为一般情况下：探针浓度为0.10.5g；长度为；长度为50300 bp2 2、温度、温度：适宜温度为：适宜温度为 比比Tm值值低低25 0C Tm双链双链DNA变性一半所需要的温度（变性一半所需要的温度（DNA的溶的溶 解温度，解温度，melting temperature,Tm）3 3、离子强度、离子强度

13、: 必须维持较高的杂交反应液和洗膜液的盐浓度必须维持较高的杂交反应液和洗膜液的盐浓度 五、影响核酸分子杂交的因素五、影响核酸分子杂交的因素 核酸分子杂交实际上就是两条互补的单链核酸分子通过复核酸分子杂交实际上就是两条互补的单链核酸分子通过复性重新缔合形成双链的过程。这一过程受到性重新缔合形成双链的过程。这一过程受到诸多因素诸多因素的影响。的影响。4 4、杂交液中的甲酰胺、杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的：甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，从而使得：值，从而使得： （1）在低温下探针更稳定；）在低温下探针更稳定；（2）能更好地保留非共价结合的核酸。）能更好地保留非共价结合的核酸。 一般是：一

14、般是：50%甲酰胺甲酰胺 3542 0C5 5、核酸分子的复杂性：、核酸分子的复杂性： 不同顺序的总长度（不同顺序的总长度（DNA的碱基数）的碱基数）6 6、非特异性杂交反应、非特异性杂交反应： 须在杂交前封闭非特异性杂交位点，以须在杂交前封闭非特异性杂交位点，以 减少其对探针的非特异性吸附作用减少其对探针的非特异性吸附作用1. Southern印迹杂交（印迹杂交（Southern blot） 鉴别鉴别DNA靶分子（待测核酸是靶分子（待测核酸是DNA）六、核酸分子杂交的基本方法六、核酸分子杂交的基本方法3. 斑点杂交、斑点杂交、4.原位杂交、原位杂交、5.核酸酶保护实验等。核酸酶保护实验等。2

15、. Northern印迹杂交（印迹杂交（Northern blot） 鉴别鉴别RNA靶分子（待测核酸是靶分子（待测核酸是RNA）根据其用途可将核酸分子杂交分为几种基本类型：根据其用途可将核酸分子杂交分为几种基本类型：Southern印迹杂交是指印迹杂交是指DNA与与DNA的杂交，将电泳分离的待测的杂交，将电泳分离的待测DNA片段转印并结合到一定的固相支持物上，然后用标记的片段转印并结合到一定的固相支持物上，然后用标记的DNA探针检探针检测待测测待测DNA的一种方法。基本步骤：的一种方法。基本步骤：（一）（一）Southern印迹杂交印迹杂交 1.1.待测核酸样品的制备待测核酸样品的制备 （1）

16、、制备待测）、制备待测DNA：从样本的细胞或组织中制备：从样本的细胞或组织中制备DNA （2）、）、DNA的限制酶消化：将的限制酶消化：将DNA切割成大小不同的片段切割成大小不同的片段 2.2.待测待测DNADNA样品的电泳分离样品的电泳分离：将将DNA样品在样品在0.81.0%琼脂糖凝胶中琼脂糖凝胶中电泳，以对电泳，以对DNA片段进行分离（琼脂糖凝胶是由琼脂糖形成的网状物片段进行分离（琼脂糖凝胶是由琼脂糖形成的网状物质，具有分子筛的作用，质，具有分子筛的作用，DNA因其分子大小因其分子大小而在琼脂糖凝胶中的泳动而在琼脂糖凝胶中的泳动速度不同速度不同达到分离）。达到分离）。 3.3.凝胶中核酸

17、的变性凝胶中核酸的变性：对凝胶中的对凝胶中的DNA进行碱变性，使其形成较短进行碱变性，使其形成较短的单链片段。的单链片段。 4.Southern 4.Southern 转膜转膜：将凝胶中的将凝胶中的DNA片段转移到硝酸纤维膜（片段转移到硝酸纤维膜（NC）等固相支持物上。各个等固相支持物上。各个DNA片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置是一样的，故称为印迹（位置是一样的，故称为印迹（blot）。）。 （1 1）毛细管虹吸印迹法：）毛细管虹吸印迹法：利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的胶中的DNA转移到固相支持物上。转移

18、到固相支持物上。 （见下页图见下页图）（2 2）电转印法：）电转印法：通过电泳作用将凝胶中的通过电泳作用将凝胶中的DNA转移到滤膜上。转移到滤膜上。（3 3）真空转移法：）真空转移法：其原理与毛细管虹吸印迹法相同。其原理与毛细管虹吸印迹法相同。Southern Southern 转膜的方法转膜的方法重物重物湿滤纸湿滤纸吸水纸吸水纸玻璃板玻璃板胶胶膜膜湿滤纸湿滤纸湿滤纸桥湿滤纸桥支持平台支持平台玻璃容器玻璃容器20SSC毛细管虹吸法毛细管虹吸法Southern转膜示意图转膜示意图5. 5. 探针的制备：探针的制备：用缺口平移或随机引物标记的方法制备探针、标记。用缺口平移或随机引物标记的方法制备探

19、针、标记。7. 7. 杂交结果的检测杂交结果的检测（1） 放射线标记放射线标记线感光胶片，显出黑色杂交带；线感光胶片，显出黑色杂交带；（2） 非放射线标记非放射线标记直接显出杂交带。直接显出杂交带。6. Southern6. Southern杂交杂交（1） 预杂交预杂交 封闭膜上所有能与封闭膜上所有能与DNA结合的位点结合的位点 转印后的膜在预杂交液（不含探针的杂交液）转印后的膜在预杂交液（不含探针的杂交液）46小时小时（2） 杂交杂交 （过夜）（过夜）8.8. SouthernSouthern印迹杂交在医学中的应用印迹杂交在医学中的应用 SouthernSouthern印迹杂交技术已有印迹杂

20、交技术已有2020余年的历史，在核酸的结构和余年的历史，在核酸的结构和 功能研究中作出过重要贡献。功能研究中作出过重要贡献。 如：发现成熟如：发现成熟B B细胞中免疫球蛋白细胞中免疫球蛋白 基因重排现象；进行克隆基因的酶切图谱分析；特定基因的定性基因重排现象；进行克隆基因的酶切图谱分析；特定基因的定性 和定量；和定量；DNADNA多态性多态性(RFLP,RAPD,AFLP(RFLP,RAPD,AFLP等等) )分析分析 Northern印迹杂交印迹杂交是指将待测是指将待测RNA样品经电泳分离后转移到固相样品经电泳分离后转移到固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行固支持物上，然后与标记的核酸探针

21、进行固液相杂交，以检测液相杂交，以检测RNA（主要是（主要是mRNA）的方法。其基本原理和基本过程与）的方法。其基本原理和基本过程与Southern印迹杂交基本相同。只是在以下几点有所不同。印迹杂交基本相同。只是在以下几点有所不同。（二）（二）Northern印迹杂交印迹杂交1、靶核酸、靶核酸RNA2、 RNA电泳电泳在变性胶中进行（加入变性剂，以维持单线性状态）在变性胶中进行（加入变性剂，以维持单线性状态）3、转膜、转膜不需要再进行变性和中和，直接用不需要再进行变性和中和，直接用毛细管虹吸法毛细管虹吸法等转移。转移。 （三）斑点及狭缝印迹杂交（三）斑点及狭缝印迹杂交特点：简单、快速；但不能鉴

22、别分子量，且特异性不高，特点：简单、快速；但不能鉴别分子量，且特异性不高，有一定的假阳性。有一定的假阳性。 将将RNA或或DNA变性后直接点样于硝酸纤维膜和尼龙膜上，变性后直接点样于硝酸纤维膜和尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究，称为斑点用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究，称为斑点印迹印迹(dot blot)。 如如印迹印迹是线状则为是线状则为狭缝印迹狭缝印迹。（四）原位杂交（四）原位杂交核酸保持在细胞或组织样本中，经适当的方法处理细胞或组织核酸保持在细胞或组织样本中，经适当的方法处理细胞或组织后，将标记的核酸后，将标记的核酸探针探针与与细胞或组织中的核酸细胞或组

23、织中的核酸进行进行杂交杂交，称为，称为原位杂交（原位杂交（in situ hybridization）。特点：特点： （1）不受组织成分的影响；（）不受组织成分的影响；（2）灵敏度高；（）灵敏度高；（3）可）可完整保持细胞或组织形态，准确反映组织细胞的相互关系及功完整保持细胞或组织形态，准确反映组织细胞的相互关系及功能；（能；（4）可检测多个探针。）可检测多个探针。 核酸原位杂交包括组织细胞的固定、预杂交、杂交、冲洗核酸原位杂交包括组织细胞的固定、预杂交、杂交、冲洗及信号检测等基本步骤。及信号检测等基本步骤。1、组织或细胞的固定、组织或细胞的固定2、组织细胞杂交前的预处理（预杂交）、组织细胞杂

24、交前的预处理（预杂交）3、探针的选择和标记、探针的选择和标记4、杂交、杂交5、杂交结果检测、杂交结果检测 重点介绍重点介绍荧光原位杂交荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）概念概念：液相杂交是指待测核酸分子与核酸探针都存在于杂交液中，：液相杂交是指待测核酸分子与核酸探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子。碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子。种类：种类：（一）（一）RNA酶保护分析法酶保护分析法(RNase protection assay, RPA) 用于用于mRNA定量、定量、mRNA末端定位及

25、确定内含子在相应基因中的位置等。末端定位及确定内含子在相应基因中的位置等。（五）液相杂交（五）液相杂交1、制备待测、制备待测RNA2、RNA探针的标记探针的标记3、杂交、杂交4、除去单链、除去单链RNA5、电泳分析、电泳分析 （二）核酸酶（二）核酸酶S1保护分析法保护分析法(nuclease S1 protection assay) 用于基因转录起始位点分析及内含子剪切位点分析。用于基因转录起始位点分析及内含子剪切位点分析。其原理与其原理与RNA酶保护分析法类似酶保护分析法类似 1、cDNA探针探针：逆转录：逆转录 cDNA 克隆载体克隆载体 扩增重组质粒扩增重组质粒 提提 取质粒取质粒 消化

26、重组质粒消化重组质粒 切割切割cDNA片段片段 分离纯化分离纯化 cDNA探探 针针cDNA探针应用最广泛探针应用最广泛2、基因组、基因组DNA探针探针：从基因组文库：从基因组文库 筛选特定基因（或基因片筛选特定基因（或基因片 段）段） 克隆克隆 扩增扩增 纯化纯化 切取片段切取片段 分离纯化分离纯化 探针探针3、寡核苷酸探针、寡核苷酸探针：一定长度的寡核苷酸片段（十几个核苷酸以上）：一定长度的寡核苷酸片段（十几个核苷酸以上）4、RNA探针探针：以：以RNA作为探针作为探针 （基因克隆和体外转录获得）（基因克隆和体外转录获得）七、探针的标记七、探针的标记（一）探针的种类（一）探针的种类1、核素

27、标记物、核素标记物2、非核素标记物、非核素标记物 （1）半抗原：生物素）半抗原：生物素(biotin)和地高辛和地高辛(digoxin,digacin,DIG) （2）配体）配体: 生物素既是半抗原，又是亲和素生物素既是半抗原，又是亲和素(avidin，抗生，抗生 物素蛋白物素蛋白)，故可用生物素，故可用生物素-亲和素反应进行杂交亲和素反应进行杂交 信号检测信号检测 （3）荧光素：异硫氰酸荧光素）荧光素：异硫氰酸荧光素( FITC) （4）化学发光探针）化学发光探针 （二）标记物（二）标记物1、缺口平移法、缺口平移法(nick translation) (见图见图) 2、随机引物法、随机引物法(randon primer) （见图）（见图）3、PCR标记法标记法 4、末端标记法、末端标记法 （三）标记方法（三）标记方法缺口平移法标记缺口平移法标记DNA探针探针DNase ；Mg2+53模板模板DNA35533随机打开缺口随机打开缺口5DNA聚合酶；聚合酶；-32P-dCT