病原真菌的分离与培养

1、1会计学病原真菌的分离与培养病原真菌的分离与培养一、目的要求一、目的要求 掌握病原真菌分离培养的基本原理、学会消毒、灭菌、倒平板、病原掌握病原真菌分离培养的基本原理、学会消毒、灭菌、倒平板、病原真菌的组织分离和稀释分离的基本方法。真菌的组织分离和稀释分离的基本方法。二、材料、用具和药品二、材料、用具和药品 新鲜的真菌病害分离材料、新鲜的真菌病害分离材料、PDA的斜面与平板培养基、无菌室、超净的斜面与平板培养基、无菌室、超净工作台或无菌操作箱（接种箱）、恒温箱、紫外线灭菌灯、酒精灯、火柴工作台或无菌操作箱（接种箱）、恒温箱、紫外线灭菌灯、酒精灯、火柴、吸管、剪刀、镊子、接种环、接种针、福尔马林、

2、吸管、剪刀、镊子、接种环、接种针、福尔马林、70%乙醇、乙醇、0.1%升汞、升汞、无菌水和记号笔等。无菌水和记号笔等。方法方法操作操作使用范围使用范围湿热法湿热法常压蒸汽常压蒸汽不宜用高压蒸汽灭菌的不宜用高压蒸汽灭菌的培养基培养基煮沸煮沸玻璃器皿玻璃器皿辐射法辐射法用用30W、253.7nm波长的紫外灯照波长的紫外灯照射射20-30min.无菌室、无菌箱、衣物无菌室、无菌箱、衣物等空气及物体表面等空气及物体表面化学药品法化学药品法70%乙醇、乙醇、2%煤酚皂（来苏水）、煤酚皂（来苏水）、5%石碳酸液等喷雾石碳酸液等喷雾无菌室、无菌箱无菌室、无菌箱0.25%新洁尔灭、新洁尔灭、0.5%次氯酸钙次

3、氯酸钙（漂白粉）擦拭（漂白粉）擦拭玻璃器皿、金属和木质玻璃器皿、金属和木质器皿等器皿等70%乙醇、乙醇、0.1%新洁尔灭、新洁尔灭、0.1%升升汞浸泡、擦拭汞浸泡、擦拭手（不可用升汞），分手（不可用升汞），分离材料离材料（3）消毒分离用具）消毒分离用具 凡是和分离材料接触的器皿和材料都要保持无菌。将分离用具凡是和分离材料接触的器皿和材料都要保持无菌。将分离用具浸于浸于70%乙醇中，使用时在灯焰上烧去乙醇灭菌，如此乙醇中，使用时在灯焰上烧去乙醇灭菌，如此3次（刀、次（刀、剪、镊等不宜烧时过长，以防退火），再次使用时必须重复灭菌剪、镊等不宜烧时过长，以防退火），再次使用时必须重复灭菌。2、选择分离

4、材料、选择分离材料 分离材料应尽量新鲜，减少腐生菌混入的机会。从受病组织分离材料应尽量新鲜，减少腐生菌混入的机会。从受病组织边缘靠近健全组织的部分分离，可减少污染，同时这部分病原生边缘靠近健全组织的部分分离，可减少污染，同时这部分病原生物处于较为活跃的状态，生长快，易分离成功。物处于较为活跃的状态，生长快，易分离成功。四、病原真菌的分离方法：四、病原真菌的分离方法：（一）组织分离法：（一）组织分离法： 1.培养皿准备：培养皿准备：取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上注取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上注 明分离日期、材料和分离人姓名。明分离日期、材料和分离人姓名。 2.培养皿平板制作

5、：培养皿平板制作：无菌操作法向培养皿中加入无菌操作法向培养皿中加入25%乳酸乳酸1-2滴滴 （减少细菌污染），然后将熔化而冷至（减少细菌污染），然后将熔化而冷至45左右的左右的马铃薯琼脂马铃薯琼脂 培养基培养基倒入培养皿中，轻轻摇成平面（分离细菌时则不能加乳倒入培养皿中，轻轻摇成平面（分离细菌时则不能加乳 酸）。酸）。约约5050倒平板倒平板灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染四、病原真菌的分离方法：四、病原真菌的分离方法：（一）组织分离法：（一）组织分离法： 1.培养皿准备：培养皿准备：取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上注取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上注 明分离日期、材料和分离人姓名。明分离日期、材料和分离人姓名。 2.培养皿平板制作：培养皿平板制作：无菌操作法向培养皿中加入无菌操作法向培养皿中加入25%乳酸乳酸1-2滴滴 （减少细菌污染），然后将熔化而冷至（减少细菌污染），然后将熔化而冷至45左右的左右的马铃薯琼脂马铃薯琼脂 培养基培养基倒入培养皿中，轻轻摇成平面（分离细菌时则不能加乳倒入培养皿中，轻轻摇成平面（分离细菌时则不能加乳