禽病病原之实验室检测方法20140425

1、瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！禽病病原之实验室检测方法沈元沈元诊断研究诊断研究服务服务中心中心瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！成立成立于于2011年，是年，是集动物疫病集动物疫病诊断、研究和服务为一体的技诊断、研究和服务为一体的技术服务窗口。术服务窗口。 通过检测服务，对畜禽健通过检测服务，对畜禽健康水平和疫病状态进行全面科康水平和疫病状态进行全面科学系统的分析评估，指导养殖学系统的分析评估，指导养殖客户做好科学防疫和用药工作客户做好科学防疫和用药工作，建立推广，建立推广“免疫免疫+用药用药+监测监测+净化净化+生物安全管理生物安全管理”的全新

2、方的全新方案式兽医服务模式。案式兽医服务模式。 瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！ 与与宾夕法尼亚州立兽医诊断中心联合成立宾夕法尼亚州立兽医诊断中心联合成立“中美动物诊中美动物诊断服务中心断服务中心”，与，与“中国科学院海洋研究所、中国农业中国科学院海洋研究所、中国农业科学院兰州兽医研究所、中国农业科学院兰州畜牧与兽科学院兰州兽医研究所、中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所、国家生化工程技术研究中心（上海）和国家药研究所、国家生化工程技术研究中心（上海）和国家兽用生物制品工程技术研究中心等兽用生物制品工程技术研究中心等5 5家单位签约形成战略家单位签约形成战略合作。实现了技

3、术服务升级；积极探索、实施与规模化合作。实现了技术服务升级；积极探索、实施与规模化养殖企业建立养殖企业建立“战略合作战略合作”，实现，实现“产业链共赢产业链共赢”。瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！瑞普技术服务体系瑞普技术服务体系 四大服务中心四大服务中心 1 1名研究员名研究员 4 4名博士名博士 1515名硕士名硕士 2020名养殖专家名养殖专家 100100多名技术员多名技术员瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！ 诊断/监测聚焦聚焦 研

4、究 服务疾病诊断研究中心疾病诊断研究中心瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！5个业务室个业务室1个综合管理室个综合管理室 禽病毒检测室：禽病毒检测室： 猪病毒检测室：猪病毒检测室： 血清学检测室：血清学检测室： 细菌学检测室：细菌学检测室： 诊断试剂开发室诊断试剂开发室：样品样品接收与登记接收与登记检测任务下达检测任务下达检测报告的复核与递送检测报告的复核与递送客户沟通与结果分析客户沟通与结果分析菌毒种归档与保藏菌毒种归档与保藏实验室和物料平衡管理实验室和物料平衡管理 动物动物疾病疾病诊断研究服务中心诊断研究服务中心疾病诊断研究中心疾病诊断研究中心瑞普生物，让您的事业更精彩

5、！瑞普生物，助您的事业更精彩！四大特点四大特点 专业：人员、场所、专业：人员、场所、试剂试剂 全面：禽全面：禽1616项；猪项；猪1313项，细菌项，细菌1212项项 规范：有标准可规范：有标准可依依 研究：集团化客户的专题合作研究研究：集团化客户的专题合作研究瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！先进的仪器设备先进的仪器设备瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！先进的仪器设备先进的仪器设备瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！先进的仪器设备先进的仪器设备瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！先进的仪器设备先进的仪器设备瑞

6、普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！先进的仪器设备先进的仪器设备瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！先进的仪器设备先进的仪器设备瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！标准的操作程序标准的操作程序瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！定点定人定性定量定期养殖场定性检测抓住源头合理定点系统监测专人服务专家咨询固定数量全面监测固定周期持续监测五定监测机制五定监测

7、机制 瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！血清学血清学生化生化组织病组织病理切片理切片药理学药理学快速诊断快速诊断基因分析基因分析区分野毒与疫苗毒区分野毒与疫苗毒病源分离与鉴定病源分离与鉴定耐药性分析耐药性分析抗原性分析抗原性分析环境监测环境监测环境监测环境监测毒物分析毒物分析病原鉴定病原鉴定病理变化病理变化确诊疾病确诊疾病制定方案制定方案监测免疫效果监测免疫效果野毒感染状况野毒感染状况筛选优质药物筛选优质药物分子微分子微生物学生物学微生物微生物学学六六大大监测监测技术技术瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！七项服务内容七项服务内容瑞普生物，让您的事业更

8、精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！4月月9日晚间消息，国内民营预防医疗服务提供机构爱康国宾日晚间消息，国内民营预防医疗服务提供机构爱康国宾正式在纳斯达克挂牌上市。成为国内首家健康体检赴美正式在纳斯达克挂牌上市。成为国内首家健康体检赴美IPO上上市企业。市企业。瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！健康养殖的现状 食品安全；食品安全； 养殖及生物安全；养殖及生物安全； 疫病的多样化、复杂化、混合感染等；疫病的多样化、复杂化、混合感染等； 药物的严格合理使用及残留；药物的严格合理使用及残留； 规模规模放大的瓶颈；放大的瓶颈；

9、瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！病原的多方面威胁 病毒扩散：禽流感、新城疫己进入全球生态系统，由于病毒扩散：禽流感、新城疫己进入全球生态系统，由于防控措施中的某些漏洞，致使病原更广泛的扩散。防控措施中的某些漏洞，致使病原更广泛的扩散。 免疫抑制：传染性免疫抑制：传染性囊病、马立克氏病、鸡传染性贫血、囊病、马立克氏病、鸡传染性贫血、J J亚型淋巴白血病、网状内皮组织增生症、呼肠孤病毒病亚型淋巴白血病、网状内皮组织增生症、呼肠孤病毒病等的发生，造成免疫抑制，降低鸡体免疫力，更易被细等的发生，造成免疫抑制，降低鸡体免疫力，更易被细菌、支原体感染。菌、支原体感染。 种种代代净化

10、：种禽净化：种禽企业对经胚传播疾病净化措施重视不够企业对经胚传播疾病净化措施重视不够。必须。必须强化对种鸡的沙门菌、支原体、禽白血病、网状强化对种鸡的沙门菌、支原体、禽白血病、网状内皮组织增生症病毒、呼肠孤病毒的净化工作，以保证内皮组织增生症病毒、呼肠孤病毒的净化工作，以保证养禽业的健康发展。养禽业的健康发展。瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！禽病病原检测内容 确定禽病确定禽病病原，对鸡群疫病防控做到病原，对鸡群疫病防控做到有的放矢；有的放矢； 监测隐性感染，了解鸡群健康监测隐性感染，了解鸡群健康状况；状况； 总结疫病流行，为免疫毒株选择提供参考总结疫病流行，为免疫毒株选

11、择提供参考数据；数据； 进行疫病净化，为实现种禽健康养殖提供可行性进行疫病净化，为实现种禽健康养殖提供可行性方法方法 分离流行毒株，为制备自制抗原和自家疫苗提供分离流行毒株，为制备自制抗原和自家疫苗提供种毒材料种毒材料 基因测序比对，建立养殖集团病毒基因数据库基因测序比对，建立养殖集团病毒基因数据库瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！病原检测流程检测样品的接收和初步分析 鸡胚法分离病毒 RT-PCR鉴定HA确定血凝性；HI确定ND、AI 初步确定病原 出具PCR检测报告确定病原种类 出具完整检测报告 组织 尿囊液 进一步的测序工作瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的

12、事业更精彩！样品的采集与运输瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！正确采样的重要性瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！以IBV为例 IB根据临床上病变类型主要分为根据临床上病变类型主要分为：呼吸道型、肾：呼吸道型、肾型。目前型。目前流行发病以流行发病以肾型肾型发生最为普遍发生最为普遍。 呼吸道出现呼吸困难呼吸道出现呼吸困难，有，有啰音或喘鸣音啰音或喘鸣音，雏鸡感染可引起，雏鸡感染可引起死亡。死亡。 青年鸡和产蛋鸡感染青年鸡和产蛋鸡感染后可后可引起产蛋鸡停产或引起产蛋鸡停产或产蛋产蛋下降下降，产产软壳蛋、沙壳蛋或畸形蛋，蛋清稀薄如水。软壳蛋、沙壳蛋或畸形蛋，

13、蛋清稀薄如水。 病病鸡排白色稀粪，脱水鸡排白色稀粪，脱水，肾脏肿大，肾脏肿大，花斑肾花斑肾，死亡率，死亡率高。高。 符合上述临床症状之符合上述临床症状之一者可以一者可以怀疑感染鸡传染性支气管炎怀疑感染鸡传染性支气管炎病毒，确诊需经实验室检验。病毒，确诊需经实验室检验。1.临床诊断瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！采样工具2.无菌、安全采样瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！IBV病料采集 急性急性呼吸道型的病鸡，应采取呼吸道型的病鸡，应采取气管渗出物气管渗出物；对于刚扑杀；对于刚扑杀的病鸡则采取的

14、病鸡则采取支气管和肺组织支气管和肺组织。 肾型和肾型和产蛋下降的病鸡，应采取病鸡的产蛋下降的病鸡，应采取病鸡的肾脏肾脏和和输卵管输卵管。 也也可从可从大肠大肠，尤其是，尤其是盲肠扁桃体盲肠扁桃体或或粪便粪便分离病毒，但分离病毒，但从从消化道分离到的病毒未必与现流行株或发生的病毒有直消化道分离到的病毒未必与现流行株或发生的病毒有直接关系接关系。3.适时采样4.合理、典型采样瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！IBV病料采集样品样品量：要足量，且有备份量量：要足量，且有备份量 血清：血清：至少至少0.5ml 组织：组织：2-3g 棉拭子：旋转棉拭子：旋转2-3次，且停留次，且停

15、留3-5s5.适量采样瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！ 咽喉咽喉、腭裂、泄殖腔棉拭子采集方法如下：取咽喉拭子时将拭子深入、腭裂、泄殖腔棉拭子采集方法如下：取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回刮喉头口及上颚裂来回刮35次取咽喉分泌液；取泄殖腔拭子时将拭子深入次取咽喉分泌液；取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔并沾取少量泄殖腔并沾取少量粪便。将棉拭子浸入分装有生理盐水的离心管，折断超粪便。将棉拭子浸入分装有生理盐水的离心管，折断超出部分，盖紧，并送实验室检测出部分，盖紧，并送实验室检测。瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！组织样品的保存组织样品的保存采集采

16、集样品用封口袋包装，做好样品用封口袋包装，做好标记（编号、栋舍、场名），标记（编号、栋舍、场名），避免产生对检测的信息干扰。避免产生对检测的信息干扰。 病毒检验样品病毒检验样品，若若24小时小时内要内要送到实验室，送到实验室，可可冰袋冰袋冷藏冷藏处理处理。若。若超过超过24小时小时的应冻结处理的应冻结处理。夏天夏天不建议送检全鸡检测不建议送检全鸡检测。瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！ 最终原则就是选择较厚的泡沫盒，同时多放冰块。最终原则就是选择较厚的泡沫盒，同时多放冰块。病料的包装瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！病料检测前处理 将 病 料 放 在

17、 含 有将 病 料 放 在 含 有 1 0 0 0 0 I U / m L 青 霉 素 和青 霉 素 和10mg/mL链霉素的链霉素的pH值为值为7.4的的PBS内内，置于，置于冰盒内送往实验室冰盒内送往实验室。 将病料磨碎，加含抗菌素的将病料磨碎，加含抗菌素的PBS制成制成1:5体积比体积比组织组织悬液悬液，反复冻融，反复冻融，以以3000g离心离心20分钟，分钟，取上清液，加入浓度为取上清液，加入浓度为1000IU/mL的青霉素和的青霉素和终浓度为终浓度为1mg/mL的链霉素，的链霉素，37作用作用1小时后小时后用于用于PCR检测或鸡检测或鸡胚接种胚接种瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物

18、，助您的事业更精彩！疾病名称疾病名称病料采集部位病料采集部位鸡新城疫（ND）脑组织、气管、肺脏、咽喉拭子禽流感（AI）气管、肺脏、输卵管、咽喉、泄殖腔拭子鸡传染性支气管炎（IB）气管、肺脏、肾脏、咽喉拭子鸡传染性喉气管炎（AILT）气管渗出物、气管、肺禽滑液囊支原体（MS）血液、关节禽败血支原体（MG）血液、气管、肺产蛋下降综合征（EDS）输卵管、畸形蛋、变形卵泡包涵体肝炎（IBH）肝脏、肾脏瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！疾病名称疾病名称病料采集部位病料采集部位鸡马立克病（MD）肿瘤组织、毛囊、全血禽白血病（ALV）种蛋、胎粪、泄殖腔拭子、肿瘤组织禽脑脊髓炎（AE）发

19、病鸡的脑组织鸡病毒性关节炎（REO）关节及渗出物、腱鞘传染性法氏囊病（IBD）法氏囊、肾脏鸡传染性贫血病（CIA）脾脏、胸腺、法氏囊、骨髓禽网状内皮组织增殖病（RE）全血、脾脏、胸腺、法氏囊、肿瘤组织鸭瘟（DP）全血、鼻咽分泌物、粪便、病变组织鸭病毒性肝炎（DVH）全血、肝脏瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！小结 根据鸡群发病日龄、发病时间、采食情况、根据鸡群发病日龄、发病时间、采食情况、死淘情况死淘情况、产、产蛋情况、鸡舍环境变化、外界蛋情况、鸡舍环境变化、外界气候变化等信息气候变化等信息，再依据，再依据临床表现、流行病临床表现、流行病学、大体剖检病理变化等对鸡病做初步

20、诊断学、大体剖检病理变化等对鸡病做初步诊断，采集相应样品；无法判断，则需要多部位，采集相应样品；无法判断，则需要多部位采集；采集； 保证采集样本保证采集样本数量；数量； 无菌处理、方法科学；无菌处理、方法科学； 记录、保温、密封；记录、保温、密封；瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！PCR检测技术瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！PCR技术 PCR ：Polymerase chain reaction，即，即聚合酶链反应，是通过模拟体内聚合酶链反应，是通过模拟体内DNA复制复制的方式，在体外选择性地将的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊某个特殊区域扩

21、增出来的技术。区域扩增出来的技术。 1983，由美国科学家，由美国科学家Kary Mullis首次提出首次提出。 PCR的基本工作原理就是以拟扩增的的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的伸直至完成新的DNA合成。合成。瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！PCR原理 PCR反应的基本成分包括反应的基本成分包括5种基本成分：种基本成分：模板模板DNA、特异性

22、引物特异性引物、热稳定、热稳定DNA聚合酶、脱氧核聚合酶、脱氧核苷三磷酸（苷三磷酸（dNTPs）、Mg2+。瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！2021-12-947瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！以IBV为例 组织样品的处理组织样品的处理：肺脏：肺脏或肾脏等组织样品中加灭菌的或肾脏等组织样品中加灭菌的0.85%生理盐水研磨成生理盐水研磨成5倍倍10倍的悬浮液，反复冻融倍的悬浮液，反复冻融2次次3次后，以次后，以4000g离心离心10min，取上清液作核酸抽提，取上清液作核酸抽提用用。 棉棉拭子

23、的处理：将棉拭子充分捻动拧干后除去拭子，拭子的处理：将棉拭子充分捻动拧干后除去拭子，0.5mL样品液经样品液经4000g离心离心10min，取上清液作核酸抽提，取上清液作核酸抽提用用。 细胞培养细胞培养物：取物：取1mL细胞培养物反复冻融细胞培养物反复冻融2次次3次后，次后，以以4000g离心离心10min后取上清液作核酸抽提用。后取上清液作核酸抽提用。瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！抽提IBV RNA 取取200uL病料研磨液中病料研磨液中的上清液或尿囊液置于一灭的上清液或尿囊液置于一灭菌菌的的2mL离心管中，同时离心管中，同时设立阴性设立阴性尿囊液或阴性细尿囊液或阴

24、性细胞培养液和传染性支气管炎病毒胞培养液和传染性支气管炎病毒M41株阳性病毒液株阳性病毒液作为作为阳性对照阳性对照，再分别，再分别加入加入裂解裂解液液1mlTrizol，剧剧烈混合样品烈混合样品15s，室温，室温放置放置10min。 加入加入200uL三氯甲烷，颠倒离心管三氯甲烷，颠倒离心管混合混合5次，室温次，室温静置静置10min，4下下10000g离心离心15min。瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！抽提IBV RNA 吸取约吸取约500uL上层液上层液至至新的新的无无菌菌离心管中，加入离心管中，加入500uL异丙醇异丙醇/无水乙醇，无水乙醇，颠倒混匀颠倒混匀，4放

25、置放置10min，4下以下以10000g离心离心15min。 小心小心弃去全部上清液弃去全部上清液，加入，加入1mL无无RNase水配置的水配置的75%乙醇溶液，上下轻缓颠倒乙醇溶液，上下轻缓颠倒2次，次，4下以下以7500g离心离心5min。 弃弃去全部上清去全部上清（用移液器吸取或者用吸水纸吸（用移液器吸取或者用吸水纸吸干干），），风干风干510min，即制得，即制得RNA。瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！提取RNA时需要注意的问题 经常经常更换新手套和头套更换新手套和头套，皮肤上常带有的汗水、，皮肤上常带有的汗水、细菌、唾液以及空气中的灰尘都有大量细菌、唾液以及空

26、气中的灰尘都有大量RNase。 使用无菌无使用无菌无RNase的塑料的塑料制品避免交叉污染。制品避免交叉污染。 玻璃玻璃器皿可在器皿可在150烘烤烘烤4小时，塑料制品可在小时，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡中浸泡10分钟，然后用水彻底清分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除洗，高压灭菌，即可去除RNase。 配制溶液应使用无配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过的水（将水加入处理过不含不含RNase的玻璃瓶中，加入的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度至终浓度0.01v/v,放置过夜放置过夜,高压灭菌。注：高压灭菌。注：DEPC有致有致癌之嫌，需小心操作。癌之嫌，需小心操作。）瑞普

27、生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！RT-PCR反应（40ul体系）组份组份加入体积（加入体积（L）5 M-MLV Buffer4dNTP Mixture3Random Primer1M-MLV反转录酶0.4RNase inhibitor0.4RNA10-24RNase-free water补至40程序：程序：30 10 min；42 1 h；72 15 min；冷却冷却至至4；-20保存。保存。瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！ 设立设立以以IBV M41株的株的cDNA为模板的阳性为模板的阳性IBV 病病毒对照和阴性尿囊液或阴性细胞培养物的毒对照和阴性

28、尿囊液或阴性细胞培养物的cDNA为模板的阴性对照为模板的阴性对照。瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！PCR材料与程序瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！PCR的反应体系组份组份加入体积（加入体积（L）ddH2O13.210 PCR Buffer2.0dNTP Mixture1.6Primer.F0.5Primer.R0.5rTaq DNA酶酶0.2cDNA模板模板2.0Total2095预变性5 min；94 40 s；53 40s；72 50共30个循环；72延伸10min，4终止反应。瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！PCR检

29、测中的常见问题 RNARNA酶的污染酶的污染 内源的内源的RNARNA酶：进行组织裂解酶：进行组织裂解时加入时加入RNARNA酶抑制剂酶抑制剂 外部环境的外部环境的RNARNA酶：酶：带一次性带一次性手套和口罩，所有试剂和仪器手套和口罩，所有试剂和仪器都必须经过消毒处理和都必须经过消毒处理和RNARNA酶酶抑制剂处理抑制剂处理 EBEB的的问题，替代物问题，替代物GoldviewGoldview或或Gel-redGel-red瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！PCR产物的凝胶电泳和回收 PCR产物经过产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳，的琼脂糖凝胶电泳，100V，45min 将

30、电泳结束的胶板置于紫外拍摄仪中观察将电泳结束的胶板置于紫外拍摄仪中观察PCR结果结果 将目的条带用刀片切下，用凝胶回收试剂盒进行回收将目的条带用刀片切下，用凝胶回收试剂盒进行回收 回收的目的条带直接送测序公司测序回收的目的条带直接送测序公司测序瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！IBV凝胶成像瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！PCR检测中的常见问题结果出现假阳性结果出现假阳性 目标序列太短或者引物序列太短，导致出现假阳性；需目标序列太短或者引物序列太短，导致出现假阳性；需要重新设计引物要重新设计引物 靶序列或扩增产物交叉污染；加样时要小心，阳性对照靶序

31、列或扩增产物交叉污染；加样时要小心，阳性对照应最后加或者通过巢氏应最后加或者通过巢氏PCR进行扩增能显著提高扩增的进行扩增能显著提高扩增的特异性特异性 条带出现但是与目标条带大小不一致；引物聚合形成的条带出现但是与目标条带大小不一致；引物聚合形成的引物二聚体，退火时引物二聚体，退火时Mg2+离子浓度过高或者退火温度偏离子浓度过高或者退火温度偏低低瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！PCR检测中的常见问题结果出现假阴性结果出现假阴性 PCR产物放置时间过长；产物放置时间过长；PCR产物最好当日上电泳，不产物最好当日上电泳，不要超过要超过48h，超过，超过48h再上样条带可能不

32、规则甚至消失。再上样条带可能不规则甚至消失。 Mg2+浓度过高或过低；浓度过高或过低；Mg2+浓度过高可降低浓度过高可降低PCR扩增扩增的特的特 异性，浓度过低则影响异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使扩增产量甚至使PCR扩扩增失败而不出现扩增条带。增失败而不出现扩增条带。 反应体系的突然改变；通常进行反应体系的突然改变；通常进行PCR扩增采用的体积为扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul，在放大体系时，一定要模索条件，在放大体系时，一定要模索条件，否则容易失败。否则容易失败。 退火温度过低；可缓慢提高退火温度退火温度过低；可缓慢提高退火温度瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您

33、的事业更精彩！PCR检测中的常见问题PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带 其原因往往由于凝胶浓度或者没有充分凝固，酶其原因往往由于凝胶浓度或者没有充分凝固，酶量过多或酶的质量差，量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，浓度过高，Mg2+浓浓度过高，退火温度过低，循环次数过多度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。引起。瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！IBV结果判定 阳性对照在约阳性对照在约740bp和和290bp处分别有一条特异性处分别有一条特异性的的DNA条带，阴性对照则无相应的特异性条带出条带，阴性对照则无相应的特异性条带出现

34、，则实验成立。现，则实验成立。 待待检样品在相应的位置如出现特异性条带，或者仅检样品在相应的位置如出现特异性条带，或者仅在约在约740bp出现条带或者仅在月出现条带或者仅在月290bp处出现特异处出现特异性条带，则均可判为性条带，则均可判为阳性。阳性。 如果需要进一步验证的话，可以将获得的大小约为如果需要进一步验证的话，可以将获得的大小约为740bp或或290bp的的PCR产物回收纯化后测序，将测产物回收纯化后测序，将测序结果提交美国国家生物技术中心（序结果提交美国国家生物技术中心（NCBI）进行）进行BLAST分析。分析。瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！IBV测序结果

35、分析 IBV S1基因进化分析表基因进化分析表明，分离株明，分离株SD140120-1与流行毒株与流行毒株A2、LX4等均属于基因型等均属于基因型LX4，但不在同一亚分支，而但不在同一亚分支，而与与 H B 1 4 0 1 1 6 B 、JS101024等处于同一亚等处于同一亚分支，与常规 疫苗株分支，与常规 疫苗株H120等不属于同一基因等不属于同一基因型型。NDV、AIV检测结果的不同分析检测结果的不同分析瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！其他病原疫病名称疫病名称核酸类型核酸类型鸡新城疫、禽流感、鸡传染性支气管炎、鸡病毒性关节炎、禽呼肠孤、传染性法氏囊、禽白血病、鸭黄

36、病毒RNA鸡传染性贫血病、鸡传染性喉气管炎、马立克氏病、网状内皮组织增生病、包涵体肝炎、鸭瘟病毒、鸭细小病毒DNA瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！DNA抽提方法 180l样品样品+1mlDNAiso，颠倒混匀，静置，颠倒混匀，静置5min RT，4 10000g离心，离心，10min； 取上清取上清移移至新离心管中，加至新离心管中，加500l无水乙醇，反复颠无水乙醇，反复颠倒直至出现云雾状倒直至出现云雾状DNA沉淀，沉淀，4000g离心离心 5min； 弃上清，加弃上清，加1ml 75%乙醇（切勿触及沉淀），轻缓乙醇（切勿触及沉淀），轻缓上下颠倒洗涤，上下颠倒洗涤，4

37、12000g离心离心，5min；然后再次；然后再次洗涤；洗涤； 弃上清，室温短时干燥；弃上清，室温短时干燥； 加加3060 l TE/ddH2O溶解，溶解，-20保存。保存。瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！瑞普诊断中心PCR检测核酸的优势技术 NDV疫苗毒和流行毒株疫苗毒和流行毒株M： 1kbMarker1#：NDV基因基因II型病毒型病毒2#：NDV基因基因VII型病毒型病毒N： 阴性阴性对照对照P： NDV分离毒阳性对照分离毒阳性对照瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！瑞普诊断中心PCR检测核酸的优势技术 PCR区分区分IBV的疫苗的疫苗毒株和毒

38、株和流行流行毒株毒株M:1kbMarker1#: H120株株2#：4/91毒株毒株N：阴性阴性对照对照P：IBV分离毒分离毒阳性对照，阳性对照，4/91血清型血清型瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！PCR检测核酸的优点及局限性优点优点必须有一个庞大必须有一个庞大 的已知序列的的已知序列的 数据库。数据库。 特异特异 敏感敏感 快速、快速、 简便简便 易自动化等易自动化等检测阴性并不能检测阴性并不能 完全判定阴性完全判定阴性PCR的结果的结果 并不总是可靠并不总是可靠局限性局限性瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！DNA病毒病毒RNA病毒病毒组织病组织

39、病料或者料或者鸡胚尿鸡胚尿囊液囊液RTPCR凝胶电泳凝胶电泳图谱观察分析图谱观察分析测序分析测序分析小结 步步防止污染；步步防止污染； 设置阴阳性对照；设置阴阳性对照；瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！IBV、NDV、AIV-H9流行变化趋势01020304050602013.12013.22013.32013.42013.52013.62013.72013.82013.92013.102013.112013.122014.12014.22014.3阳性数阳性数IBVNDVAIV-H9瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！核酸检测的后续分析瑞普生物，让您

40、的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！禽原病毒分离瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！实验室常用的病毒分离方法 接种接种易感动物易感动物 接种接种SPF鸡胚鸡胚 接种接种敏感敏感细胞，常用细胞如细胞，常用细胞如DF-1、CEF、Marc-145等。等。瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！鸡胚接种法检测病原 主要主要分离毒种：分离毒种：NDV、AIV-H9、AIV-H5、IBV、IBDV、IBHV、ILTV、REOV等。等。 主要接种方式：尿囊腔接种、绒毛尿囊膜主要接种方式：尿囊腔接种、绒毛尿囊膜接种、卵黄囊接种等。接种、卵黄囊接种等。 根据不同毒种对

41、鸡胚不同部位的敏感性进根据不同毒种对鸡胚不同部位的敏感性进行接胚。行接胚。瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！病料接种鸡胚的原则 一般一般嗜神经性病毒主要动物脑内接种；嗜神经性病毒主要动物脑内接种； 嗜嗜呼吸道病毒接种动物鼻腔及鸡胚尿囊腔；呼吸道病毒接种动物鼻腔及鸡胚尿囊腔； 嗜嗜皮肤性病毒接种动物皮内、皮下或鸡胚绒毛尿皮肤性病毒接种动物皮内、皮下或鸡胚绒毛尿囊膜；囊膜； 嗜嗜内脏病毒可接种动物的腹腔、静脉、肌肉等。内脏病毒可接种动物的腹腔、静脉、肌肉等。 近年来，由于组织培养技术的广泛应用，多数病近年来，由于组织培养技术的广泛应用，多数病毒都能够用组织培养进行分离鉴定。毒

42、都能够用组织培养进行分离鉴定。瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！病毒病毒适宜接种适宜接种部位部位接种胚接种胚龄龄收获材料收获材料NDV, AIV, IBV尿囊腔9-11尿囊液IBDV, REOV, ILTV, FPV绒毛尿囊膜9-11绒毛尿囊膜及胚体研磨液IBHV，CIAV，ALV卵黄囊5-8胚体研磨液瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！尿囊腔接种绒毛尿囊膜接种卵黄囊接种瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！照胚照胚病料处理病料处理接种鸡胚接种鸡胚培养照胚培养照胚收胚收胚HA/HIPCR出具检测结果出具检测结果瑞普生物，让您的事业更精

43、彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！ 用用SPF鸡胚鸡胚，至少使用白壳非免胚。，至少使用白壳非免胚。 孵化时一般选择相对湿度为孵化时一般选择相对湿度为60%，最低温，最低温度度36，一般，一般37.5。每日翻蛋最少。每日翻蛋最少3次，次，大头朝上，注意鸡胚位置大头朝上，注意鸡胚位置 孵化孵化3-4天照蛋时，如果鸡胚天照蛋时，如果鸡胚正常可见清晰正常可见清晰的的血管及胎动，血管及胎动，血管分支血管分支明显；去除死胚明显；去除死胚、无精胚。、无精胚。瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！鸡胚的选择正常鸡胚正常鸡胚无精蛋无精蛋死胚死胚裂纹胚裂纹胚瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助

44、您的事业更精彩！IBV病料的处理和接种准备 取病料上清液，加抗生素取病料上清液，加抗生素（1000IU/mL青霉素和青霉素和1mg/mL的链霉素）置的链霉素）置37水浴水浴30min或置于或置于4过夜，然后过夜，然后12000rpm离心取离心取上清液，或者上清液，或者用用0.22m的无菌的无菌滤膜过滤除菌滤膜过滤除菌。 照照蛋用铅笔画出气室和胚胎的蛋用铅笔画出气室和胚胎的位置。位置。 用碘酊在接种处的蛋壳上用碘酊在接种处的蛋壳上消毒并消碘，消毒并消碘，并在该处并在该处打孔。打孔。瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！IBV鸡胚接种方式 接种接种于于5枚枚9日龄日龄-11日龄日

45、龄SPF鸡胚尿囊腔内，另鸡胚尿囊腔内，另取取5枚接种枚接种PBS液，接种量均为液，接种量均为0.2mL/枚枚。37孵育。每天照蛋，孵育。每天照蛋，24小时内死亡的鸡胚弃去小时内死亡的鸡胚弃去。收。收集接种后集接种后3d-7d的鸡胚尿囊液，将所有尿液液混的鸡胚尿囊液，将所有尿液液混合，用含合，用含1000IU/mL青霉素和青霉素和1mg/mL的链霉素的链霉素的的PBS液稀释液稀释510倍，继续在鸡胚内传代。典倍，继续在鸡胚内传代。典型的野毒株通常在鸡胚中传至第型的野毒株通常在鸡胚中传至第2代或低代或低3代，可代，可见侏儒胚，传至第三代，某些鸡胚可出现死亡。见侏儒胚，传至第三代，某些鸡胚可出现死亡

46、。含毒尿囊液置含毒尿囊液置-60以下可长期保存，也可冻干以下可长期保存，也可冻干保存保存4保存保存。瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！IBV鸡胚接种方式 将分离物经鸡胚传至将分离物经鸡胚传至3代或代或3代以上，收获代以上，收获接种后接种后7d（168h）仍存活的鸡胚，取胎儿）仍存活的鸡胚，取胎儿，用剪刀剪除胎儿体外的附属物，并用吸，用剪刀剪除胎儿体外的附属物，并用吸水纸水纸吸干吸干胎儿表面的液体。如果接种胎儿胎儿表面的液体。如果接种胎儿重量比对照鸡胚胎儿重量重量比对照鸡胚胎儿重量少少2g以上者，可以上者，可初步判定为有病毒感染。初步判定为有病毒感染。瑞普生物，让您的事业更

47、精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！IBV接胚结果 鸡胚呈蜷缩状，鸡胚外层包裹一层绒膜，鸡胚呈蜷缩状，鸡胚外层包裹一层绒膜，发育不全，侏儒胚发育不全，侏儒胚。瑞普生物，让您的事业更精彩！瑞普生物，助您的事业更精彩！绒尿膜接种-人工气室法 取取10-11日龄鸡胚，先在照蛋灯下检查鸡胚发育状日龄鸡胚，先在照蛋灯下检查鸡胚发育状况，划出气室位置，将绒尿膜发育区做一记号。况，划出气室位置，将绒尿膜发育区做一记号。 将鸡将鸡胚横卧胚横卧于蛋座上，绒尿膜区朝上。于蛋座上，绒尿膜区朝上。 用碘酒消毒绒尿膜区及气室中心部，在气室中心用碘酒消毒绒尿膜区及气室中心部，在气室中心部锥小孔。然后用锥子在记号处锥一约部锥小孔。然后用锥子在记号处锥一约0.5mm深深小孔，使卵壳穿孔，而壳膜不破。小孔，使卵壳穿孔，而壳膜不破。 用吸耳球吸