论文资料-系统性红斑狼疮患者Fas和CD40L表达的初步研究

1、.莅蒅袄肂蒇蚁螀肁膇蒄螆肀荿蝿蚂聿蒁薂羁肈膁螈袇肇芃薀螃肇莅螆虿膆蒈蕿羇膅膇莁袃膄芀薇衿膃蒂莀螅膂膂蚅蚁膁芄蒈羀膁莆蚄袆膀葿蒆螂艿膈蚂蚈芈芁蒅羆芇莃蚀羂芆薅蒃袈芅芅螈螄袂莇薁蚀袁葿螇罿袀腿蕿袅罿芁螅螁羈莄薈蚇羈蒆莁肆羇芆薆羂羆莈葿袈羅蒀蚄螄羄膀蒇蚀羃节蚃羈肂莅蒅袄肂蒇蚁螀肁膇蒄螆肀荿蝿蚂聿蒁薂羁肈膁螈袇肇芃薀螃肇莅螆虿膆蒈蕿羇膅膇莁袃膄芀薇衿膃蒂莀螅膂膂蚅蚁膁芄蒈羀膁莆蚄袆膀葿蒆螂艿膈蚂蚈芈芁蒅羆芇莃蚀羂芆薅蒃袈芅芅螈螄袂莇薁蚀袁葿螇罿袀腿蕿袅罿芁螅螁羈莄薈蚇羈蒆莁肆羇芆薆羂羆莈葿袈羅蒀蚄螄羄膀蒇蚀羃节蚃羈肂莅蒅袄肂蒇蚁螀肁膇蒄螆肀荿蝿蚂聿蒁薂羁肈膁螈袇肇芃薀螃肇莅螆虿膆蒈蕿羇膅膇莁袃膄芀薇衿

2、膃蒂莀螅膂膂蚅蚁膁芄蒈羀膁莆蚄袆膀葿蒆螂艿膈蚂蚈芈芁蒅羆芇莃蚀羂芆薅蒃袈芅芅螈螄袂莇薁蚀袁葿螇罿袀腿蕿袅罿芁螅螁羈莄薈蚇羈蒆莁肆羇芆薆羂羆莈葿袈羅蒀蚄螄羄膀蒇蚀羃节蚃羈肂莅蒅袄肂蒇蚁螀肁膇蒄螆肀荿蝿蚂聿蒁薂羁肈膁螈袇肇芃薀螃肇莅螆虿膆蒈蕿羇膅膇莁袃膄芀薇衿膃蒂莀螅膂膂蚅蚁膁芄蒈羀膁莆蚄袆膀葿蒆螂艿膈蚂蚈芈芁蒅羆芇莃蚀羂芆薅蒃袈芅芅螈螄袂莇薁蚀袁葿螇罿袀腿蕿袅罿芁螅螁羈莄薈蚇羈蒆莁肆羇芆薆羂羆莈葿袈 摘要】  目的 探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者凋亡调节蛋白受体Fas及共刺激分子CD40L的表达情况及其相互之间的调节。方法 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测SLE患者和正常人血清

3、sFas和sCD40L的水平并分析两者之间的相关性;同时分离10例SLE患者和10例正常对照的外周血淋巴细胞：将细胞培养48 h后，采用流式细胞仪检测T细胞亚群表面Fas及CD40L的表达情况;在培养过程中分别加入抗FasL抗体阻断Fas信号及抗CD40L抗体阻断CD40L信号后，观察T细胞亚群表面CD40L及Fas的表达。结果 SLE患者血清sFas和sCD40L平均水平分别为4.18 g/L和5.87 g/L，显著高于正常对照组2.27 g/L和2.31 g/L,且SLE患者血清sFas活动期高于稳定期(P<0.01或P<0.05);sFas、sCD40L水平与SLEDAI(疾

4、病活动指数)之间存在一定的正相关性(r=0.688,r=0.253，P均<0.05),但sFas与sCD40L水平之间未显示明显相关(r=0.201，P>0.05)。经细胞培养后，SLE患者CD4(+)和CD8(+) T细胞表面Fas表达增加，与正常对照组比较，差异有显著性(P<0.01或P<0.05);SLE患者CD4(+)和CD8(+) T细胞表面CD40L表达增加，与正常对照组比较，差异有显著性(P均<0.05)。SLE患者CD4(+)及CD8(+) T细胞上Fas与CD40L表达均呈正相关关系(r=0.311和r=0.517，P均<0.05)。加入抗

5、FasL抗体阻断后，CD4(+)和CD8(+) T细胞表面CD40L表达下降，与阻断前比较，差异有显著性(P<0.05);加入抗CD40L抗体阻断后，CD4(+)和CD8(+) T细胞表面Fas表达与阻断前比较差异无显著性(P>0.05)。结论 SLE患者血清sFas和sCD40L水平升高且呈正相关关系;T细胞亚群表面Fas及CD40L高表达且呈正相关关系;T细胞上Fas的表达调控CD40L的表达。说明凋亡调节蛋白Fas及共刺激分子CD40L可能共同参与SLE的发病过程。 【关键词】  系统性红斑狼疮;Fas;CD40LAbstract: Objective To inv

6、estigate the expressions of Fas and CD40L in patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Methods Serum sFas, sCD40L levels in patients with SLE and healthy controls were determined using a commercially available ELISA system and the correlation between the levels of sFas and sCD40L was analyze

7、d. Meanwhile, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of patients with SLE and health controls were isolated by gradient centrifugation of heparinized blood. The expressions of Fas and CD40L on CD4(+) and CD8(+) T lymphocytes in patients with SLE and controls were determined by flow cytometry (FCM

8、) after cultivation for 48 h. The antibodies of FasL and CD40L were add in the process of cultivation, and then the expressions of CD40L and Fas of peripheral blood T lymphocytes were determined. Results The average levels of sFas and sCD40L in SLE patients were 4.18 g/L and 5.87 g/L, respectively,

9、which were markedly higher than those of 2.27 g/L and 2.31 g/L in the healthy controls; the serum levels of sFas and sCD40L were significantly higher in active SLE patients than those inactive patients (P<0.01, P<0.05); the serum levels of sFas and sCD40L were shown to have a positive correlat

10、ion with SLEDAI scores (r=0.688, r=0.253,P<0.05), while no positive correlation was revealed between the levels of sFas and sCD40L (r=0.201,P>0.05). The expressions of Fas on CD4(+) and CD8(+) T lymphocytes in patients with SLE were significantly higher than those of the healthy controls (P<

11、;0.01 and P<0.05); the expressions of CD40L on CD4(+) and CD8(+) T lymphocytes in patients with SLE were significantly higher than that of the healthy controls (P<0.05). There was no correlations between the expressions of Fas on CD4(+) and CD8(+) T lymphocytes and those of CD40L (r=0.311, r=0

12、.517). The expressions of CD40L on CD4(+) and CD8(+) T lymphocytes in patients with SLE significantly decreased after blockage by the antibody of FasL (P<0.05); there was no difference in the expression of Fas in patients with SLE after blockage by the antibody of CD40L (P>0.05). Conclusion Th

13、e levels of sFas and sCD40L in SLE patients were higher than those of healthy controls and there was a positive correlation between them. The expressions of Fas and CD40L on CD4(+) and CD8(+) T lymphocytes in patients with SLE increased; and the expression of Fas had a positive correlation with that

14、 of CD40L; meanwhile, the expression of Fas regulated that of CD40L, which suggests that both Fas and CD40L are involed in the process of SLE.Key words：systemic lupus erythematosus; Fas; CD40L系统性红斑狼疮(SLE)是一种慢性自身免疫性疾病，引起多器官损害，具有产生多种自身抗体的特点1。Fas和CD40L均属于TNF/NGF受体超家族成员。Fas是一种细胞凋亡的调节蛋白受体，通过与Fas配体结合，介导细胞

15、凋亡2。CD40L是表达于B细胞或其他抗原递呈细胞(APC)表面的CD40分子的配体，目前认为，共刺激分子CD40-CD40L是为激活淋巴细胞的第二信号系统的组成部分，其在T细胞介导的B细胞活化中具有重要作用3-4。本研究同时检测SLE患者血清sFas和sCD40L水平及外周血CD4(+)和CD8(+) T细胞表面CD40L和Fas的表达，并用抗FasL抗体、抗CD40L抗体分别阻断Fas信号和CD40信号测定CD4(+)和CD8(+) T细胞表面CD40L和Fas的表达，观察了淋巴细胞表面Fas与CD40L表达的相关性及相互之间是否存在表达的调控情况，从而探讨Fas和CD40L参与SLE发病

16、过程的可能尚未被认识的机制。1 资料和方法1.1 研究对象和分组 SLE组：南京医科大学附属苏州市立医院门诊或住院的SLE患者46例，其中女性42例，男性4例，年龄961岁，平均年龄32岁。其中36例进行血清sFas、sCD40L测定,10例进行T细胞亚群表面Fas与CD40L表达及相关性研究。所有SLE病例均符合美国风湿病协会(ARA)的诊断标准。根据临床表现及实验室检查指标，参照SLE疾病活动性指数(systemic lupus erythematosus disease activity index, SLEDAI)5评分标准，判断SLE的病情活动性，将SLE组患者进一步分为活动期(SL

17、EDAI 10)及缓解期(SLEDAI<10)2个亚组。正常对照组:30例，其中男3例，女27例，平均年龄32.5岁，均为门诊健康体检者。1.2 主要仪器 MicroReader4型酶联免疫检测仪,HFsafe-900型生物安全柜;TC2323型二氧化碳培养箱,Coulter公司流式细胞仪。1.3 主要试剂 晶美生物工程有限公司sFas检测试剂盒,Bender MedSystems公司sCD40L检测试剂盒,上海试剂二厂淋巴细胞分离液,GIBCO公司RPMI 1640培养液,eBioscience公司抗人FasL、抗人CD40L阻断性抗体,Caltag公司PE-CY5-抗CD3、FITC

18、-抗CD4、FITC-抗CD8荧光标记抗体,eBioscience公司PE-抗CD40L、PE-抗Fas荧光标记抗体。1.3 方法1.3.1 sFas、sCD40L的检测 严格按说明书进行操作。结果判断：用MicroReader4酶标仪比色，得到光密度(D)值，以标准品浓度作横坐标，D值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点，通过标本的D值可在标准曲线上查出其浓度。1.3.2 细胞分离培养 取正常健康体检者和SLE患者肝素抗凝外周静脉血，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用RPMI 1640培养液调细胞密度至1×109/L，加入24孔培养板中37、5% CO2培养48 h。SLE患者细

19、胞培养液中纯化抗人FasL抗体和纯化抗人CD40L抗体浓度均为1 mg/L。正常对照组细胞培养液中植物血凝素(PHA)浓度为75 mg/L。1.3.3 流式细胞仪检测 取100 l细胞悬液，分别加入抗CD3、抗CD4、抗CD8单抗各5 l，加入抗Fas抗体或抗CD40L抗体20 l，在对照管中加入正常小鼠IgG1(独特型)20 l，混匀后置室温20 min，用PBS洗1次，弃上清液加入生理盐水0.5 ml后进行流式细胞计数分析。1.4 统计学处理 数据采用±s表示，样本均数比较采用t检验。相关性检验采用Spearman等级资料进行分析，P<0.05认为差异有显著性。2 结 果2

20、.1 SLE患者与正常对照组血清sFas、sCD40L检测结果比较 SLE患者血清sFas、sCD40L水平均明显高于正常对照组(P均<0.01)，SLE患者血清sFas、sCD40L水平活动期均高于缓解期(P<0.01或P<0.05)。见表1。2.2 SLE患者血清sFas、sCD40L水平与SLEDAI积分的相关性分析及sFas、sCD40L水平之间的相关性分析 sFas、sCD40L与SLEDAI积分之间均存在正相关关系(r=0.688、r=0.253，P均<0.05)，sFas与sCD40L水平之间未显示明显相关(r=0.201，P>0.05)。表1 SL

21、E患者和正常对照组血清sFas、sCD40L水平与正常对照组比较：*P<0.05;*P<0.012.3 SLE患者和正常对照组CD4(+)及CD8(+) T细胞表面Fas和CD40L表达的比较 SLE患者CD4(+)及CD8(+) T细胞表面表达的Fas显著高于正常对照组(P<0.01或P<0.05);SLE患者CD4(+)及CD8(+) T细胞表面表达的CD40L也高于正常对照组(P均<0.05)。见表2。表2 SLE患者和正常对照组间T细胞表面Fas、CD40L表达的比较与正常对照组比较：*P<0.05，*P<0.012.4 SLE患者CD4(+)

22、及CD8(+) T细胞Fas与CD40L表达的相关性比较 SLE患者CD4(+)及CD8(+) T细胞上Fas与CD40L表达均呈正相关关系(r=0.311、r=0.517,P均<0.05)。2.5 SLE患者CD4(+)及CD8(+) T细胞在抗人FasL抗体及抗人CD40L抗体阻断前后CD40L及Fas表达的比较 SLE患者T细胞培养中加入抗FasL抗体阻断后，CD4(+)和CD8(+) T细胞表面CD40L表达与阻断前比较均明显下降(P<0.05);加入抗CD40L抗体阻断后，CD4(+)和CD8(+) T细胞表面Fas表达与阻断前比较差异无显著性(P>0.05)。见表

23、3。表3 SLE患者CD4(+)和CD8(+) T细胞在抗人CD40L抗体阻断前后CD40L、FAS 表达的比较与阻断前比较：*P<0.053 讨 论SLE是一种至今病因未明的系统性自身免疫性疾病。近来研究较多的是与自身免疫性疾病关系密切的T细胞表面分子Fas和CD40L，两者在自身免疫性疾病的发生、发展过程中起着极其重要的免疫调节作用。Fas是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的细胞表面分子，其配体是FasL，Fas/FasL参与细胞凋亡过程;CD40L是CD40的配体，属TNF超家族成员，主要存在于活化的CD4(+) T细胞表面，亦少量表达于CD8(+) T细胞B细胞NK细胞单核细胞及

24、血小板表面。表达于B细胞或抗原提呈细胞表面的CD40分子与其配体CD40L间的相互作用构成了一组重要的共刺激信号6-7。研究表明，静止的T细胞表达一定量的Fas，但对凋亡不敏感，当抗原与T细胞受体(TCR)结合后，在静止T细胞被激活而增殖的同时，也启动凋亡，导致涉及凋亡的Fas基因转录增加，Fas表达上调，SLE患者T细胞表面表达的Fas增加8。同时有研究表明，SLE患者外周血T、B细胞表面CD40L表达增加，且活化T细胞表达CD40L9。说明SLE的发生、发展与凋亡调节分子和共刺激分子的异常密切相关。我们的研究结果显示，不仅SLE患者血清sFas与sCD40L水平升高且呈正相关关系，而且，S

25、LE患者CD4(+) T细胞和CD8(+) T细胞表面的Fas表达高于正常对照组，反映了SLE患者T细胞处于异常活化状态;Fas表达增加，参与诱导了SLE患者T细胞凋亡;SLE患者CD4(+) T细胞和CD8(+) T细胞表面CD40L的表达也升高，也反映了SLE患者T细胞的活化。已有研究证实，部分活化的T细胞在无辅助刺激信号条件下即可分泌细胞因子如IL-1、IL-1、IL-12等，这些细胞因子可作为第二信号作用于T细胞，促进T细胞的进一步活化、分化和增殖，表达较强的CD40L10。进一步分析表明，SLE患者CD4(+)及CD8(+) T细胞上Fas与CD40L表达也呈正相关关系，提示Fas表

26、达与CD40L表达的密切相关性。同时，加入抗FasL抗体阻断后，CD4(+)和CD8(+) T细胞表面CD40L表达下降，与阻断前比较，差异有显著性(P<0.05);加入抗CD40L抗体阻断后，CD4(+)和CD8(+) T细胞表面Fas表达与阻断前比较差异无显著性(P>0.05)。这一结果说明，T细胞上Fas的信号可能对CD40L的表达有调控作用，但CD40/CD40L信号则未呈现对Fas表达的调节作用。T细胞上调CD40L表达有重要的生物学意义。在SLE的病理机制中，T细胞CD40L表达的上调，可进一步导致自身反应性B细胞的活化、增殖、分化和自身抗体的产生。而且，尽管SLE的T

27、细胞高表达Fas，T细胞凋亡明显，而B细胞却凋亡并不显著11，这可能与CD40L介导的信号可使活化的B细胞降低对凋亡信号的敏感性、使B细胞逃逸凋亡有关，也促进了自身抗体的产生12。因此，Fas/FasL相互作用形成的Fas信号上调T细胞CD40L表达，可能是这两个细胞信号系统共同参与SLE发病的机制之一。最近，Collins等13发现，从莱姆病关节炎关节滑液中分离获得的Vdelta1 T细胞高表达FasL，可通过Fas/FasL信号途径作用于不成熟树突细胞(DC)表面的Fas，促进DC的活化和成熟，B细胞在自身抗体持续产生中是否也起类似DC的作用值得深入研究。迄今为止，尚未见到关于Fas/Fa

28、sL可上调T细胞CD40L表达的研究报告。本研究的实验则初步提示了这种相互调节的可能。当然，这还需要进一步的深入研究加以证实。目前SLE的发病机制尚不完全清楚，Fas、CD40L的高表达可能是SLE发病的重要原因，研究Fas及CD40L信号的相互调节可能会为探讨SLE发病机制及药物干预提供新的线索。【参考文献】  1 Kotzin BL. Systemic lupus erythematosas J.Cell, 1996,85(3):303-306.2 李华，王吉波.细胞凋亡与系统性红斑狼疮J.山东医药,2005,45(16)：80-81.3 李玉杰.共刺激分子CD28：CTLA4/

29、B7及CD40/CD40L和SLE J.国外医学·免疫学分册,2003,26(3):116-120.4 Mehling A, Loser K, Varga G, et al. Over-expression of CD40 ligand in murine epidermis results in chronic skin inflammation and systemic autoimmunity J. J Exp Med, 2001, 194(5):615-628.5 Bombardier C, Gladman DD, Urowitz MB, et al. Derivation

30、of the SLEDAI. A disease activity index for lupus patients. The Committee on Prognosis Studies in SLE J.Arthritis Rheum, 1992, 35(6):630-640.6 Yazdany J, Davis J. The role of CD40 ligand in systemic lupus erythematosus J.Lupus, 2004, 13(5):377-380.7 杨灏,贺福初,周钢桥.CD40/CD40L轴的生物学功能及其与疾病的关系研究进展J.国际免疫学杂志,

31、2007,30(6):384-388.8 张哲,陈勇.系统性红斑狼疮外周血T、B淋巴细胞Fas、FasL表达及凋亡的关系研究J.中华风湿病学杂志，2005,9(4):238-240.9 李玉杰,李幼姬,叶任高，等.系统性红斑狼疮外周血单个核细胞CD40L的表达增高J.中国病理生理杂志,2003,19(4):514-517.10 Biliska M, Frydecka I, Kosmaczewska A, et al. CD40L expression on T CD4+ lymphocytes from peripheral blood in patients with relapsing-remitting and secondary progressive multiple sclerosis J. Pol Merkur Lekarski, 2006, 20(115):41-45.11 Wang H, Xu J