生物显微技术复习

1、第二章 显微镜及其附加设备第一节 显微镜的光学原理 放大镜放大镜的放大率公式，通常采用以下形式： =250/ f 由上式可知，放大镜的放大率仅由其焦距所决定，焦距越小则放大率越大。由于单透镜有相差存在，加上加工的原因，不能期望以减少凸透镜的焦距来获得很大的放大率。简单放大镜放大率都在10×以下。构造相对复杂的为解剖显微镜，它由几个透镜组成，其放大率在200×以下。 放大镜的放大倍数越高，其焦距越短， 工作距离也越短。凸透镜的成像规律为： 若u>2f，则2f>v>f，异侧倒立缩小的实像 若2f>u>f，则v>2f，异侧倒立放大的实像 若u=

2、f，则v，不成相 若u<f，则同侧正立放大的虚像分辨率 分辨率是指能区分两个物点间最小距离的能力。两物点间的最小距离称为分辨距离。分辨距离越小，分辨率越高，也就是分辨细微结构的能力越大。普通光学显微镜分辨率的极限是0.2m。可把物体放大1500倍 。放大率 放大率就是放大倍数，是指被检验物体经物镜放大再经目镜放大后，人眼所看到的最终图象的大小对原物体大小的比值，是物镜和目镜放大倍数的乘积。 总放大率=物镜放大率×目镜放大率 显微镜的放大倍数是指对物体长度的放大。 显微镜放大率公式：=250/ f1 f2 式中：为光学筒长，一般为160mm； 250为明视距离，单位为mm； f

3、1为物镜的焦距；f 2为目镜的焦距。 在考虑其总放大倍率的同时，首先应选取所用物镜的放大倍数，其次才考虑目镜的放大倍数。其原因在于显微镜的成像质量主要取决于物镜的分辨率。镜口角 孔径角又称“镜口角”，是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。 孔径角越大，进入物镜的光通亮就越大，它与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。 数值孔径 数值孔径（NA）：是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率和孔径角半数的正玄之乘积。用公式表示如下：NA=hsinu/2 。 它与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦深成反比，NA值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。 数值孔径与其他技术参数有着密

4、切的关系，它几乎决定和影响着其他各项技术参数。必须指出，为了充分发挥物镜数值孔径的作用，在观察时，聚光镜的NA值应等于或略大于物镜的NA值。 l 降低波长值，使用短波长光源。l 增大介质n值和提高NA值。l 增大孔径角。l 增加明暗反差。焦深 焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。 焦深与总放大倍数及物镜的数值孔镜成反比。焦深大，分辨率降低。镜像亮度 镜像亮度是指显微镜观察中的图像明暗程度。 NA值越大，镜像的亮度就越大，总放大倍数就越好。视场亮度 视场亮度是显

5、微镜所观察的整个视场（或视野）的明暗程度。 它与物镜、目镜、聚光镜、视场光阑、光源等因素有关。 视场亮度大，镜像亮度大。视场直径 视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径23最为科学，大视场容易引起场曲。F=FN/M; F: 视场直径，FN：视场数，M:物镜放大率。视场数（Field Number, 简写为FN），标刻在目镜的镜筒外侧。由公式可看出：1视场直径与视场数成正比。2增大物镜的倍数，则视场直径减小。因此，若在低倍镜下可以看到被检物体的全貌，而换成高倍物镜，就只能看到被检物体的很小一部份。覆盖度 覆盖度：显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。

6、由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生了相差，这就是覆盖差。 国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm, 许可范围在0.16-0.18mm., 工作距离工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离 。平时习惯所说的调焦？机械筒长 从镜筒的肩部（目镜下缘）到物镜螺旋肩部之间的长度叫机械筒长，一般它的长度为160mm。焦点：决定图像是模糊还是清晰？焦点与焦距有关，且可以通过聚焦旋钮控制。样本载玻片上的盖片厚度也会影响图像对焦。正确的盖片厚度应标注在物镜的侧面。 分辨率：图像中的两个像素达到多近的间距时会分辨不清？分辨率与物镜的数值孔径（数值

7、孔径越大，分辨率越高）以及通过透镜的光线波长（波长越短，分辨率越好）有关。 调节不同参数产生的效果l 亮度：表示图像有多明亮？亮度与照明系统相关，因而可以通过改变灯的电压/电阻器，以及调节聚光器和光圈/针孔孔径进行更改。此外，亮度还与物镜的数值孔径有关（数值孔径越大，图像越明亮）。 l 对比度：样本周围区域的光照差别怎样？对比度与照明系统相关，可以通过改变光线强度以及光圈/针孔孔径对其进行调节。除此之外，对样本进行化学着色也可以增强对比度。 明视距离 从眼球的水晶体到放大的虚像之间的距离叫明视距离 ，它的长度为250mm，这是观察显微镜中物像最适宜的距离。一、物镜l 物镜分前透镜和后透镜。l

8、高倍镜为弹簧物镜。（一）几个概念1、齐焦 反映某一倍数的物镜观察图像清晰后，在转换至另一倍率的物镜时，其成像亦应基本清晰，且物镜光路也基本合轴，中心不偏离。2、色差3、球差4、场曲2、透镜的像差 某一物点发出的光束，经过透镜以后，仍然是同心光束，还都会聚在一点，由这种方式形成的像点称为理想像点。由理想像点构成与原物形状、颜色完全相似的像，称为理想像。 实际上，从一点发出的光束在通过透镜后并不完全会聚于一点，而是分布在空间一个很小的区域内，成为一个模糊的斑点或称弥散圈。同样，一个物体通过透镜后也不可能形成一个与原物体完全相似的像。造成这些缺陷的主要原因是透镜本身存在的各种像差。像差l 单色相差l

9、 轴上点的单色像差 球差 慧差 像散l 轴外点的单色像差 场曲 畸变l 复色像差色差1）轴上点的单色像差球差l 由光轴上一点发出的光线经透镜折射后，不再是同心光束，入射光线的孔径角不同，其出射光线与光轴交点的位置就不同，相对于理想像点有不同的偏离，这就是球差。孔径角越大，则光线的折射率越大。 球差及球差的消除球差l 球差也称球面差、球面像差，指透过透镜边缘的光线曲折度大于透过中央部分的现象，会聚的焦点参差不齐，使成像不清晰，有时变形。2）轴外点的单色像差l （1）慧差l 慧差即慧形像差，又叫侧面球差。它是光轴外一点发出宽光束通过透镜折射会聚所形成的一种像差。其形成原因是由于透镜边缘一带的光线与

10、透镜主轴一带的光线所会聚的焦点位置和影像大小有差别。得到的影像的一端宽大虚散而较暗，另一端则窄小清晰而较亮，严重影响图像的清晰度。慧差(Coma) 靠近光轴的物点发出的大孔径光线不聚焦于一点 Y慧差的校正：l 复合透镜；l 非球面透镜；2）轴外点的单色像差l 2）像散l 当轴外一点发出很细的光束投射在透镜上成像时，由于细光束的光束轴与法线不重合，其出射光束不再存在对称轴，而只存在一个对称面（子午面）。与此细光束对应的微小波面并非旋转对称，在不同方向上有不同的曲率，因此形成像散光束。存在着像散的光学系统，不能使物面上所有物点形成清晰的像点群。 （3）场曲：即像场弯曲。每个物点都能得到一个清晰的像

11、点，但是整个像面不是一个平面，而是一个回转曲面。因此，像平面是不清晰的。当使用存在场曲的镜头拍摄时，如果景物中间部分清晰，则边缘部分模糊；反之，当景物边缘部分清晰时，则中间部分模糊。 场曲 ：曲也称像场弯曲，指整个像平面是一个曲面，这样的像平面是不清晰地。（4）畸变产生畸变的原因是在一对物、像共轭平面上，垂轴放大率随视场大小而改变，不再保持常数，使像相对于物失去了相似性。如果主光线和高斯像面焦点的高度随视场增大而大于理想像高，即为正畸变，又叫枕形畸变；如果主光线和高斯像面焦点的高度随视场增大而小于理想像高，即为负畸变，又叫桶形畸变。l 3）复色像差色差l 1.位置色差l 描述轴上物点用不同色光

12、成像时成像位置差异的像差称为位置色差，也称为轴向色差。同一透镜对不同色光有不同焦距。当透镜对于光轴上一点成像时，按色光的波长的由短到长，每种色光形成的像点离开透镜由近到远地排列在光轴上，这就是位置色差。l 2.倍率色差l 当光学系统校正了位置色差以后，可认为两种色光的像面重合在一起。但对于轴外点来说，由于不同色光的焦距不等而放大率不等，因而有不同的像高。光学系统对不同色光的放大率的差异称为倍率色差，也称放大率色差或垂轴色差。倍率色差破坏轴外点像的清晰程度，造成白色像的模糊。 色 差 的 消 除色差是指光线通过一个透镜后，不能使所有颜色的光都聚在一个焦点上，而是残次不齐的。（二）物镜种类功能：a

13、 产生物体的第一次倒立实像 b 放大作用1.按介质来分：l 干燥系物镜l 油浸系物镜l 水浸系物镜油镜的使用方法(1)首先用低倍干系物镜找出要观察的区域。(2)当标本被照明时，把一滴(不要多于一滴)浸油准确地滴到盖玻片上的照明区域，并注意不要在滴入的浸油里混有气泡。(3)在现代显微镜中，用干系物镜聚焦标本后可以在不改变粗调和细调的情况下转动物镜转换台直接把油浸物镜浸到油里。(4)当油浸物镜已经浸入浸油之后，用细调进行进一步的调节直到像被清晰地聚焦，并在细调旋钮的刻度尺上记下所转动的刻度。当第一次聚焦使用固定的低倍干系物镜时，每次使用油浸物镜的聚焦都需要相同的调节，即沿着同样的方向使细调转动相同

14、的刻度。2.物镜种类l 消色差物镜Ach 消除红蓝光的色差 ，由含铅的火石玻璃单凹透镜粘合成l 复消色差物镜APO：能消除红、绿、蓝光的色差，校正红蓝二色光的球差。特种玻璃或萤石、氟石等材料制成l 半复消色差物镜FL：校正红蓝二色光的色差和球差， 氟石等材料制成l 平场物镜Plan：增加一块半月形的厚透镜，视场平坦，视场较大，工作距离也增大。 Plan Ach、Plan APO、S Plan、S PLan APOl 特种物镜带校正环物镜带彩虹光阑的物镜相衬显微镜（ph）无应变物镜（PO或POL）无荧光显微镜（UVFL）无罩物镜（NC）长工作距离物镜（倒置）l 170；表示所适用的显微镜机械筒长

15、，即从物镜的肩部到目镜上缘的距离为170mm。l 0.17：表示物镜所要求的盖玻片厚度为0.17mm。l PL APo；表示物镜的矫正程度为平面复消色差，NPL表示标准平面消色差。l 100(或40)：表示物镜的放大倍数为100(或40)倍。l Oil；表示物镜的浸润介质为油浸。物镜没有标记这种字母，表示介质为空气的干系物镜。l 0.65：表示物镜的数值孔径(即镜口率)为0.65，这是决定物镜性能的非常重要的参数。二、目镜：目镜分接目镜和场目镜 眼点：从目镜透射出来的光线，在目镜的接目镜以上形成的交叉点。作用：a 、将物镜形成的倒立实像变成正立的虚像。 b、将像再放大4-16倍。目镜的种类l

16、惠更斯目镜（平凸同向）l 冉姆斯登目镜（平凸相对）l 凯尔勒目镜（目镜胶合）l 补偿目镜（补偿色差，高倍镜使用）l 照相目镜（负焦点目镜）l 平场目镜（增加一块负透镜，p或plan）l 广视野目镜（W或WF或WHF）对于一个戴眼镜的工作者来说，在进行显微观察时应该戴着眼镜还是应该摘去眼镜呢？ 一般说来摘去比较合适。 大多数标准目镜的出瞳高度为6-12mm，而眼睛的瞳孔一般距眼镜玻璃片12-14mm，再加上镜片的厚度，这就大大地超过了显微镜的出瞳高度，使得眼睛错过了整个视场。此外，当眼镜尽可能地贴近目镜时，由于眼镜与目镜的相互接触和摩擦，就会损伤目镜前透镜和眼镜镜片。三、聚光器l 透镜组和孔径光

17、阑装置组成l 可调焦l 暗场、偏光、相衬、微分干涉、长工作距离聚光器四、载物台和光源1、载物台l移动方向和视野方向？2、光源l人工光源l人工光源：具有足够的照明亮度和足够的单色光照明亮度；具有足够大的发光表面。ll 光源是40一60w的高压白炽钨灯。ll 现在经常用于显微镜的是12v或6v的低电压灯泡，这种灯泡具有1560w或更高的功率。自然光源l 在使用高倍观察当像的亮度不足的情况，应该使用40w的高压灯泡还是100w的高压灯泡？照明方式l 透射式照明l 落射式照明1.光源 2.聚光透镜 3.孔径光阑4.视场光圈 5.聚光透镜6.半透膜反射镜 7.物镜8.被检物体 9.至中间像面光路照明方法

18、 临界照明 l临界照明是通过乳白灯泡的照明表面或场玻璃屏直接照明物体，照明的光锥可以通过在集光器入瞳处的孔径光阑而控制，照明区域的大小是通过视场光阐来调节的。l缺点：（1）物场上光的强度不均匀；l （2）当使用低放大倍数时像的亮度太强。 科勒照明 把一个弱的正透镜即聚光透镜或一个附加集光器放在照明光源的前面，于是光源的像就被聚焦在集光器的后焦面上（即孔径光阑的平面上），附加集光器表面的像就被聚焦在标本平面上。 优点：（1）用在光学上制作的单色场作为光源。限制了在像的形成中不起作用的物场外照明区域，减少了散射光和闪光，其结果可以形成高反差的像。（2）它可以使用具有密集灯丝和高亮度的低压小灯泡。五

19、、显微镜的使用与维护1、显微镜的使用注意事项(1)工作间不应该太亮，如果可能的话应该避免任何直射的阳光，面朝北的房间是最适合的。(2)显微镜应避免放在具有腐蚀性挥发气体的实验室内，如果在工作间内必须使用冰醋酸等具有腐蚀性气体的药品，应该安装上通风设备。(3)工作间应具有良好的防尘条件，并应经常保持清洁。显微镜在使用之后应盖上防尘罩，尽量避免灰尘落入镜台及透镜上，否则会严重地影响显微镜的机械功能和像的质量。(4)工作间的室温应保持相对稳定，防止较大的温度变化；显微镜应有固定的工作间，避免经常搬动；如果显微镜从一个热的房间搬到一个冷的房间，应待透镜上的凝结水蒸发以后方可使用。微调是显微镜机械装置中

20、较精细而又容易损坏的元件，拧到了限位以后，拧不动时决不能强拧。遇到这样情况，应将微调退回35圈，重用粗调调焦，待初见物像后，在改用微调。使用高倍镜观察液体标本时，一定要加盖玻片。油镜使用后，一定要擦拭干净。仪器出了故障，不要勉强使用。否则，可能引起更大的故障和不良后果。 3、光学表面的维护(1)对于光学表面上的灰尘最好用一个干而柔软的毛刷除去。(2)对于光学表面上的指纹汗迹和其他污点，可以用一块柔软的干布或蘸有二甲苯、汽油的镜纸擦拭，但不能用二甲苯弄湿透镜或直接将透镜浸在二甲苯中。(3)对于边缘突出的镜头或凹面前透镜，用擦镜纸或布很难擦到整个透镜表面，这时可以把棉球缠在火柴杆上并蘸上二甲苯清擦

21、。(4)油浸物镜在使用后应该及时消擦，既使是使用非树脂性浸油，经过较长时间它们也会对透镜产生不利影响。应该先用干擦镜纸擦，然后用蘸有二甲苯的擦镜纸或柔软的布擦。(5)在任何情况下决不能把物镜拆卸开来进行擦洗，这不仅因为物镜筒是作为一个整体制造的，而且它的内表面膜很软，很容易损坏。用途l 生物显微镜： 普通、研究型、照相、联合观察、相差、暗室野、荧光、投影、倒置、电视录像、微分干涉差、激光共聚焦显微镜l 体视显微镜：普通体视镜、体视摄影显微镜l 偏光显微镜：透射式、反射式偏光显微镜l 电子显微镜：透射式、反射式电子显微镜l 特种显微镜:显微光度计、扫描显微光度计荧光显微镜特点：光源为紫外线，波长

22、较短，分辨力高于普通显微镜；用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。采取措施：第一，落在标本上的光应该尽可能多地包含具有一定波长的激发光，而避免对荧光的产生无用的其他波长的光，这必须使用一种只允许一定波长和带宽的光通过的激发滤片，或一个只能发出具有一定波长和带宽光的单色仪；第二，对于从标本发出的光，必须使用阻断滤片把没有通过荧光效应而改变的激发光过滤掉，于是只有发射的荧光能够到达眼睛或照相材料。透射电镜特点l 必须制作超薄切片 7.5-15nml 在真空中进行观察，标本不是生活状态。l 电子的穿透能力有限。l 与其他分析方法比较，穿透式电子显微镜分析是一种破坏性分析

23、。光学显微镜与电子显微镜的区别项目 电子显微镜 光学显微镜 照明光源 电子束 照明波长 加速电压80kV时，波长为0.0042nm 其中紫色光波长400nm分辨率 0.2nm 放大倍数 100万倍 成像透镜 电磁透镜 照明介质 1.33 x 10-4Pa 以上真空度 焦距调整 调整物镜电流，改变磁场强度调整焦距 调焦样 品 50100nm超薄切片 样品载体 具有支持膜载网 可见光0.2m（肉眼分辨0.2mm）1000倍 玻璃透镜空气、玻璃、油厚切片载玻片 1与TEM有关的电子显微术（1）超薄切片技术。超薄切片技术就是通过固定、脱水、包埋、切片和染色等步骤，将生物标本切成薄于0.1m的超薄切片的

24、样品制备技术，用于生物组织的内部超微结构研究。（2）负染色技术。利用电子密度比标本高的重金属盐（如磷钨酸钠、醋酸铀等）将生物标本包围起来，增强背景散射电子的能力以提高反差，在黑暗的背景下显示标本的形态结构，称负染色技术。这一技术操作简便，主要用于颗粒状标本（如细菌、病毒、分离细胞器等）的研究。（3）冷冻蚀刻技术。在快速冷冻下对生物样品进行断裂、蚀刻和复型，制备生物样品复型膜的技术称冷冻蚀刻技术。在电镜下观察复型膜可获得立体感强的超微结构图像，主要用于生物膜结构的研究。（4）电镜细胞化学技术。在超微结构水平上，通过电镜细胞化学反应来研究细胞成分的分布和变化的方法称电镜细胞化学技术。这一技术把细胞

25、超微结构与其化学组成有机地结合起来，目前主要用于研究细胞内各种大分子物质和酶的定位等。（5）免疫电镜技术。这是一种使抗原在超微结构水平上定位的技术，应用与抗原相应的标记抗体，在电镜下观察标记物的位置，从而定位相应抗原。这一技术具有灵敏度高、特异性强的特点。（6）电镜放射自显影技术。这是电镜技术与放射自显影技术相结合，观察放射性物质在超微结构水平上的定位和变化，从而了解细胞的各种代谢活动。这一技术使结构与功能的研究结合起来，是一种动态的研究方法。扫描电镜原理 工作原理：利用电子射线轰击样品表面，引起二次电子等信号的发射，经检测装置接收后成像的一类电镜。主要优点：景深长，所获得的图像立体感强，可用

26、来观察生物样品的各种形貌特征。l 可以观察样品表面的立体结构。l 试样制备相对简单。 用于扫描电镜观察的样品一般需要经过干燥处理，确保在真空中观察不变形。另外，为了防止电子在标本上聚集，需要进行镀膜处理，使样品导电。l 目前扫描电镜的分辨力为610nm，扫描电镜的最大有效放大倍率为200000X。20-20万倍之间连续可调。SEM与TEM的主要区别在原理上，SEM不是用透射电子成像，而是用二次电子加背景散射电子成像。在仪器构造上，除了光源、真空系统相似外，检测系统完全不同。四、生物学中的应用l 目前，与电子显微镜相适应，产生了很多衍生技术，如负染技术、胶体金免疫标记技术、大分子（核酸）电镜技术

27、、复型和冷冻蚀刻技术、电镜放射自显影技术及电镜酶细胞化学技术等。l 电子显微镜在细胞超微结构研究、病毒结构研究、生物大分子结构研究、超微病理学研究等生命科学、生物医学等领域有广泛的应用。当代显微镜的发展趋势：采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、摄影装置于一体。自动化与电子化。STM的工作原理 隧道效应: 当具有电位势差的两个导体之间的距离小到一定程度时，电子将存在一定的几率穿透两导体之间的势垒从一端向另一端跃迁，这种电子跃迁的现象在量子力学中被称为隧道效应，而跃迁形成的电流叫做隧道电流。隧道电流有一种特殊的性质，既对两导体之间的距离非常敏感，如果把距离减少0.1纳米，隧道电流就会增大

28、一个数量级。 STM的优点：1、原子级高分辨率。STM在平行和垂直于样品表面方向的分辨率分别可达0.1nm和0.01nm。2、可实时地得到实空间中表面的三维图像。 3、样品不受损伤，保持完好。4、可在真空、大气、常温等不同环境下工作，甚至可将样品浸在水和其它溶液中，不需要特别的制样技术，对生理状态下的活细胞表面结构也能进行研究。5、扫描速度快，获取数据的时间短，成像快，有可能展开生命过程的动力学研究。局限性:1在STM的恒电流工作模式下，有时它对样品表面微粒之间的某些沟槽不能够准确探测，与此相关的分辨率较差。 2. STM所观察的样品必须具有一定程度的导电性，对于半导体，观测的效果就差于导体；

29、对于绝缘体则根本无法直接观察。如果在样品表面覆盖导电层，则由于导电层的粒度和均匀性等问题又限制了图象对真实表面的分辨率。STM的应用 在纳米范围内，STM已在表面科学、材料科学、生命科学等各个领域获得了广泛应用。 真空、大气和溶液条件下的DNA研究，球蛋白、胶原蛋白及红血球的研究等。STM不仅能够对样品表面进行成像，而且还能在纳米尺度上对材料表面进行刻蚀与修饰。切片法和非切片法切片法（以常用的石蜡切片法为例）：从生物体取出组织，固定，冲洗（从各种固定液取出后），脱水（在逐渐加浓的酒精中）透明，浸蜡透入（用包埋剂），包埋，切片，贴片（粘附切片于载玻片上）、脱蜡，复水（经各级酒精下降至水）、染色与

30、复染，脱水，透明，封藏。非切片法 （以整体封藏法为例）：固定，冲洗（必要时），整体染色，分化与退染，脱水，透明，封藏。切片法;石蜡切片法 冰冻切片法 塑料包埋切片法 半超薄切片法非切片法;整体封藏法； 涂布法与压碎法； 伸展法； 解离法与梳离法石蜡切片的过程;1材料的采集、分割与麻醉 2固定（固定液） 3冲洗、脱水与透明 4 透入与包埋 5切片与贴片 6染色（染料） 7 封藏 （一）植物材料的采集与分割1材料的采集原则： 代表性、完整性、迅速性、非重复性2、材料的分割：一般分割柔软新鲜的叶片时，如果叶片狭窄不超过5毫米时，可沿中肋横切，每片长约3-5毫米。如果叶片比较宽阔时，可分割为许多小片，

31、选择其中含有主脉和侧脉的固定。如固定蕨类及有病叶子时，则需选包含有孢子囊及菌孢的材料。草本植物器官分割时，常切成盘状，再分成许多小块，放在潮湿的纸上等到分割完毕后，立刻放入固定液中。如茎的直径不超过2毫米而其表面又高度角质化，则可切成长约2毫米的小段；如果其表面非角质化而且穿透容易，则可切成10毫米长的小段任何一种圆筒器官，其直径为5毫米时，应将它切成5毫米长；其直径为1厘米时则可将它的厚度切成2-5毫米。直径较大的茎可切成5毫米厚，且可分割一半或14，或分为楔形动物的麻醉与材料的割取一般的组织学切片，要求不太严格，就可将动物先杀死然后取其组织。2、 固定（固定液） 1 目的：保存组织内细胞的

32、形态、结构及其组成，使其与活细胞相似。 2 固定时注意事项：1 所用材料必须新鲜。2 所固定的植物材料，如外面有毛或其他不易穿透的物质存在时，可先在含酒精的溶液中固定几分钟，然后再移入水溶的固定液中。3 如材料固定后不立即下沉，可将其中气泡抽出。4 固定材料体积大小，以不超过直径5毫米为准，材料与固定液的比例，以1：20为准。5 一般固定液以新配的为好，有些混合液需要在使用前才混合。6 材料固定完毕后，必须在容器外贴上标签并随同材料在溶液中投入相应的标签以免相互混淆。 固定液： 单纯固定液 混合固定液 强氧化性 还原性 注意事项三、冲洗、脱水与透明1、冲洗 1）水冲洗法：将固定液倒掉后，材料移

33、入指管并加入半管水，用纱布将管口扎住，倒置在贮水的水槽内，这样就可使指管半沉半浮在水中，经流水冲洗12小时到一昼夜后，就能达到冲洗的目的。2）酒精冲洗法：10：12、脱水脱水剂：乙醇、丙酮，甘油，二氧六环，正丁醇，叔丁醇石蜡溶剂非石蜡溶剂1）乙醇配制下列各级浓度的酒精：15、35、50、70、83、95、100。一般经水洗的材料脱水可自35开始，柔弱的材料自15开始，若用酒精洗涤，则可直接移入50或70酒精中继续脱水。在每级度中停留的时间，依照材料的大小、性质以及留在固定液中的时间长短和固定液溶解性而定。 脱水时应顺序前进，级度不宜相差太大。一般应按上列所配各级浓度进行。比较纤细和柔弱的材料在

34、脱水时，酒精级度还可更靠近些。但也有一些较坚韧的材料可越级进行。脱水时需注意的问题：（1） 在低浓度酒精中每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。（2） 在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则使组织收缩变脆，影响切片。（3）脱水应彻底干净否则与二甲苯混合后，将呈乳白色混浊，虽可倒回重脱，但效果不好。（4）如需过夜应停留在70酒精中。3、透明常用透明剂：二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油、苯胺油、丁香油等。 如脱水不净，用二甲苯透明后将发生什么后果呢？答：如材料内仍留有微量水分二甲苯就进不去，因此石蜡也不能透入，切片后将在蜡片上出现空洞，影响结果。切片内留有微量水分，在封藏以

35、后，就会发生乳白色的云雾状，在显微镜下观察时，可见许多密集水珠把组织掩盖，切片就作废了。应用二甲苯透明时，注意下列几点：二甲苯极易挥发，故在切片透明之后，从染色缸中取出封藏时要敏捷，不宜久置，否则待二甲苯挥发干净后，组织就变硬发白。二甲苯极易吸收空气中的水分，在贮有二甲苯的染色缸的盖子周缘可涂少许凡士林，以防止水分的渗入。在封片时也不宜将口鼻过分靠近切，以免水气侵入，防出现白色云雾状。二甲苯必须保持无水，无酸。若用一二滴石蜡油滴入其中，立即出现云雾状，即表示其中已合有水分不能再用。四、透入与包埋1、透入1）包埋剂和包埋工具 包埋剂：石蜡性质好的石蜡，必须具备下列条件：（1）熔点已知；（2）结构

36、细致、光滑而均匀；（3）无灰尘、水分及挥发性物质等。确定市场销售的石蜡的优劣的方法：石蜡熔化倒入纸匣中凝成蜡块，如品质优良，则具备下列特点：（1）无气泡，无不透明的点子和裂痕；（2）蜡块断裂后，其断裂面不呈颗粒状；（3）如果将它切成薄片不会碎成细粒；（4）放到温度30-35oC中24h后，无气泡及不透明的结晶状小点出现。包埋工具：熔蜡炉 温台 恒温箱 纸盒2） 透入 动物组织: 材料自透明剂中取出后，应先移入透明剂与石蜡等量的混合液中约15-30min，然后进入纯石蜡中，换新鲜石蜡一次。总的石蜡透入时间，按一般标准约1-1.5h。 植物组织：将组织留在透明剂（如二甲苯）中 ；在这种冷的透明剂（

37、亦为石蜡溶剂）上轻轻倒上一层已熔化的石蜡，其分量比例约为3：2；倒入的石蜡即凝成固体，然后将此指管或小杯放在35-37oC之间的熔蜡炉内，经一二天到石蜡不再继续熔化时为止；调节熔蜡炉的温度到56oC，或移入56oC的恒温箱小停留2-5h，换二三次新鲜纯石蜡，使留在组织内的透明剂全部排除后即可包埋。透入过程中需注意的问题：在整个透入期间，一定要保持熔蜡炉或恒温箱的温度恒定，切忌忽高忽低。同时还必须注意下列二点：（1）尽量保持在较低温度中，以石蜡不凝固为度；（2）力求在最短限度时间内完成石蜡透入的过程。温度过高，或时间过长都会引起组织变硬、变脆、收缩等，影响结果。2、 包埋包埋注意事项：五、切片与

38、贴片1、切片1）石蜡块的固着与修整固着：台木修整：（1）使切成的蜡带成一直线，不发生弯曲， （2）每个切片中组织的距离接近，以便于镜检或作连续切片。2）切片机：滑动式切片机 旋转式切片机3）切片刀4）切片的步骤 （1）准备下列用具：毛笔、黑色亮光纸（2）将已固着和整修好的石蜡块和台木装在切片机的夹物部分.（3）安装切片刀，将刀片夹在刀夹上，并调整好刀的角度。（4）移动刀片固定器，使夹刀部与夹物部之间的距离调整好，以石蜡块的表面刚贴近刀口为度，再旋紧切片固定器的螺旋。（5）调整石蜡块与刀口之间的角度与位置。修整蜡块，将刀片移近蜡块，使小蜡块的下边与刀锋平行，如不平行，可调夹物部上的螺旋。然后把它

39、固定，再转下蜡块。只有平整的蜡块，才能切出平整的蜡带。（6）最后根据需要，调整控制切片厚度的基值。调整后，把它固定下来。上述四步骤完成后，就可进行切片，（7）开始切片。右手握旋转轮的手柄，摇动一转就可切下一片，切下的蜡片粘在刀口上，待第二片切下时粘在一起，所以连续摇动就可将切下的蜡片连成一条蜡带。这时左手就可持毛笔将蜡带提起，边摇边移动蜡带。转速为每分钟40-50为宜。（8）切成的蜡带到20-30cm时，即以右手用另一只毛笔轻轻将蜡带挑起，平放在黑电光纸上。靠刀的一面较光滑，应向下，较皱的一面向上。（9）切下的蜡片是否良好，此时应先行检查。（10）切片工作结束后，仍将刀片用具擦拭干净。2、贴片

40、1）用具：烫板 清洁的载玻片 解剖刀 蒸馏水或福尔马林2）贴法：将烫板插上电源或加入温水，温度调整到35oC左右，保持恒定。 在载玻片上涂蛋白甘油。 将已涂蛋白甘油的载玻片放在贮有蜡带的黑纸上，并用滴管加蒸馏水数滴。 用解剖刀或保安刀片将蜡带切成许多小段。 将毛笔上多余的水分挥去，然后以笔尖蘸取已切成段的蜡片，轻轻移到涂有水的载玻片上，依次排列整齐。 将载玻片平平地提起，移到烫板上。此时蜡片因受热而伸展摊平。 已经摊平的切片，可从烫板上取下搁在玻璃棒上，使载玻片稍稍倾斜以便流去多余的水分，或用吸水纸将水分吸去，与此同时还必须将散开的切片重新用解剖针排列整齐。 载玻片再度放在烫板上（或在35oC左右的温箱中）晾干。待2-3h后，即可取下编号，放入切片盒中待染。3）粘片脱落的原因 ：所用的载玻片不清洁。 粘片剂已腐败变质。 粘片时将光滑面向上。 切片厚而小。 组织过硬。 切片皱摺未能充分伸展。 贴片后尚未完全干燥（组织部分呈现白色）。六、染色 种类 按照染料的来源 天然染料：洋红、苏木精、地衣红、靛蓝 人工染料：苯胺、煤焦油染料 按照染料的化学性质 碱性染料：苏木精、结晶紫、番红（核） 酸性染料：伊红、固绿、曙红（质） 中性染料：中性品红、吉姆萨染液 根据染色的对象 细胞核染料：苏木精、结晶紫、孔雀绿 细胞