RNA的生物合成转录后加工和调节实用教案

1、暨南大学药学院1内容(nirng)第四篇 遗传信息的储存、传递和调控16章 DNA的复制及损伤修复(xif)17章 RNA的生物合成、转录后加工和调节18章 蛋白质的生物合成及其加工修饰19章 基因表达的调控20章 重组DNA技术21章 基因诊断与基因治疗第1页/共73页第一页，共74页。暨南大学药学院217章章 RNA的生物合成的生物合成(hchng)、转录后加工、转录后加工和调节和调节第2页/共73页第二页，共74页。暨南大学药学院3第一节第一节 基因转录基因转录(zhun l)的基本性质的基本性质第3页/共73页第三页，共74页。暨南大学药学院4转录(zhun l)与复制的异同相同相同差

2、异差异转录转录复制复制模版模版DNA一条链一条链2条条原料原料核苷三磷酸核苷三磷酸NTPdNTP碱基配对碱基配对遵从碱基配对遵从碱基配对A-U,G-C,T-A聚合酶聚合酶依赖依赖DNA的酶的酶RNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶产物产物多核苷酸链多核苷酸链RNA双链双链DNA特点特点不对称转录不对称转录半保留半不半保留半不连续连续第4页/共73页第四页，共74页。暨南大学药学院5第5页/共73页第五页，共74页。暨南大学药学院6第二节 RNA聚合酶第6页/共73页第六页，共74页。暨南大学药学院7RNA的酶促合成第7页/共73页第七页，共74页。暨南大学药学院8一、原核(yun h)生物的RN

3、A聚合酶 大肠杆菌RNA聚合酶的组成 450kd，5个亚基 2个Alpha亚基参与(cny)全酶的组装及识别启动子 亚基与NTP及新生链结合 亚基与模板DNA结合 亚基辨认转录起始点，延伸阶段与核心酶分离，一种转录辅助因子第8页/共73页第八页，共74页。暨南大学药学院9 因子 原核只有一种RNA聚合酶，但有多种因子 在不同的条件下被表达，并与相应启动子结合 基因( jyn)启动子35和10区的保守序列是其识别位点第9页/共73页第九页，共74页。暨南大学药学院10RNA polymerase in prok. Core EnzymeHolo Enzyme for elongationfor

4、initiation依靠静电作用力依靠静电作用力依靠空间结构依靠空间结构非专一性与非专一性与DNA 结合结合专一性与专一性与 DNA结合结合结合常数；结合常数；1011/mol结合常数；结合常数；1014/mol半衰期；半衰期；60衰期；数小时衰期；数小时cover60bp 第10页/共73页第十页，共74页。暨南大学药学院11基因 产物(chnw) 功能 RNA Pol 的结构(jigu)和功能rpoA 2 亚基(每个40kD)酶的连接(linji)，装配启动子的识别结合某些活化因子rpoB 亚基(160kD)rpoC 亚基(160kD)rpoD 亚基(3290kD)和底物结合催化核心和模板

5、结合和启动子结合识别模板链第11页/共73页第十一页，共74页。暨南大学药学院12原核生物原核生物RNApol (Core) 的结构与功能的结构与功能Enzyme MovementDNA coding strand ( )Rewinding point ()Unwinding point ()RNA binding site RNA/DNA hybrid ()DNA template strand Holo Enzyme 使使 DNA 形成形成10-17bp的解链区的解链区 第12页/共73页第十二页，共74页。暨南大学药学院13 RNA 聚合酶需执行多功能： 识别DNA双链上的启动子； 使D

6、NA在启动子处解链成单链； 通过(tnggu)阅读启动子序列，RNA聚合酶确定它自己的转录方向和模板链； 最后当它达到终止子时，通过(tnggu)识别停止转录 第13页/共73页第十三页，共74页。暨南大学药学院14二、真核生物(shngw)的RNA聚合酶 已发现有3种 对抑制剂鹅膏覃碱的敏感性有差异 转录产物(chnw)不同第14页/共73页第十四页，共74页。暨南大学药学院15 转录何处开始？ 启动子 DNA模板上被RNA聚合酶识别并结合形成(xngchng)转录起始复合物的区段。 原核生物启动子 真核生物启动子第三节 与转录(zhun l)有关的DNA结构第15页/共73页第十五页，共7

7、4页。暨南大学药学院16一、原核(yun h)生物启动子第16页/共73页第十六页，共74页。暨南大学药学院17大肠杆菌启动子的保守序列第17页/共73页第十七页，共74页。暨南大学药学院18 RNA聚合酶I 的启动子 rRNA 45s RNA，再加工成5.8s,18s,28s rRNA， 启动子由核心启动子和上游的调控(dio kn)元件组成二、真核生物(shngw)启动子第18页/共73页第十八页，共74页。暨南大学药学院19 RNA聚合酶II 的启动子 有3处顺式作用元件90的GC盒，70的CAAT盒，30处的TATA盒 转录起点与原核生物相似，大多为A或G mRNA，种类繁杂，启动子多

8、样性，还发现其它(qt)的相关元件。各种元件有不同的组合。 II是最活跃的聚合酶。第19页/共73页第十九页，共74页。暨南大学药学院20真核RNA聚合酶II启动子和增强子通过蛋白质的介导互相结合(jih)，形成环，启动转录第20页/共73页第二十页，共74页。暨南大学药学院21真核启动子含有的各种( zhn)元件和分布第21页/共73页第二十一页，共74页。暨南大学药学院22 RNA聚合酶III的启动子 催化snRNA, tRNA, 5S RNA的转录 需要其它辅助因子共同作用 snRNA启动子与蛋白质基因启动子相似(xin s) tRNA, 5S RNA内部启动子第22页/共73页第二十二

9、页，共74页。暨南大学药学院23真核RNA启动子的基因(jyn)内启动子和基因(jyn)外启动子第23页/共73页第二十三页，共74页。暨南大学药学院24真核启动子不同于原核(yun h)的特点 有多种元件； 结构不恒定； 它们的位置、基序、距离和方向(fngxing)都不完全相同； 有的有远距离的调控元件存在，如增强子、沉默子等； 这些元件常常起到控制转录效率和选择起始位点的作用； 不直接和RNA Pol结合。第24页/共73页第二十四页，共74页。暨南大学药学院25 转录的起始 转录的延伸(ynshn) 转录的终止第四节 转录(zhun l)过程第25页/共73页第二十五页，共74页。暨南

10、大学药学院26转录(zhun l)的起始 原核生物转录(zhun l)的起始 真核生物转录(zhun l)的起始第26页/共73页第二十六页，共74页。暨南大学药学院27原核生物的转录(zhun l)起始 1. 核心酶在因子的参与下与模板的DNA接触，生成非专一的，不稳定的复合物在模板上移动； 2. 起始识别：全酶与模板的启动子结合，产生封闭的“酶-启动子二元复合物”（closed binary complex）； 3. 酶紧密地结合在启动子的-10序列处，模板DNA局部(jb)变性，形成“开放的启动子二元复合体”（open binary complex）； 4. 酶移动到转录起始点上，第一个

11、rNTP转录开始，因子释放，形成酶-启动子-rNTP三元复合体。第27页/共73页第二十七页，共74页。暨南大学药学院28转录(zhun l)的起始第28页/共73页第二十八页，共74页。暨南大学药学院29真核生物的转录(zhun l)起始 每种RNA聚合酶都需要一些(yxi)蛋白质辅助因子，即转录因子，transcription factor（I,II,III类分别对应于聚合酶）转录起始RNA聚合酶I催化的RNA聚合酶II催化的RNA聚合酶III催化的第29页/共73页第二十九页，共74页。暨南大学药学院30RNA聚合酶I催化(cu hu)的起始 转录起始点上游有2个顺式作用元件，核心(hx

12、n)元件core element和上游调控元件UCE。RNA聚合酶I催化的转录需要2种转录因子，上游结合因子UBF和选择性因子1，SL1。SL1有4个亚基，一个是TATA盒结合蛋白TBP,另3个是TBP相关因子TAF。第30页/共73页第三十页，共74页。暨南大学药学院31p342UBF和UCE结合令DNA发生弯曲，使相距上百bp的UCE 和核心元件(yunjin)靠拢，接着SL1和polI相继结合到UBF-DNA复合物上，完成复合物的组建，开始转录。第31页/共73页第三十一页，共74页。暨南大学药学院32 Pre-rRNA Allows RNApol binding complex to

13、initiate RNApol 第32页/共73页第三十二页，共74页。暨南大学药学院33RNA聚合酶II催化(cu hu)的起始转录因子： 需要较多的转录因子参与转录起始复合物的组装：TFII-D与TATA盒结合，如无TFII-A的存在， TFII-D启动子复合物与抑制因子结合。 TFII-A存在时与TFII-D结合成D-A复合物，防止复合物与抑制因子的结合，继而(j r)与TFII-B结合。聚合酶与TFII-F先形成复合物后再结合到DNA上，此时不能启动转录，必须TFII-E和TFII-H/ TFII-J的参与。TFII-H是最后加入的因子，有解旋酶的活性，使起始部位DNA解链。 TFII

14、-H还有蛋白激酶活性，使pol IIC端多个丝氨酸残基磷酸化，这是聚合酶离开起始点继续转录的重要因素。第33页/共73页第三十三页，共74页。暨南大学药学院34真核生物(shngw)的转录RNA Pol 的转录起始第34页/共73页第三十四页，共74页。暨南大学药学院35RNA Pol 的转录起始第35页/共73页第三十五页，共74页。暨南大学药学院36TATA +1 Wilds minor groove TFII A TBP of D pre-TIC TFII F RNApol IITFII B Basic TIC conclusion第36页/共73页第三十六页，共74页。暨南大学药学院3

15、7mRNA Promoter clearance Transcription startingEHJE H B D AJ第37页/共73页第三十七页，共74页。暨南大学药学院38RNA聚合酶III催化(cu hu)的起始 需要3个蛋白质因子(ynz)TFIII-A,B,C。 tRNA基因转录的起始： 在DNA上的调控序列位于起始转录位点的下游，称为内部启动子。有2个调控区，A盒和B盒。 5s RNA基因转录的起始：除了TFIII-B,C外，还需要TFIII-A，首先TFIII-A结合到下游C盒，然后TFIII-C结合到A盒和B盒，继而是类似tRNA的转录第38页/共73页第三十八页，共74页。

16、暨南大学药学院39TFIII C +1 A box B box tDNA TFIIIB TBPBRFB第39页/共73页第三十九页，共74页。暨南大学药学院40TFIIIB allows RNApol III to bindand initiate transcription tRNA RNApolIII +1第40页/共73页第四十页，共74页。暨南大学药学院41 RNApolIIITFIIIC TFIIIA +1 A box C box TFIIIB rRNA 5s pre-rRNA transcription第41页/共73页第四十一页，共74页。暨南大学药学院42转录(zhun l)的

17、延伸 延伸阶段，原核(yun h)和真核比较相近。聚合酶如何向转录起始点下游移动？转录区的模板如何形成局部单链区？第42页/共73页第四十二页，共74页。暨南大学药学院43原核生物的延伸：核苷酸链中的的一个磷酸二酯键形成后， 因子从全酶中解离出来，核心酶沿DNA分子移动。真核生物： RNA聚合酶需要较多的转录(zhun l)因子，起始后酶的移动也靠多种转录(zhun l)因子的共同作用使酶的构象发生改变来实现，如在TFII-H的作用下，polII C端丝氨酸的磷酸化是向下游移动的重要因素。第43页/共73页第四十三页，共74页。暨南大学药学院44转录(zhun l)的延伸延伸时RNA 聚合酶以

18、稳定收缩和突然伸展(shnzhn)的方式在DNA上“爬行”，稳定的收缩是指RNA聚合酶从35bp长连续地收缩到28bp，然后前端又突然向前伸展(shnzhn)8bp,RNA聚合酶又恢复到35 bp长。 第44页/共73页第四十四页，共74页。暨南大学药学院45转录(zhun l)泡p345 在转录延伸的过程中，DNA双链需要解开1020bp，形成的局部单链区象一个小泡 为了保持局部的转录泡状态，在RNA聚合酶下游的DNA需要不断的解链，可使其下游的DNA越缠越紧，形成正超螺旋，而其上游的DNA链变得松弛，产生(chnshng)负超螺旋。解旋酶和拓扑酶可以消除这些螺旋第45页/共73页第四十五页

19、，共74页。暨南大学药学院46 第一个磷酸二酯键的形成是由第一个核苷酸的3OH与第二个核苷酸的5磷酸之间脱水形成的。 第一个核苷酸的5三磷酸保留 在转录局部形成的RNA:DNA杂合双链之间的力比DNA双链的弱，存在(cnzi)A:U配对，延长中的RNA链的5端会被重新形成的DNA双链挤出，使合成中的RNA链的5端游离于转录复合物。第46页/共73页第四十六页，共74页。暨南大学药学院47转录(zhun l)的终止 生物转录的终止处有特殊结构的存在，称为终止子 在原核细胞中有两种不同的终止子，一种是强终止子，另一种是弱终止子。强终止子在体外实验中，无需其他任何因子的帮助就可以终止核心酶，这种终止

20、子被称为内部终止子（intrinsic terminators）。弱终止子需要在一种蛋白质因子（rho factor）的帮助一才能(cinng)终止，所以又称为依赖性终止子（Rho-dependent terminator） 第47页/共73页第四十七页，共74页。暨南大学药学院48强终止子的结构(jigu)强终止子的结构有三个特点：有回文结构存在。由它转录(zhun l)出mRNA可形成茎环结构，可阻止RNA 聚合酶的前进；茎的区域富内含G-C，使茎环不易解开；强终止子3端上有6个U，由于它和模板形成的连续U-A配对较易打开，从而便于释放出RNA。第48页/共73页第四十八页，共74页。暨南

21、大学药学院49弱终止子的结构(jigu)它也可形成茎环结构，但在茎中的含量少，茎环易打开。在其3端也没有寡聚U，因此RNA 聚合酶合成此段RNA后，由于茎环的存在(cnzi)可使聚合酶暂停一下，若此时因子追上来和聚合酶结合，那么转录即可终止，若无因子聚合酶还可越过终止进行“通读”。第49页/共73页第四十九页，共74页。暨南大学药学院50RNA聚合酶转录mRNA 因 子 附 着 到mRNA识别位点因子在RNA聚合 酶 后 面 沿mRNA移动RNA聚合酶在终止位点停留，因子赶上了聚合酶在转录泡中因子解开DNA-RNA杂合链终止RNA聚合酶，因子和RNA被释放在原核mRNA转录中依赖性终止(zhn

22、gzh)机制第50页/共73页第五十页，共74页。暨南大学药学院51依赖性终止子，其共同特点是C丰富(fngf)，G缺乏第51页/共73页第五十一页，共74页。暨南大学药学院52RNA聚合酶转录出mRNA后核糖体结合(jih)到mRNA上核糖体在突变位点解离因子追上了RNA聚合酶转录提前终止无义突变时因子(ynz)可能使转录提前终止第52页/共73页第五十二页，共74页。暨南大学药学院53原核转录(zhun l)的过程第53页/共73页第五十三页，共74页。暨南大学药学院54真核生物转录(zhun l)的终止 机制了解不多，且3种聚合酶的转录终止不完全相同。 RNA聚合酶I催化的转录有18bp

23、的终止子序列，可被辅助因子(ynz)识别。RNA聚合酶II和III催化转录的终止子，可能有与原核生物不依赖因子(ynz)的终止子相似的结构和终止机制，即有GC的茎环结构和连续的U。 由于成熟的mRNA3端已被切除了一段，并加入了polyA尾巴，具体的转录终止点目前尚未认识。第54页/共73页第五十四页，共74页。暨南大学药学院55真核生物(shngw)的转录终止爪蟾rDNA的转录终止位点真核生物的RNA大部分都要经过加工，包括剪切和加上poly(A)，因此对于其终止的情况了解很少，只有少数的例子搞得比较清楚。前体RNA转录的终止是随着组织的变化而变化。例如在爪蟾中有两个重要的转录终止位点：T2

24、和T3。T2是28SrRNA序列3末端(m dun)下游约235bp序列。T3是排列在下一个转录单位的上游约200bp处。T2和T3都含有7个碱基的保守序列：5-GACTTGC-3。T2是前体rRNA转录的初始终止位点。T3是作为“失败-保险”的终止位点，由于rDNA转录单位是串联排列的，所以“失败-保险”终止系统让RNA Pol分子可能在一个转录单位上起始和转录。 第55页/共73页第五十五页，共74页。暨南大学药学院56第五节 RNA转录(zhun l)后加工 原核(yun h)生物RNA转录后的加工 mRNA转录后的加工 rRNA转录后的加工 tRNA转录后的加工 真核生物RNA转录后的

25、加工 rRNA转录后的加工 tRNA转录后的加工 mRNA转录后的加工第56页/共73页第五十六页，共74页。暨南大学药学院57原核生物(shngw)RNA转录后的加工mRNA的加工：mRNA转录(zhun l)产物，一般无需加工即具有活性，可作为翻译的模板。但近年也发现要添加3polyA的现象。tRNA, rRNA的加工修饰较多。rRNA的加工：rRNA基因常与一些tRNA基因混合组成一个操纵子，呈有序排列。RNA酶III对其转录(zhun l)产物进行切割，其产物还需再加工才成为成熟的rRNA，具体机制不明。第57页/共73页第五十七页，共74页。暨南大学药学院58原核生物(shngw)R

26、NA转录后的加工tRNA的加工：原核生物tRNA的初始(ch sh)转录产物有几种形式，1、与rRNA相连；2、相同的几个拷贝连在一起；3、不相同的几个连在一起。要经过多个加工程序才能成为成熟的tRNA。参与tRNA加工的酶类有多种包括：RNA酶III，RNA酶D，RNA酶P，tRNA核苷酸转移酶第58页/共73页第五十八页，共74页。暨南大学药学院59真核生物(shngw)RNA转录后的加工rRNA的加工：有5s，18s，28s四种，其中，18s，28s 是由RNA聚合酶I催化一个转录单位（中度重复序列），产生45s rRNA前体，rRNA转录后加工包括前体rRNA与蛋白质结合，然后再切割和

27、甲基化。转录在核仁进行，新生的前体迅速与蛋白质结合成前体核糖体颗粒，然后，其中的RNA经一系列切割先产生18s rRNA，该RNA与蛋白质组成(z chn)核糖体的小亚基。余下的部分再拼接成5.8S, 28S rRNA。前体rRNA的切割在特殊序列位点，可能是由核仁小RNA(snoRNA)催化。前体rRNA还接受蛋氨酸提供的甲基被甲基化，在切割加工后，甲基化仍保留，甲基化的位点在脊椎动物中是高度保守的。5sRNA 在核质中转录无需加工进入核仁与28s，5.8s rRNA及蛋白质一起组成核糖体的大亚基，以大亚基的形式(xngsh)通过核孔进入胞浆。 第59页/共73页第五十九页，共74页。暨南大

28、学药学院60真核生物RNA转录(zhun l)后的加工tRNA的加工：包括切除和碱基修饰，有些需要剪接。所有tRNA5端比成熟tRNA多一段序列(xli)，由RNaseP切除。有些tRNA基因在反密码环处含有内含子，剪接加工与前体mRNA的加工有所不同：在内含子两端切割去除内含子后将外显子连接，没有转酯反应。第60页/共73页第六十页，共74页。暨南大学药学院61真核生物mRNA转录(zhun l)后加工 RNA聚合酶II催化转录，初始产物为核不均一RNA(hnRNA)，新生的hnRNA从开始形成到转录终止，就逐步与蛋白质形成不均一核糖核蛋白颗粒，前体mRNA加工( ji gng)的顺序是形成

29、5帽子结构、内切酶去除3端序列、polyA聚合酶催化形成尾巴；剪接取出内含子变成成熟的mRNA第61页/共73页第六十一页，共74页。暨南大学药学院625帽的形成(xngchng) P348 经鸟苷酰转移酶催化与另一个经鸟苷酰转移酶催化与另一个GTP作用作用 在鸟嘌呤在鸟嘌呤7甲基转移酶作用下，以甲基转移酶作用下，以S-腺苷蛋腺苷蛋氨酸为甲基来源氨酸为甲基来源 再经再经2甲基转移酶催化甲基转移酶催化 5帽子帽子(mo zi)的类型的类型第62页/共73页第六十二页，共74页。暨南大学药学院63前mRNA3端切除(qich)及加polyA尾 除组蛋白的mRNA外，真核生物所有的mRNA都有3po

30、lyA尾。polyA上游1035bp有AAUAAA序列(xli)，下游约50bp有富含GU序列(xli)，这2处序列(xli)是剪切和加尾所需的信号。第63页/共73页第六十三页，共74页。暨南大学药学院64mRNA的剪接(jinji) 剪接splicing 几乎所有真核生物(shngw)的核前体mRNA都有特征的GU/AG序列，称为GU-AG规则。内含子离3剪切点2050bp范围内有一个A也是不变的，称为分支点。分支点附近也有保守序列。第64页/共73页第六十四页，共74页。暨南大学药学院65剪接(jinji)过程p350 由核小RNA与蛋白质组成的核小核糖核蛋白与内含子结合，通过snRNA

31、中的U1snRNA与5剪接点互补结合，U2snRNA与内含子分支点序列互补，以及snRNP之间的相互作用，内含子折叠，使内含子两侧的外显子靠近，利于剪接反应(fnyng)的进行。 剪接反应(fnyng)通过2次转酯，释放出套索状结构的第一内含子。第65页/共73页第六十五页，共74页。暨南大学药学院66 核mRNA从核内转运(zhun yn)至胞浆 mRNA在胞浆中的定位 胞浆中mRNA的稳定性第六节 mRNA的转运(zhun yn)及其在胞浆中的定位、稳定性第66页/共73页第六十六页，共74页。暨南大学药学院67核mRNA从核内转运(zhun yn)至胞浆 前体mRNA（hnRNA）的加工在核内特定的亚核结构（核基质）中进行。随着新合成的mRNA链延长，不断有hnRNP结合到链上，同时形成剪接( jinji)体。加工成熟后，去除剪接( jinji)的蛋白质，但有不少蛋白质结合，形成信使核糖核蛋白mRNP，成熟mRNA以mRNP