CRISPR基因编辑技术PPT学习教案

1、会计学1CRISPR基因编辑技术基因编辑技术 1973 1973年，斯坦利年，斯坦利NN科恩科恩(Stanley N. Cohen)(Stanley N. Cohen)和赫伯特和赫伯特WW博耶博耶(Herbert W. Boyer)(Herbert W. Boyer) 成功将蛙的成功将蛙的DNADNA插入到细菌中。插入到细菌中。 20 20世纪世纪7070年代，基因泰克年代，基因泰克(Genetech)(Genetech)公司对大肠杆菌进行基因改造，使其带有一个人源基因公司对大肠杆菌进行基因改造，使其带有一个人源基因( (这个基因是人工合成的这个基因是人工合成的) )，最后生产出治疗糖尿病的胰

2、岛素。，最后生产出治疗糖尿病的胰岛素。 19741974年，加利福尼亚州索克生物研究所年，加利福尼亚州索克生物研究所(Salk Institute for Biological Studies)(Salk Institute for Biological Studies)的的Rudolf JaenischRudolf Jaenisch通过将通过将SV40 SV40 病毒的病毒的DNADNA注射到小鼠的囊胚中注射到小鼠的囊胚中, ,培育出了第一只转基因小鼠。培育出了第一只转基因小鼠。基因突变技术：物理诱变、化学诱变基因突变技术：物理诱变、化学诱变转基因技术：转基因技术：T-DNAT-DNA插入插

3、入RNARNA干扰技术：干扰技术：dsRNAdsRNA、Artificial miRNAArtificial miRNA核外遗传技术：质粒、人工染色体核外遗传技术：质粒、人工染色体同源重组技术：同源重组技术：e.g. e.g. 传统的基因敲除小鼠传统的基因敲除小鼠1.1. 无法控制突变位点无法控制突变位点2.2. 不能精确控制外源基因插入位点不能精确控制外源基因插入位点3.3. 对靶基因抑制不彻底、不特异对靶基因抑制不彻底、不特异4.4. 难以稳定的遗传难以稳定的遗传5.5. 费时费力费钱，难以大量应用费时费力费钱，难以大量应用并引起一系列生物伦理的问题并引起一系列生物伦理的问题现现 状状历史

4、历史p 1993年前ZFN就已开始出现，迄今已发展了20多年才有今天的成就；p 2009年底出现的TALEN似乎一夜之间呈现出取代ZFN的架势；p 2012年底CRISPR/Cas已显现出取代TALEN的巨大潜力，在2013年成为现实。荣誉荣誉1. 2011年：ZFN， TALEN和Meganuclease2011年度方法（Nature Methods）2. 2012年：TALEN 2012年十大突破（Science）3. 2013年：CRISPR/Cas被认为是诺贝尔奖级别的成果，华人科学家张峰已因此获得生物医学大奖。应用应用p 基因组巡航导弹，分子剪刀，DNA外科医生p 定点突变，定点修饰

5、（包括得到转基因），转录调控p 基因治疗（如遗传病）特异性特异性DNA识别域识别域非特异性非特异性核酸内切酶核酸内切酶+89核酸内切酶：核酸内切酶： 非特异性核酸内切酶非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时形成二聚体时切割双链切割双链DNA 两条两条ZFN之间具有被称为之间具有被称为“间隔区间隔区”的的spacer结构，该结构的长度以结构，该结构的长度以56bp为宜，为宜，7bp也能正常工作，合理的也能正常工作，合理的“间隔区间隔区”设计才能保证设计才能保证ZFN二聚体拥有最佳的工作空间。二聚体拥有最佳的工作空间。全长为全长为34aa的的Tal 蛋白的第蛋白的第12、13位氨基残基可以特异性

6、识别核苷酸碱基位氨基残基可以特异性识别核苷酸碱基。 NG可以识别可以识别T HD可以识别可以识别C NI可以识别可以识别A NN可以识别可以识别G或或A通过这种特异性识别，将多个通过这种特异性识别，将多个Tal蛋白组装在一起，就可以构成可以识别目的片段的蛋白组装在一起，就可以构成可以识别目的片段的Tale蛋白。蛋白。TALEN原理原理TALENTALEN的特异性打靶的原理：的特异性打靶的原理：一对可以特异性识别靶基因的一对可以特异性识别靶基因的TALETALE，定位到需要编辑的基因组区域；，定位到需要编辑的基因组区域；然后非特异性核酸内切酶然后非特异性核酸内切酶FokIFokI切断双链切断双链

7、DNADNA从而造成从而造成DNADNA双链断裂（双链断裂（double-strand breakdouble-strand break，DSBDSB）；）；再通过再通过DNADNA的自我修复，引起碱基的缺失或突变，从而引起基因突变。的自我修复，引起碱基的缺失或突变，从而引起基因突变。FokIFokI只有在形成二聚体的时候才有内切酶活性。只有在形成二聚体的时候才有内切酶活性。TALEN原理原理CRISPR/Cas 9 背景背景 CRISPR是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自

8、己的基因整合到细菌内，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，到细菌内，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出很多成簇细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列的、规律间隔的短回文重复序列( (既既CRISPR序列序列) )和和CRISPR相关基因，这一序列首先由日本学者于相关基因，这一序列首先由日本学者于1987年年首次发现首次发现(1)，于，于2002年被年被Jansen等将正式命名等将正式命名(。CRISPR/Cas 9 背景背景CRISPR/Cas 9概述概述CRISPR-Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由：

9、一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指指导导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。蛋白对靶向基因进行修饰的技术。CasCas蛋白是一种双链蛋白是一种双链DNADNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNAguide RNA引导下对靶位点进行切割。它引导下对靶位点进行切割。它与与folkfolk酶功能类似，但是它并不需要形酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。成二聚体才能发挥作用。CRISPR/Cas系统的基本结构系统的基本结构识别作用识别作用切割作用切割作用 CRISPR系统通常包括：由不连续的重复序列（系统通常包括：由不连续的重复序列（repeats，R）与长度相似的间区序列（与长

10、度相似的间区序列（spacers，S）间隔排列而成的）间隔排列而成的CRISPRCRISPR簇，前导序列簇，前导序列( (leader，L)以及一系列的以及一系列的CRISPR相关蛋白基因相关蛋白基因(cas)(cas)。 Cas（CRISPR associated）：存在于）：存在于CRISPR位点附近，是位点附近，是一种双链一种双链DNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切引导下对靶位点进行切割。它不需要形成二聚体才能发挥作用。割。它不需要形成二聚体才能发挥作用。CRISPR的转录与加工的转录与加工CRISPR簇首先转录成长的转录体，即（簇首先转录成长的转录体，即

11、（crRNA），然后），然后逐步被加工成小的逐步被加工成小的 crRNA。CRISPR/Cas 9作用机理作用机理CRISPR/Cas 9作用机理作用机理PAM（NGG序列）序列）CRISPR/Cas 9系统靶向要求系统靶向要求最主要的要求：最主要的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）为）为NGG。在人。在人类基因组中，平均每类基因组中，平均每8bp就出现一个就出现一个NGG PAM。CRISPR/Cas 9基因编辑实验流程图基因编辑实验流程图CRISPR/Cas 9的技术应用的技术应用应用于基因的敲除、敲入以及基因沉默、激活等。应用于基因的敲除、敲入以及基因沉

12、默、激活等。能够在真核细胞中发挥作用，使真核基因组中的能够在真核细胞中发挥作用，使真核基因组中的特异性位点发生双链断裂。特异性位点发生双链断裂。在模式生物中的应用在模式生物中的应用: :成功地对线虫成功地对线虫( (左左) )、斑马鱼胚胎（中）和果蝇进行遗传学改斑马鱼胚胎（中）和果蝇进行遗传学改造，获得更粗短的线虫，腹部组织体积造，获得更粗短的线虫，腹部组织体积更大的斑马鱼胚胎，和眼睛颜色更深的更大的斑马鱼胚胎，和眼睛颜色更深的果蝇，表明果蝇，表明CRISPR技术在动物基因改造技术在动物基因改造方面有巨大应用潜力。方面有巨大应用潜力。中国科学院遗传中国科学院遗传所高彩霞团队：所高彩霞团队：成功

13、地使三种水成功地使三种水稻基因失活。稻基因失活。近日，中国科学家利用基因编辑技术CRISPR/Cas9，对抑制狗骨骼肌生长的基因（MSTN）进行了敲除，培育出两只肌肉发达的“大力神”狗，成功构建了世界首个基因敲除狗模型。CRISPR/Cas 9的技术应用的技术应用三大基因修饰技术比较三大基因修饰技术比较CRISPR/Cas 9系统的优势系统的优势操作简单，靶向精确性更高。操作简单，靶向精确性更高。sgRNA靶向序列和基因组序列靶向序列和基因组序列必须完全匹配，必须完全匹配，Cas9才会对才会对DNA进行剪切。编码进行剪切。编码sgRNA 的的序列不超过序列不超过100bp，因此比构建，因此比构

14、建TALENs和和ZENs更简单方便，更简单方便，用于用于CRISPR的的sgRNA识别序列仅需识别序列仅需2020个核苷酸。个核苷酸。CRISPR/Cas9系统是由系统是由RNA调控的对调控的对DNA的修饰，其基因的修饰，其基因修饰可遗传。修饰可遗传。基因修饰率高，基因修饰率高，CRISPRs基因敲入的效率为基因敲入的效率为51%-79%，TALENs的效率为的效率为0%-34%。基因调控方式多样，例如敲除、插入、抑制、激活等基因调控方式多样，例如敲除、插入、抑制、激活等无物种限制无物种限制, ,可实现对靶基因多个位点同时敲除。可实现对靶基因多个位点同时敲除。实验周期短，最快仅需实验周期短，

15、最快仅需2个月，节省大量时间和成本。个月，节省大量时间和成本。(ZFNS(ZFNS一个靶点成本一个靶点成本60006000) )CRISPR/Cas 9系统的评价系统的评价参考文献：参考文献：1 Y. Ishino, H. Shinagawa, K. Makino, M. Amemura, A. Nakata, Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of bacteriology 169, 5429-5433 (1987).2 R. Jansen, J. D. A. v. Embden, W. Gaastra, L. M. Schouls, Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Molecu