纤维素乙醇发酵--全

1、纤维素乙醇纤维素乙醇发酵发酵 汪吴 2010001265 邓玲玲 2010001289 张欣 2010001290 张忆雪 2010001291 随着化石能源的渐趋枯竭 粮食危机的不断出现 能源需求不断加大和油价持续上升等因素的影响 人们越来越认识到寻求清洁、可再生能源的迫切性。因此，越来越多的国家已将生物质能源产业作为一项重大的国家战略推进，纷纷投入巨资进行生物质能源的研发。研究背景研究背景第二代生物燃料第二代生物燃料 第二代生物燃料以秸秆、草和碎木等农业废弃物或非粮作物为主要原料，又被称为纤维素乙醇，或非粮生物燃料。与第一代生物燃料对比与第一代生物燃料对比u 首先，汽车发动机不需要改造就可

2、以直接使用掺入了生物乙醇的汽油或柴油；u 其次，生产第二代生物乙醇的催化酶技术未来几年成本还将快速下降，大规模工业生产的可行性非常强；u 第三，秸秆等纤维素类农业废弃物大量存在，比如中国每年农业生产大约产生7亿吨秸秆，供给非常充足。我国纤维素乙醇产业化发展现状我国纤维素乙醇产业化发展现状 河南天冠集团2006年6月26日，河南天冠集团建成投产了我国首条秸秆乙醇中试生产线，标志着我国在生物质能源利用领域已跻身世界行列。目前，在河南天冠集团，一条年产300t乙醇的中试生产线已建成投产，6t麦秸可变成1t乙醇。 上海华东理工大学能源化工系，承担国家863项目的“农林废弃物制取燃料乙醇技术”研究，近年

3、已进入工业性试验阶段。已建成年产燃料乙醇600t的示范工厂，接下来的问题就是如何产业化。国家科技支撑计划国家科技支撑计划秸秆乙醇关键技术研究及产业化示范项目已于2008年6月上旬获得科技部批复，列入“十一五”国家科技支撑计划组织实施。中国科学院于2007 年12月中旬启动“纤维素乙醇的高温发酵和生物炼制”重大项目。国外纤维素乙醇产业化发展现状国外纤维素乙醇产业化发展现状USA 世界的前列 1998.10第一家商业性转化纤维质酒精的工厂由BC International开始，以蔗渣和稻壳为原料，年产酒精20106加仑，成本为0.24-0.34.此外加利福尼亚和纽约城市垃圾生产酒精正在建设中CAN

4、ADA Iogen 使用麦秆和其他废弃物为原料，稀酸结合蒸汽气爆预处理技术，年产32万升乙醇 SunOpta公司采用稻草、玉米秸秆、甘蔗渣等为原料生产各种生物转化产品，如纤维质乙醇、纤维质丁醇、木糖醇和膳食纤维等。技术是高压下连续气爆处理生物质，每小时处理原料500kg日本 全国每年有1000万t废木屑，不少企业利用自行开发的技术或引进美国技术开展了以废木屑为原料生产燃料乙醇的工业试验。2003年5月投资5亿日元建成工试，目前日产乙醇2.50t。试成后拟建200t/d的商用装置，成本目标为25日元/L，将低于美国现有水平。 EUROPE Abengoa 是欧洲最大的乙醇生产厂，同时也是世界排名

5、第二的生产厂家，是以小麦秸秆为原料生产乙醇的瑞典生产商。目前，Abengoa 正努力建两个生物质乙醇厂，一个在西班牙，一个在美国，两个都在施工过程中，他们的目标是在2011年前使该技术商业化。瑞典Etek中试乙醇厂日产量400500升乙醇，每日需要消耗锯末或其他纤维质原料2t(以干物质计)。纤维素乙醇产业化亟待解决的关键技术纤维素乙醇产业化亟待解决的关键技术1 原料分散，季节性强，难以收集、运输，增加了成本2 原料需进行复杂的预处理 3 纤维素酶的生产效率低、成本较高4 构建能高效利用五碳糖和六碳糖的菌种国内外预处理方法的研究动态国内外预处理方法的研究动态物理化学结合法化学法物理法生物法物理法

6、液态热水法微波和超声波处理冷冻粉碎机械粉碎法化学法酸法碱法有机溶剂法蒸汽爆破法SO2爆破法CO2爆破法氨纤维爆破法纤维素酶的生产和纤维素水解技术研究纤维素酶的生产和纤维素水解技术研究u纤维素酶高产菌种的筛选和诱变育种纤维素酶高产菌种的筛选和诱变育种目前，用于生产纤维素酶的微生物大多属于真菌。研究得较多的有木霉属、曲霉属、青霉属等。其中木霉、青霉产生的纤维素酶活力往往最高，酶组分最全。因而应用也最广泛。曲霉和根霉产生的主要是内切型纤维素酶，多用于纺织和造纸等纤维的表面加工。u纤维素酶生产技术纤维素酶生产技术纤维素酶的生产可采用液体培养和固体培养两类方法。我国采用的固体培养方法包括薄层的曲盘培养、

7、帘子培养和厚层的通风培养等。生产上常用的是厚层通风培养，亦称厚层通风曲或箱曲，设备比较简单，易于推广，但容易污染杂菌，温度和湿度不易控制，大规模生产难于稳定。在美国能源部的支持下，杰能科(Genencor International)和诺维信(Novozymes AS)两家酶制剂公司加大了研究力度，努力增加酶活和降低生产成本，取得了引人注目的结果。诺维信鉴定出多种新酶，配制成新的复合酶制剂，提高了酶系的降解能力，结合NREL预处理技术的进步，使玉米秸产乙醇用酶的成本降至原来的130，从2001年的每加仑5美元到2005年的每加仑1018美分。通过技术进步，杰能科的酶成本也降至原成本的130。美

8、国能源部认为酶处理成本已不再是产业化的主要障碍。乙醇发酵菌种选育及发酵过程调控汪吴理想的生物质乙醇发酵菌应能发酵所有生物质来源的糖，具有对木素单体、乙酸和其它抑制性副产物的良好抗性，并同纤维素完全水解所需的纤维素酶有协同作用。一、纤维素乙醇发酵菌种选育从自然界中筛选戊糖发酵菌种诱变育种采用原生质体融合技术基因工程在菌种选育上的应用木糖发酵菌株选育方法优点：简单易行，可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量等目的。 缺点：效率低、进展慢，很难使生产水平大幅度提高。自然筛选诱变育种l 化学诱变剂:硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍 (NTG)、亚硝酸(NA)、氮芥(NM)、羟胺等l 物理诱变

9、剂:如紫外线、X-射线、-射线、快中子、超声波等 营养缺陷型菌株的筛选抗性突变株的筛选温度敏感突变型筛选抗反馈调节突变株的筛选组成型突变株的筛选诱变育种实例樊梓鸾对热带假丝酵母2.402进行紫外诱变，通过初筛、复筛，获得一株耐酸耐乙醇的酵母菌株UV2。在pH3.5和10乙醇的培养基中，表现出良好的发酵性能。在此条件下进行乙醇发酵试验，乙醇转化率可达0.329g/g底物，同时诱变菌株与出发菌株相比，乙醇转化率提高了28.57%。连续传代10次发酵性能无明显变化，表明菌株具有一定的遗传稳定性。原生质体融合育种是杂交育种（基因重组）育种的一种特殊方式目前已经实现了树干毕赤酵母与酿酒酵母的属间原生质体

10、融合。融合子能发酵木糖产生酒精，其耐酒精的性能也比亲株有所提高。原生质体融合基因工程育种菌株改造策略天然底物利用策略从能够利用广泛底物的微生物出发，利用其本来就有的木糖、阿拉伯糖利用能力，通过基因工程技术改善其产物的选择性及其它同合成产物相关的特性。重组菌底物利用策略则从已有很高产物选择性和其它产物合成特性的乙醇发酵菌株出发，通过代谢工程手段赋予其利用戊糖发酵的能力。大肠杆菌等能有效地利用木质纤维素材料的所有糖组分，对乙醇也有一定耐性(高于50 g/L)。但通常乙醇只是这些大肠杆菌产生的众多产物之一。乙醇高产的关键在于丙酮酸脱羧酶(PDC)、醇脱氢酶(ADH)系统。有人将运动发酵单胞菌编码PD

11、C和ADH的基因(pdc和adhb)构建成称为PET的人造操纵子，用质粒转化大肠杆菌，并实现了高表达，从而将丙酮酸代谢导向产生乙醇。天然底物利用策略美国国家可再生能源实验室(NREL)的张敏等利用复杂的克隆技术，构建了带有两个独立操纵子的杂合穿梭质粒(pzB5)，分别编码大肠杆菌的xylA和xylB基因，以及转酮酶(tktA)转醛酶(tal)基因，成功地转化了运动发酵单胞菌CP4菌株。重组菌利用木糖作为唯一碳源生长，能有效地转化理论得率82%87%的木糖和葡萄糖为乙醇。重组菌底物利用策略樊梓鸾研究了高产乙醇酵母菌株的诱变育种筛选产乙醇能力强的出发菌株 细胞悬浮液的制备 紫外照射 绘制致死曲线，

12、确定最大正突变的照射剂量 挑选菌株影印培养 初筛 复筛 发酵试验 菌株稳定性实验 。高产乙醇菌种选育供试菌种：南阳酵母2.606(Saccharomyces cerevisiae)，热带假丝酵母2.637(Candida tropicalis)，热带假丝酵母2.402(Candida tropicalis)YEPD液体培养基:酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L 、葡萄糖20g/L 。利用杜氏管测定三种酵母在葡萄糖发酵培养基和混合糖发酵培养基中的呼吸情况，从而确定菌株生产乙醇的能力A:筛选产乙醇能力强的出发菌株选取热带假丝酵母2.402为出发菌株B:紫外诱变诱变剂量的选择最佳诱变时间为30s，致

13、死率为80.30%C:酵母菌一级筛选（TTC法）TTC是(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)一种显色剂，它能对酵母的代谢产物发生呈色反应，通过它可以判断酵母中呼吸酶活力的大小，即酵母产乙醇能力的高低。得到25株酵母菌，随机编号UV1UV25诱变后菌株TTC下层平板比较菌落颜色影印平板30，24h倒入TTC上层培养基30，23hD:酵母菌二级筛选（杜氏小管法）（1）酵母代谢木糖和葡萄糖混合糖的驯化实验14株（2）酵母耐酸试验8株（3）酵母耐乙醇试验E: 酵母菌三级筛选(C02失重法)以UV2号菌株为最终发酵用菌株。F: 糖浓度对乙醇产率的影响G: 诱变菌株UV2的遗传稳定性试验小结：从优良稳定的南阳

14、酵母2.606，热带假丝酵母2.637和2.402中筛选出可同时糖化五碳糖和六碳糖，且乙醇产率较高的热带假丝酵母2.402进行紫外诱变，通过初筛、复筛，获得一株耐酸耐乙醇的酵母菌株。在pH3.5和10%乙醇的培养基中，表现出良好的发酵性能。在此条件下进行乙醇发酵试验，乙醇转化率可达0.329g/g底物，同时诱变菌株与出发菌株相比，乙醇转化率提高了28.57%。连续传代10次发酵性能无明显变化，表明菌株具有一定的遗传稳定性。纤维素糖化发酵工艺纤维素糖化发酵工艺同步糖化共发酵法（SSCF)微生物直接转换法（CBP)同步糖化发酵法（SSF)分批补料技术和纤维素-淀粉共发酵水解发酵二段法（SHF)定义

15、：将纤维素先用纤维素酶糖化，再经酵母发酵成酒精的方法。优点：可以分别使用水解和发酵各自的最适条件(分别为50和30)。缺点：酶水解产生的产物(纤维二糖和葡萄糖)会反馈抑制水解反应水解发酵二段法（separate hydrolysis and fermentation , SHF）SHF方法的改进Ghose等将高产菌株绿色木霉QM9123的纤维素酶浓缩58倍，加入30%研磨的木质纤维素悬浮液，在反应器内连续糖化，将生成的葡萄糖通过超过滤膜分离出去，从而消除产物抑制，提高了反应速度，流出液的葡萄糖浓度达10%以上。但膜技术产业化有一定困难。纤维素酶水解和菌体酒精发酵同时进行的方法。优点：在加入纤维

16、素酶的同时接种酒精发酵的酵母，可使生成的葡萄糖立即被酵母发酵成酒精；去除了产物抑制，就可以不妨碍纤维素糖化的继续进行，酒精得率可明显提高。关键：选择最适的酵母，酶解的最适温度约为50，而普通酿酒的最适发酵温度通常约30。同步糖化发酵(simultaneous saccharification and fermentation, SSF)SSF实例彭林才等人以卫生纸厂初级污泥作为生物质原料，采用同步糖化发酵法生产燃料乙醇，经过条件优化乙醇质量浓度达19.5g/L，是理论值的63.9%。同步糖化共发酵(simultanenous saccharification and cofermentatio

17、n, SSCF )利用能同时发酵戊糖和己糖的稳定的基因重组菌株进行同步共发酵。实例：在中试条件下，经过稀酸预处理的玉米纤维在总固体物浓度为20%、纤维素酶用量为10 IFPU/g纤维素、30、150 rpm、pH 5.0条件下，使用普度大学构建的重组酵母LNH-ST菌株进行同步糖化共发酵4天，78.4%的可用葡萄糖和56.1%的可用木糖被转化成乙醇。微生物直接转化法(consolidated bioprocessing,CBP)纤维素酶的生成和乙醇发酵由一种微生物或一个微生物群体来实施。CBP需要的菌株可以通过代谢途径工程方法构建。实例1：Ingram等将欧文氏菌(Erwinia)的两种内切葡

18、聚糖酶的基因克隆到能生产乙醇的克雷伯氏菌(Klebsiella)中，使该菌配合真菌纤维素酶发酵纤维素产生的乙醇增加了22%。CPB实例2粗糙脉胞菌AS31602发酵生产乙醇粳糙脉孢菌(Neurospora crassa)AS3.1602具有同时产生纤维素酶、半纤维素酶、发酵葡萄糖和木糖的能力。张志华对N.crassa AS 3.1602好氧产酶和厌氧直接发酵纤维素产生乙醇的过程进行了代谢分析。以20 g/L的微晶纤维素为碳源进行产酶培养，好氧发酵3 d时，菌体处于稳定期，FPA酶活、CMC酶活、-葡萄糖苷酶酶活和木聚糖酶酶活都处于较高水平。厌氧条件下直接转化20 g/L的微晶纤维素，发酵96

19、h时乙醇浓度可以达到6.3 g/L，仅检测到少量副产物乳酸和乙酸。分批补料技术和纤维素一淀粉共发酵山东大学利用造纸厂废水中回收的细杂纤维进行的酶解产酒精实验显示，使用15 FPA IU/g纤维素的纤维素酶，起始纤维废渣浓度10g/100 ml(已呈半固态，没有多少游离水)，酒醪的酒度也只能达到2.5%2.7%(V/W)。在36 h时补加10 g纤维废渣，不要再加纤维素酶，就可继续发酵。最终酒度可以达到5%(V/W)左右。发酵过程调控对于不同的发酵工艺，其具体影响因素不同，影响发酵过程的主要因素有：A. 发酵温度B. 发酵时间C. 纤维素酶用量D. 菌种接种量E. 菌液浓度F. 底物浓度实例1：

20、SSF纤维素转化乙醇最佳工艺参数确定单因素实验结果正交实验结果在最优条件下，乙醇转化率可达0.368g/g底物，比优化前的乙醇转化率提高了10.60%，较出发菌株提高了36.14%。纤维素发酵生产乙醇工艺示意图 葡萄糖发酵途径葡萄糖发酵途径EMPEMP、HMPHMP、EDED和和PKPK 由葡萄糖到形成丙酮酸的一系列反应称糖酵解，又称EMP途径。糖酵解作用一般在无氧情况下进行，故又称无氧分解。 用酵母使糖变为乙醇的工程称为生醇发酵。酵母等能使丙酮酸脱羧成乙醛，乙醛在醇脱氢酶催化下被NADH还原成乙醇。 该过程只在pH3.54.5以及厌氧的条件下发生。当发酵液处在碱性条件下，酵母的乙醇发酵会改为

21、甘油发酵。原因：该条件下产生的乙醛不能作为正常受氢体，结果2分子乙醛间发生歧化反应，生成1分子乙醇和1分子乙酸；CH3CHO+H2O+NAD+ CH3COOH+NADH+H+CH3CHO+NADH+H+ CH3CH2OH+ NAD+ 此时也由磷酸二羟丙酮担任受氢体接受3-磷酸甘油醛脱下的氢而生成 -磷酸甘油，后者经-磷酸甘油酯酶催化，生成甘油。2葡萄糖葡萄糖 2甘油甘油+乙醇乙醇+乙酸乙酸+2CO2戊糖磷酸途径（戊糖磷酸途径（HMSHMS），约有），约有30%30%的葡萄糖可能由此途径进行的葡萄糖可能由此途径进行氧化。氧化。ED途径途径是少数缺乏完整EMP的微生物具有的一种替代途径。关键反应：

22、2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸的裂解相关的发酵生产：细菌酒精发酵优点：代谢速率高，产物转化率高，菌体生成少，代 谢副产物少，发酵温度较高，不必定期供氧。缺点：较易染菌；细菌对乙醇耐受力低酵母菌（在酵母菌（在pH3.5-4.5时）的乙醇发酵时）的乙醇发酵 脱羧酶脱羧酶 脱氢酶脱氢酶丙酮酸丙酮酸 乙醛乙醛 乙醇乙醇 通过通过EMP途径途径产生乙醇，总反应式为：产生乙醇，总反应式为： C6H12O6+2ADP+2Pi 2C2H5OH+2CO2+2ATP 细菌的乙醇发酵细菌的乙醇发酵通过通过ED途径途径产生乙醇，总反应如下：产生乙醇，总反应如下： 葡萄糖葡萄糖+ADP+Pi 2乙醇乙醇+2CO2+

23、ATP细菌的乙醇发酵细菌的乙醇发酵通过通过HMS途径途径产生乙醇、乳酸等，总反应如下：产生乙醇、乳酸等，总反应如下： 葡萄糖葡萄糖+ADP+Pi 乳酸乳酸+乙醇乙醇+CO2+ATP葡萄糖三条降解途径在不同微生物中的分布葡萄糖三条降解途径在不同微生物中的分布菌名菌名EMP（%）HMP（%）ED（%）酿酒酵母酿酒酵母8812产朊假丝酵母产朊假丝酵母66811934灰色链霉菌灰色链霉菌973产黄青霉产黄青霉7723大肠杆菌大肠杆菌7228铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌2971嗜糖假单胞菌嗜糖假单胞菌100枯草杆菌枯草杆菌7426氧化葡萄糖杆菌氧化葡萄糖杆菌100真养产碱菌真养产碱菌100运动发酵单胞菌运动

24、发酵单胞菌100藤黄八叠球菌藤黄八叠球菌7030由表可见，在微生物细胞中，有的同时存在多条由表可见，在微生物细胞中，有的同时存在多条途径来降解葡萄糖，有的只有一种。在某一具体途径来降解葡萄糖，有的只有一种。在某一具体条件下，拥有多条途径的某种微生物究竟经何种条件下，拥有多条途径的某种微生物究竟经何种途径代谢，对发酵产物影响很大。途径代谢，对发酵产物影响很大。木糖代谢途径木糖代谢途径传统的用于发酵生产的微生物（传统的用于发酵生产的微生物（酿酒酵母和运动发酵单胞菌等酿酒酵母和运动发酵单胞菌等）能）能很好地利用葡萄糖，且乙醇发酵率高，乙醇耐受力强，但均缺少利很好地利用葡萄糖，且乙醇发酵率高，乙醇耐受

25、力强，但均缺少利用木糖的能力。因此近些年来，人们尝试利用代谢工程手段改造酵用木糖的能力。因此近些年来，人们尝试利用代谢工程手段改造酵母菌或者细菌来发酵木糖等五碳糖生产酒精。母菌或者细菌来发酵木糖等五碳糖生产酒精。代谢工程（代谢工程（metabolic engineeringmetabolic engineering）代谢工程是基因工程的一个重要分支，利用重组DNA为主的技术，操纵酶的转移和细胞调节功能，定向改造基因组结构，重新设计细胞的代谢系统，达到生物体内改变代谢流，扩展代谢途径和构建新的代谢途径的目的。代谢工程具体思路代谢工程具体思路1、改变代谢流1）加速速度限制反应2）改变分支代谢途径流

26、向3）构建代谢旁路4）改变能量代谢途径2、扩展代谢途径和构建新的途径1）延伸代谢途径2）构建新的合成途径ACBDEFGHJIK中心代谢途径收敛途径发散途径指向中心代谢途径，并以指向中心代谢途径，并以中心代谢途径中间化合物中心代谢途径中间化合物为接口的途径。为接口的途径。代谢网络组成的途径类型代谢网络组成的途径类型以中心代谢途径的中间以中心代谢途径的中间化合物为起点，并由中化合物为起点，并由中心代谢途径向周围分散心代谢途径向周围分散的途径的途径代谢分析中研究方法代谢分析中研究方法图 细胞在不同水平上对基因改变和环境变化的响应，对于不同水平上各自的高通量研究方法为分析细胞的代谢提供了大量的信息S.

27、Cerevisiae对不同氮源的吸收利用的途径与机理对不同氮源的吸收利用的途径与机理 谷氨酸和谷氨酰胺在氮代谢中起着重要的作用，氨、谷氨酸和谷氨酰胺之间的相互转化被称为氮的中间代谢途径 (CNR)，如图所示。 S.cerevisiae在脯氨酸作为氮源时转录水平的调控机制在脯氨酸作为氮源时转录水平的调控机制 吸收转运脯氨酸的两个酶吸收转运脯氨酸的两个酶: : Gap1p，一般氨基酸的一般氨基酸的通用的通透酶通用的通透酶 Put4p，脯氨酸脯氨酸特异性的通透酶特异性的通透酶S.CerevisiaeS.Cerevisiae以葡萄糖、甘油和乙酸为碳源条件下以葡萄糖、甘油和乙酸为碳源条件下中间代谢途径关

28、键酶活分析中间代谢途径关键酶活分析6-磷酸葡萄糖脱氢酶（磷酸戊糖途径）磷酸烯醇式丙酮羧酸化激酶（糖异生途径）丙酮酸激酶（糖酵解途径）异柠檬酸脱氢酶；-酮戊二酸脱氢酶 （三羧酸循环）总结总结 以葡萄糖、甘油和乙酸为碳源，连续培养S.Cerevisiae，测量了在不同培养条件下中间代谢途径一些具有代表性的酶活性。初步分析了为了适应不同的环境胞内代谢体系的一些主要酶活性的响应，为代谢通量的分析提供一些基础信息，实验结果也将结合到代谢通量的研究中。S.Cerevisiae在不同发酵阶段的菌体生长、底物在不同发酵阶段的菌体生长、底物消耗及部分代谢产物的积累与消耗情况消耗及部分代谢产物的积累与消耗情况S.

29、CerevisiaeS.Cerevisiae在发酵不同阶段和以乳酸为碳源下的在发酵不同阶段和以乳酸为碳源下的蛋白质组解析和酶活性分析蛋白质组解析和酶活性分析图中第一个样图中第一个样品取在葡萄糖品取在葡萄糖作碳源的对数作碳源的对数期，第二个样期，第二个样品取在发酵后品取在发酵后期，细胞正在期，细胞正在消耗乙醇，第消耗乙醇，第三个样品为乳三个样品为乳酸作为碳源酸作为碳源总结总结 通过酶活性检测，在S.Cerevisiae利用葡萄糖为碳源的对数生长期和葡萄糖消耗尽的后期，以及利用乳酸为碳源的情况下，研究了中间代谢途径中的一些关键的酶，分析了胞内的代谢为了适应不同的环境而作的系统而精细的调控，中间代谢

30、途径中一些途径得到强化和激活，一些途径被削弱或阻断，从而维持了细胞在不同环境下生长的需要以及能量的平衡。 展望展望 燃料乙醇是未来世界能源的主流，将改变世界能源结构。中国应该利用纤维素乙醇作为主要的生物能源，加快以纤维素乙醇为核心的综合技术开发，尽早实现其产业化发展的目标。 对于50年后生物质生物炼制技术的发展状况，可以做出这样的展望：届时将实现淀粉、糖类、纤维素等生物质原料的全部利用，产品多元化，形成生物质炼制巨型行业，部分替代不可再生的一次性矿产资源，初步实现以碳水化合物为基础的经济与社会可持续发展。可以预见，在不远的未来，纤维素乙醇生产将会取得更大突破。主要参考文献主要参考文献1 Wu Y J, Ma H, Liu W W. Enhan