黄连解毒汤对MPTP所致帕金森病小鼠的防治作用

1、黄连解毒汤对MPTP所致帕金森病小鼠的防治作用 作者：段冷昕 李瑞芳 金瑾 王文嘉 张杨 周秋丽【摘要】 目的 观察黄连解毒汤（HJD）对1甲基4苯基1,2,3,6四氢吡啶（MPTP）所致C57BL小鼠帕金森病模型的防治作用。方法 C57BL小鼠腹腔注射MPTP 30 mg·kg-1·d-1，连续5 d，诱导小鼠帕金森病模型。观察HJD对小鼠肢体运动（爬杆、悬挂、游泳）功能的影响；HPLCECD法检测小鼠脑纹状体内多巴胺（DA）及其代谢产物二羟基苯乙酸（DOPAC）、高香草酸（HVA）的含量；分光光度计法测定小鼠脑组织超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱苷肽过氧化物酶(GSHPx

2、)及丙二醛(MDA)的含量。结果 与对照组比较，模型组小鼠肢体运动功能明显降低（P<0.05，P<0.01），纹状体内DA、DOPAC及HVA的含量明显减少(P<0.01)，脑组织中SOD及GSHPx酶活力明显降低，但MDA的含量却显著升高(P<0.01)；HJD对小鼠运动功能的减退和脑神经组织的代谢异常有不同程度的调节和改善作用。结论 黄连解毒汤对MPTP所致帕金森病小鼠有一定的防治作用。 【关键词】 黄连解毒汤；帕金森病；MPTP；多巴胺 【Abstract】 Objective To observe the protective e

3、ffect of Huanglian Jiedu decoction (HJD) on mice with Parkinsons disease (PD) induced by 1methyl4phenyl1, 2, 3, 6tetrahydropyridine (MPTP). Methods 45 male C57BL mice were evenly randomized into 3 groups: control, MPTP model (subcutaneous injection 30 mg·kg-1·d-1 for 5 days) and HDJ+MPTP g

4、roups (17.55 g crude drug/kg). HJD was given for 16 days by2intragastric administration and subcutaneous injection 30 mg/kg for 5 days at the eighth day. Performance of animals in the pole, traction and swimming test were observed at 4 days after the last injection. Levels of dopamine (DA) and its m

5、etabolites 3,4dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) and homovanillic acid (HVA) in the striatum of animals were measured by highperformance liquid chromatography with an electrochemical detector (HPLCECD). The spectrophotometer method was used to examine the levels of superoxide dismutase (SOD), glutat

6、hione peroxidase (GSHPx ) and malondialdehyde (MDA). Results Comparing with the control group, the model group had obvious effect on the behavioral performance of the animals, and the decreased score in the pole, traction and swimming test（P0.05 or P0.01）and the striatal levels of DA, DOPAC and HVA

7、were significantly lower（P0.01）, and the activity of SOD and GSHPx were improved obviously in the brain, but the content of MDA was significantly higher（P0.05 or P0.01）. Comparing with the model group, HDJ+MPTP group had significantly improved in the different indexes（P0.05 or P0.01）. Conclusions Th

8、e preventive medication of HJD shows a protective effect on C57BL mice with PD induced by MPTP. 【Key words】 Huanglian Jiedu decoction; Parkinsons disease; 1methyl4phenyl1, 2, 3, 6tetrahydropyridine; Dopamine黄连解毒汤(HJD)源于唐代的外台秘要，由黄连、黄柏、黄芩、栀子4味中药组成，是中医清热解毒的经典方剂。上世纪90年代日本临床曾用HJD治疗帕金森病(PD)，使其临床症状有所改善，他们发

9、现对那些接受L多巴治疗，临床症状一直无改善倾向的患者，服用HJD后精神症状改善较明显1。以往研究已证明，HJD具有明显的抗氧化作用，对MPP+诱导的离体PC12细胞损伤具有明显保护作用2。本研究旨在整体水平探讨HJD对MPTP诱导的C57/BL小鼠帕金森模型的防治及其可能的作用机制，以期为HJD临床上治疗PD提供理论和实验依据。1 材料与方法1.1 动物C57/BL小鼠，雄性，体重(25±2）g，45只，购于吉林大学基础医学院动物部，动物合格证号：(吉)20030001，清洁级饲养。1.2 药物黄连、黄芩、黄柏、栀子均购于长春市药材公司， 符合中国药典2005年版有关各项规定，经吉林

10、大学药学院生药教研室王广树教授鉴定为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch干燥根茎， 唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi 干燥根， 芸香科植物黄檗Phellodendron amurenseRupr除去栓皮的干燥树皮，茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis 干燥成熟果实。HJD：黄连、黄柏、黄芩、栀子（3223）分别用10倍、8倍、6倍水分别煎煮60、40、20 min，合并煎液后浓缩至1.67 g（生药量）/ml，4冰箱保存备用。1.3 试剂MPTP、DA、DOPAC（二羟基苯乙酸）和HVA（高香草酸）均

11、为Sigma公司产品；其他试剂为国产分析级或化学纯试剂；甲醇为色谱级。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）检测试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。1.4 仪器台式高速低温离心机（德国Eppendorf公司）；高效液相色谱仪（美国Waters 60000A恒流泵，Waters U6K进样器，Waters 464电化学检测器）。1.5 分组与给药小鼠随机分为3组，即对照组、模型组和HJD组，每组15只。置于室温(19±2)，24 h昼夜循环光照条件下生活，自由饮水、取食。动物于实验前适应实验室环境1 w。从实验的第1天，HLD组每天灌胃黄连解毒汤

12、17.55 g（生药量）/kg，与此同时对照组和模型组动物每天灌胃同体积生理盐水，连续16 d；于灌胃HJD第8天，HJD和MPTP组小鼠腹腔注射MPTP (30 mg/kg) ，连续注射5 d3。造模后继续给药，至第16天灌胃给药后处死动物，检测各项指标。1.6 小鼠肢体运动功能检测各组小鼠于实验前4 d每日进行2次爬杆、悬挂、游泳行为训练。在给药期间至处死动物前，每天于给药后或注射MPTP后2 h，分别进行爬杆、悬挂和游泳的行为检测，以观察其肢体运动协调情况4，5。具体方法及评分标准：（1）爬杆实验。制作一个直径1 cm，长50 cm并且顶端固定有一个直径为1.5 cm的软木小球的杆，缠上

13、纱布以增加摩擦，将杆竖直放置，然后将小鼠头朝上放置于软木球下方20 cm处，记录小鼠爬至小球再折返回杆底的时间；（2）悬挂实验。小鼠用两前爪悬挂在一水平金属线上（直径1 mm，距地面30 cm），记录悬挂时间及动作。两后爪都抓金属线3分，一后爪抓2分，两后爪都不抓1分，30 s内跌落0分，依动作迟缓酌情加减0.5分；（3）游泳实验。将受试小鼠放入一个20 cm×30 cm×20 cm规格的水箱中,水温为3235。在受试时间（10 min）内能连续不断游泳者计3分，大部分时间游泳偶尔漂浮者计2.5分，漂浮占50%以上者计2分，偶尔游泳者计1.5分，偶尔用后肢游动并漂浮在一边者

14、计1分。在实验的第16天，处死动物之前，进行最后一次功能测试，其统计数据作为本实验的肢体运动功能检测结果。1.7 纹状体内DA及其代谢产物含量测定采用HPLCECD法。具体操作如下：将小鼠脱臼处死，在冰上取出全脑，小心剥离左右纹状体。在纹状体组织内加入0.4 mol/L高氯酸（每100 ml含L半胱氨酸5 mg）0.4 ml制备匀浆，置高速冷冻离心机离心（12 000 r/min，4，15 min），取上清备用。采用HPLCECD法检测小鼠脑纹状体DA及其代谢产物DOPAC和HVA。色谱条件：waters C18反相色谱柱；流动相为100 mmol/L Na2HPO4，0.5 mmol/L E

15、DTA，1 mmol/L辛烷基磺酸钠，11%甲醇；流速1 ml/min，电化学检测器工作压0.7 V，测定温度37；每次进样量50 l。标准品配制：各标准品溶于流动相中，浓度为0.1 g/L（储液），用时稀释至10 mg/L（工作液）。标准品在浓度和峰面积间要有良好的线性关系，r0.99。1.8 小鼠脑组织SOD、MDA、GSHPx含量测定将取出纹状体的小鼠脑组织称重，匀浆，具体操作及测定按试剂盒说明书进行。1.9 统计学分析用SPSS10.0统计软件分析，结果以x±s表示，组间采用t检验分析，多组间比较用单因素方差分析。2 结 果2.1 HJD对小鼠肢体运动功能的影响与对照组小鼠比

16、较，模型组小鼠出现不同程度地肢体运动协调能力降低，评分普遍下降（P<0.05，P<0.01）。具体表现为前、后肢的抓力减弱、肌肉僵直、攀爬能力差、出现运动平衡障碍等。给予HJD小鼠的肢体协调能力，特别是前、后肢之间的协调能力明显改善，与模型组小鼠相比，检测的各项指标均有不同程度的好转(P<0.05，P<0.01)，见表1。表1 HJD对小鼠肢体运动功能的影响（略）2.2 HJD对小鼠脑纹状体内DA及其代谢产物的影响模型组小鼠纹状体内DA及其代谢产物DOPAC和HVA含量均较对照组小鼠明显减少（P<0.05）；给予HJD，小鼠

17、纹状体内DA及其DOPAC和HVA含量明显升高(P<0.05，P<0.01)，见表2。表2 HJD对小鼠纹状体内DA、DOPAC及HVA含量的影响（略）2.3 HJD对小鼠脑组织中SOD、GSHPx及MDA的影响与对照组小鼠相比，模型组小鼠脑组织中SOD及GSHPx活力显著降低（P<0.01），而MDA的含量明显升高（P<0.01）。给予HJD可以逆转MPTP所致小鼠脑组织的氧化损伤，表现为脑组织SOD及GSHPx活力均有所升高（P<0.01），MDA的含量明显降低（P<0.01），见表3。表3 HJD对小鼠脑

18、组织中SOD、MDA及GSHPx的影响（略）3 讨 论 研究表明，PD患者处于氧应激状态，脑黑质中固醇类过氧化物比正常人增加10倍，血中多形核白细胞产生自由基增多，血清MDA增加；黑质纹状体中GSH水平显著降低，脑中水解酶、GSHPx的活性明显降低6，7。预先给予抗氧化剂或含巯基的化合物可不同程度地改善6OHDA、MPTP引起的帕金森动物行为和生化指标的改变。 用MPTP诱导的鼠模型是目前国内外公认的最好的PD动物模型之一，已被广泛用于该病发病机制和治疗等研究中8。MPTP穿过血脑屏障后被单胺氧化酶B(MAOB)转化为相应的二氢吡啶(MPDP+)，MPDP+随之氧化为MPP+。MPP+可抑制酪

19、氨酸羟化酶(TH)的活性而减少DA的合成，通过抑制活性复合体(NADH脱氢酶)，增加自由基的生成及氧化应激，最终导致DA能神经元的凋亡9。C57/BL小鼠对MPTP最为敏感，本研究选择此种小鼠成功地复制了PD模型。 本实验初步证实，HJD预防给药对MPTP诱导的PD动物模型有较明显的神经元保护作用。通过对黑质DA能神经元细胞损伤的保护，在一定程度上抑制纹状体内DA及其代谢产物HVA、DOPAC水平的降低，使MPTP致PD小鼠的肢体运动功能得到部分改善。HJD具有很强地清除自由基和抗氧化活性的报道10提示，HJD保护脑神经元的作用与其提高脑内抗氧化物质水平，减少自由基损伤密切相关。关于HJD保护

20、受损黑质DA能神经元的其他作用机制有待进一步研究。【参考文献】 1 王 昀，何雅珍，张琦岩.黄连解毒汤的日本研究现状J.中医药信息，1994；1（1）:38.2 金 瑾，段冷昕，周秋丽，等.黄连解毒汤对MPP诱导的PC12细胞损伤的保护作用J.中国药学杂志，2008；43（5）：344.3 Freyaldenhoven TE,Ali SF，Hart RW.MPTP and MPP+ induced effects on body temperature exhibit age and strain dependence in miceJ.Brain Res，1995;688(12):16170.4 Haobam R，Sindhu KM，Chandra G,et al.Swimtest as a function of motor impairment in MPTP model of Parkinsons disease：a comparative study in two mouse strainsJ.Behav Brain Res，2005;163 (2):159.5 Mori A，Ohashi S，Nakai M,et al.Neural me