小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数

1、鼠 脾 脏 细 胞 原 代 培 养 及 观 察 计 数【实验目的】1. 学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2, 掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3. 学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4, 学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；【实验原理】A. 细胞培养细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使 离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组 织分散成单个细胞

2、开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1:2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是 细胞的培养代数。高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培 养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可

3、以人为地诱导和改变 细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。细胞培养的意义：具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、 细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结 果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。培养细胞的条件有水的质量、无菌环境，

4、最适温度、渗透压、气体条件、最适PK营养条件和少口开至四守OB. 细胞死活鉴定细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许 物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、 苯胺黑、赤薛红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙嚏或漠化乙嚏等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述 染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生 死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性

5、已遭破坏，故与高渗透压 溶液接触时不产生质壁分离。 代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内 的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失 去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细 胞的生死状态。亚甲

6、基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能 力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色； 死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态， 故呈现蓝色或淡蓝色。C. 血球计数板的使用血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网（如图3）。每个方格网共分 9大格，其中间的一大格（又称为计数室）常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；

7、另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成（图4）。每个大方格边长为 1mm则每一大方格的面积为1mm,每个小方格的面积为1 / 400mn2i,盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为，所以每个计数室（大方格）的体积为，每个小方格的体积为l /4000mm。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格（或中方格）中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。图1血球计数板的构造（a、平面图；b、侧面图）:=11«1 111it1111it H 1I

8、I1«-«1 11 1II11|1 1i 1 11图2血球计数板网格的分区和分格【实验用品】1. 材料小鼠脾脏;2. 试剂PBS缓冲溶液、培养液、台盼蓝、伊红；3. 器材解剖剪、解剖镶、眼科剪、眼科镶、培养皿、纱布块、吸管、橡皮头、烧杯、移液枪、注射器、 针头、Eppendorf管（上述器具彻底清洗、消毒、烤干、包装好）；倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板等。【操作步骤】A. 原代脾细胞培养1）取材：取小白鼠一只，采用断头法处死，清水洗净小白鼠并浸于75%酒精中灭菌3min ,取出转入超净工作台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔，取出脾脏，去除周围的脂肪组织，镶起

9、脾脏用PBS液自上而下冲洗1-2次，转入无菌玻璃培养皿中，待用。2）分离脾细胞：用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用L形针头注射器在皿内吸取PBS液，然后将其沿脾脏长轴方向注射入脾内，用针尖在脾脏上扎眼，并用L形针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲洗脾脏并吹散挂出的脾细胞，稍微倾斜并静置1-2min ,吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf管，以3000转/分离心1-2min。3）培养脾细胞：从超净工作台中区塑料培养皿一个，用“枪（ 1ml） ”加入细胞培养液 2ml,并在皿上做记 号，待用。取上述离心后的 Eppendorf管，在超净工作台

10、内打开弃去上清液，用 "枪（200卬l ） 吸取塑料皿中的培养液400ul ,加入弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ul脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37 C二氧化碳培养箱中培养。B. 细胞死活鉴定台盼蓝法：1）试剂配制：用生理盐水配置 台盼蓝染液，备用。2）细胞悬液制备：将生长有贴壁型细胞的培养瓶（皿）中的培养液倒入干净试管中，向培养瓶（皿）中加入%胰蛋白酶/%EDTA混合消化液1-2ml ,静置3-5min ,待见到细胞变圆，彼此不连接为止，弃去混 合消化液并将上述试管中的培养液倒回培养瓶中，用滴管轻轻吹打细胞，制成细胞悬

11、液。3）染色制片：取细胞悬液放于干净的试管中，加 1-2滴（约）染液，混合，2min后制成临时装片，镜检。4）染色结果：死细胞染成蓝色，活细胞不着色。C. 用血球计数板进行细胞计数 1） 染色计数：取上述步骤二所制备细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约）染液，混合 2-5min ,滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，使悬液自然充满计数板小室（注意:10?物镜下计数四个大格内的细胞数,不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加；在普通光镜 压线者数上不数下，数左不数右）。2） 根据染色结果计算活细胞率：依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计

12、算细胞存活率：【实验结果】A.细胞原代培养结果：图2台盼蓝染色后死活细胞所呈状态（10 X 10）B.在倒置显微镜下，原代培养的细胞定婿麒聚集于培养液中，多呈 圆形，形状规则，细胞质均匀。培养液 由卞瑚 味过浦输椎地成意色 C-细舰帽其魅s撵透过性而未被染用血I砒数板计数，分别计算了红 细胞计数区域的五个小方格，计数 结果如下：项目12345细胞总数1114112018活细胞数13243每个中格平均细胞总数为活细胞率=活细胞数/细胞总数x100%=13/74 X 100%=%平均活细胞数为细胞密度=大方格中细胞数X 10000 X稀释倍数=X 16X 10000 X 10=x 107/ml【注

13、意事项】1、 小鼠一定要将血放干净并且在酒精中充分浸泡3min,防止杂菌污染无菌操作台；2、为近一步保证无菌操作台的无菌环境，可在玻璃挡板口点一酒精灯，一般操作都在酒精灯火 焰旁操作；3、取小鼠脾时注意保持其完整，注入缓冲液要慢而准且适量，不要撑破脾脏，保证细胞分散游 离出来，也不能使游离的细胞中含有块儿状物质；4、 培养液PH为，其中加有酚猷，正常状况细胞生长过程代谢物使PH下降，培养液的颜色改 变呈黄色，因此可通过培养液颜色变化初步判断细胞生长状况；5、生长状况良好的细胞膜和核完整，细胞质透明，而细胞质出现较多颗粒状或空泡证明细胞衰 老。除游离期和衰退期外细胞一般贴壁生长。游离期细胞一般圆

14、形，折光率高，而衰退期细 胞皱缩，透明度下降，立体感很差，较易区分；6、倒置显微镜将物镜与载物台间的空间解放，可以允许连同培养皿一同观察。 【思考题】1. 抑制肿瘤细胞增殖药物的筛选方法1) MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3- (4, 5) -dimethylthiahiazo (-z-y1 ) -3 , 5-di-phenytetrazoliumromide , MTT嵯哇蓝为基础。 MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作 用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活

15、细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失， 不能将MTT还原)。还原生成的 formazan结晶可在含50%勺N, N-二甲基甲酰胺和 20%勺十二甲基磺 酸钠(pH )的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度 OD直，以反映出活细胞数目。也可以用DMSOB溶解。MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日 光灯来避光，觉得这样比较好。步骤：a) 接种细胞用含10%|台小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000 - 10000个细胞接种到 96孔板，每孔体积200ul。b) 培养细胞同一般培养条件，培养 3 - 5天(可根据试验

16、目的和要求决定培养时间)。c) 呈色培养3-5天后，每孔加 MTT溶液(5mg/ml用PBS配)20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心 吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO,振荡10分钟，使结晶物充分融解。d) 比色选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值 为纵坐标绘制细胞生长曲线。2) NCI所用的体外化疗药物筛选法简单地说，NCI的体外化疗药物筛选系统由60种不同的人体肿瘤细胞株组成，测定每个受试化合物在一定浓度范围抑止各肿瘤细胞的生长的能力或细胞毒性程度。以常规采用的筛选试验为例，在实

17、验开始前一天，所有 60种肿瘤细胞株细胞先接种在96孔细胞培养板上，然后将受试化合物10倍梯度稀释，一般最高浓度采用10-4mol。每种化合物试验 5种不同浓度。样品加入细胞悬液后培育48小时。此后用细胞染色法测定细胞的生长曲线，用 sulforhodamine 染色，再测定吸光度用以估计 细胞数目。根据比色结果画出60条剂量一反应曲线，然后计算出50%生长抑止浓度 (GI50) ,100%生长抑止浓度(TGI)以及50%细胞死亡浓度(LC50)。再将各细胞系的 GI50、TGI和LC50汇总画 出均数图，从此图可以大致看出该化合物对不同的肿瘤细胞株的抑止能力。然后用计算机进行计算、 模拟、比

18、较，评价受试化合物的特征是否与某一类已知化疗药物类似，从而推测可能存在的抗癌机制。据统计，NCI到目前为止已筛选了近460000种化合物。用 NCI体外化疗药物筛选系统得出的数据也可用于指导将来对主要化合物的改造，使化合物的药理及毒理性质更为理想。3 )以分子生物学为基础的化疗药物筛选方法近年来，对肿瘤的分子生物学研究取得了很大的进展，这给化疗药物的发展提供了一些新的目标。现在已有许多采用X射线衍射、蛋白结晶、基因配对等方法来推断及设计抗癌药物。这些方法往往开拓了一些全新的途径，但其缺点是这些化合物不一定对肿瘤细胞有选择性。另外，这些化合 物是否能进入肿瘤细胞也是一大问题。因此，任何采用非细胞

19、系统筛选的化合物都必须经过细胞系统以及合适的动物模型的检定才能进入临床试验。4 ）经典的化疗药物筛选模型？1985 年NCI建立体外细胞筛选系统。在此之前，NCI抗癌药物的筛选方法主要采用体内肿瘤模型来进行。将白血病细胞株L1210及P388植入免疫缺陷鼠体内，待肿瘤长成后再给予不同剂量的筛选化合物，然后观察所试化合物是否能抑制肿瘤细胞的生长，甚至使肿瘤细胞死亡、消失。然后 再作计算分析，得出最小抑制剂量、中位抑制剂量、LC50等指标；以这些指标作为衡量受试化合物的抗癌作用强度。这一方法的优点是得到的药物可穿过细胞膜以及某些生理屏障，缺点是所得到的药物仅对快速分裂的肿瘤（如白血病、淋巴瘤）疗效

20、较好，而对实体瘤的治疗远不尽人意。针对这一问 题，NCI在1985年对抗癌药物的筛选过程作了如下重大改变：利用以肿瘤种类为指导的体外细胞 筛选法取代体内筛选法；利用实体瘤细胞株取代白血病细胞株；用相对小量的原始材料用于初筛；重新强调利用生物实验指导天然物中具抗癌活性成分的筛选。体内实验的免疫缺陷鼠肿瘤模型现已不常用于药物的初筛，而常规用于对初筛所得的先导药物 作进一步测试以观察评估化合物对不同的实体瘤的治疗作用。2. 诱导肿瘤细胞发生凋亡的药物筛选方法：用米托芯醍、顺钳、羟基喜树碱、高三尖杉酯碱诱导 Jurkat细胞凋亡，并通过 Annexin V /PI法检测细胞凋亡及细胞死亡比例，分析不同作用时间以及不同药物浓度对Jurkat细胞凋亡的影响。材料和方法材料Jurkat细胞系由本实验室保存。顺钳（ CDDP为齐鲁制药有限公司产品、羟基喜树碱（ HCPT 为黄石飞云